多指標綜合評分結(jié)合響應面法優(yōu)選脂康顆粒提取工藝

許曉莉，李彩霞，吳瑞楓

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院，福建 福州 350000）

脂康顆粒由決明子、山楂、桑椹、枸杞子、紅花5味中藥材經(jīng)粉碎、過篩、制粒、干燥、整粒而制得，具有滋陰清肝、活血通絡(luò)功效，主要用于肝腎陰虛挾瘀之高脂血癥，癥見頭暈或脹或痛、耳鳴眼花、腰膝酸軟、手足心熱、胸悶、口干、大便干結(jié)［1］?，F(xiàn)代藥理學研究表明，決明子、山楂和桑椹合用有明顯的調(diào)血脂作用［2］。藥食同源的決明子中橙黃決明素、大黃酚及大黃素能顯著增強LDLR基因轉(zhuǎn)錄水平，為決明子中有效調(diào)脂成分［3－4］。山楂調(diào)脂、降血壓、抗心律不齊、增加冠脈血流量的有效成分主要為黃酮類化合物，其主要成分為蘆丁及槲皮素［5－6］。桑椹來源于?？浦参锷orus albaL.的干燥果穗，黃酮類、有機酸和生物堿為其主要化學成分，而黃酮類成分綠原酸及蘆丁具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗氧化作用［7－8］。現(xiàn)行質(zhì)量標準中脂康顆粒僅以大黃酚作為定量指標，含量測定的相關(guān)報道較少，尚未見同時測定該藥品橙黃決明素、綠原酸、蘆丁、槲皮素、大黃酚、大黃素6種成分含量的相關(guān)報道。Box－Behnken Design（BBD）響應面法是采用多元二次回歸方程擬合各因素與響應值間的函數(shù)關(guān)系，尋求試驗優(yōu)化的方法，在中藥成分提取領(lǐng)域應用廣泛，與正交試驗相比，不僅可考察各因素間的關(guān)聯(lián)，還可通過圖形顯示其內(nèi)在函數(shù)關(guān)系［9－11］。本研究中建立了同時測定脂康顆粒中橙黃決明素、綠原酸、蘆丁、槲皮素、大黃酚、大黃素6種成分含量的高效液相色譜法，并以上述成分的綜合評分為考察指標，采用BBD響應面法優(yōu)選脂康顆粒中6種有效成分的提取工藝?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695 Waters型高效液相色譜儀（美國Waters公司），配有2695Alliance四元梯度泵、2695 Alliance自動進樣器、Empower3色譜工作站、2998二極管陣列檢測器；ABS－135S型電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司，精度為0.01 mg）；KQ－250DBG型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；明澈－D24UV型純水/超純水一體化系統(tǒng)（德國默克密理博公司）。

1.2 試藥

橙黃決明素對照品（批號為111900－201605，含量以98.3%計），綠原酸對照品（批號為110753－202018，含量以96.1%計），蘆丁對照品（批號為100080－201811，含量以91.7%計），槲皮素對照品（批號為100081－201610，含量以99.1%計），大黃酚對照品（批號為110796－201922，含量以99.4%計），大黃素對照品（批號為110756－201913，含量以96.0%計），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，購自美國默克公司，其他試劑均為分析純，水為純化水；脂康顆粒（天大藥業(yè)＜珠海＞有限公司，批號分別為190918，191112，020409，規(guī)格為每袋8 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件［12－14］與系統(tǒng)適用性試驗

色 譜 柱：Waters XTERRA MS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）－0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～16 min時25%A，16～40 min時25%A→45%A，40～50 min時45%A→65%A，50～55 min時65%A→25%A，55～60 min時25%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：0～16 min時327 nm（檢測綠原酸），16～24 min時370 nm（檢測蘆丁），24～32 min時280 nm（檢測槲皮素），32～60 min時286 nm（檢測橙黃決明素、大黃酚、大黃素）；柱溫：30℃；進樣量：10μL。分別精密吸取供試品溶液、混合對照品溶液、陰性對照品溶液各適量，按此色譜條件進樣測定，結(jié)果各成分理論板數(shù)均大于4 000，與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子為0.96～1.14。色譜圖見圖1。

1.綠原酸 2.蘆丁 3.槲皮素 4.橙黃決明素 5.大黃素 6.大黃酚A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖1 高效液相色譜圖1.chlorogenic acid 2.rutin 3.quercetin 4.aurantio－obtusin 5.emodin 6.chrysophanolA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.1.2 溶液制備

取橙黃決明素、綠原酸、蘆丁、槲皮素、大黃酚、大黃素對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含上述成分3.017 0，0.608 7，1.554 0，1.328 0，0.228 1，0.239 6 mg的溶液，搖勻，濾過（0.45μm），取續(xù)濾液，室溫避光保存，即得混合對照品溶液。取樣品（批號為191112）裝量差異項下的內(nèi)容物，研細，混勻，取粉末1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，室溫超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）45 min，放冷至室溫，再用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。按脂康顆粒標準工藝方法，分別制備不含決明子、桑椹、山楂的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.1.2項下混合對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以對照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）見表1。

表1 6種有效成分的線性關(guān)系考察、定量限與檢測限測定結(jié)果Tab.1 Results of linear relation test，LOD and LOQ of six effective components

定量限與檢測限確定：精密量取2.1.2項下混合對照品溶液，用甲醇倍比稀釋，按2.1.1項下色譜條件進樣分析。取峰面積信噪比（S/N）為10∶1時的混合對照品溶液質(zhì)量濃度為定量限，取峰面積S/N為3∶1時的混合對照品溶液質(zhì)量濃度為檢測限。結(jié)果見表1。

精密度試驗：取2.1.2項下混合對照品溶液適量，按2.1.1項下色譜條件分別于0，24，48，72 h時連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果橙黃決明素、綠原酸、蘆丁、槲皮素、大黃酚、大黃素峰面積的RSD分別為0.29%，0.43%，0.51%，0.38%，0.47%，0.62%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.1.2項下供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件分別于0，3，6，9，15，20，24 h時進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果橙黃決明素、綠原酸、蘆丁、槲皮素、大黃酚、大黃素峰面積的RSD分別為0.69%，1.03%，0.57%，0.78%，0.92%，0.84%（n＝7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取樣品（批號為191112）適量，依法平行制備供試品溶液6份，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算6種成分的含量及其RSD值。結(jié)果橙黃決明素、綠原酸、蘆丁、槲皮素、大黃酚、大黃素的平均含量分別為12.570 0，3.452 0，8.214 0，5.673 0，0.265 1，0.300 7 mg/g，RSD分 別0.86%，0.95%，1.03%，0.92%，1.05%，0.88%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為191112）6份，混勻，研細，每份0.5 g，精密稱定，按已知含量的100%加入橙黃決明素、綠原酸、蘆丁、槲皮素、大黃酚、大黃素混合對照品溶液（質(zhì)量濃度分別為1.207 0，0.357 4，0.821 6，0.579 6，0.028 5，0.031 3μg/mL）5.00 mL，依法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，計算各成分加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 脂康顆粒中6種成分的加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of the recovery test of six components in Zhikang Granules（n＝6）

2.1.4 樣品含量測定及綜合評分計算

取混合對照品溶液及供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算含量。設(shè)滿分為100分，按脂康顆粒君臣佐使組方原則，分別賦予各藥材指標成分權(quán)重系數(shù)，橙黃決明素為30，蘆丁和槲皮素權(quán)重系數(shù)均為20，綠原酸、大黃酚和大黃素權(quán)重系數(shù)均為10。參考文獻［15］方法，對6種成分含量（%）進行標準化處理，求綜合評分。綜合評分（%）＝橙黃決明素×30＋綠原酸×10＋蘆丁×20＋槲皮素×20＋大黃酚×10＋大黃素×10。

2.2 單因素試驗

甲醇體積分數(shù)考察：取樣品內(nèi)容物適量，混勻，取粉末2.0 g，平行6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入50%，60%，70%，80%，90%，100%甲醇溶液各50 mL，室溫超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）45 min，考察提取液綜合評分，結(jié)果見圖2 A?？芍状俭w積分數(shù)不超過80%時，綜合評分呈上升趨勢，隨后呈下降趨勢。故選取80%甲醇為提取溶劑。

液料比考察：取樣品內(nèi)容物適量，混勻，取粉末2.0 g，平行5份，置具塞錐形瓶中，分別加入20，30，40，50，60 mL 80%甲醇，室溫超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）45 min，考察提取液綜合評分，結(jié)果見圖2 B。可知，當液料比從20∶1（V/m）增至60∶1（V/m）時綜合評分呈快速上升趨勢，50∶1（V/m）時達最高值，超過50∶1（V/m）后變化不明顯。故選擇液料比為50∶1（V/m）。

A.甲醇體積分數(shù) B.液料比 C.提取時間圖2 單因素試驗考察結(jié)果A.Volume fraction of methanol B.Liquid－solid ratio C.Extraction timeFig.2 Results of the single factor test

提取時間考察：取樣品內(nèi)容物適量，混勻，取粉末2.0 g，平行5份，置具塞錐形瓶中，按液料比50∶1（V/m）加入80%甲醇，分別于室溫超聲處理（功率為500 W，頻率為40 kHz）25，35，45，55，65 min時，考察提取液綜合評分，結(jié)果見圖2 C?？芍崛r間為25～45 min時綜合評分處于快速上升階段，時間再延長，綜合評分無明顯變化?？紤]到工作效率和成本，暫設(shè)置提取時間為45 min。

2.3 BBD響應面法優(yōu)化工藝

回歸模型建立及方差分析：采用Design－Expert 8.0.5統(tǒng)計軟件，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，根據(jù)BBD響應面試驗設(shè)計原理，以對評價指標影響較大的提取時間（A）、甲醇體積分數(shù)（B）、液料比（C）為考察因素，以橙黃決明素、綠原酸、蘆丁、槲皮素、大黃酚、大黃素含量綜合評價指標為響應值，設(shè)計三因素三水平17個試驗點的響應面分析模型，并對二次多項方程進行顯著性分析。因素水平設(shè)計見表3，試驗結(jié)果見表4。由軟件得到綜合評分（Y）為因變量對自變量提取時間（因素A）、甲醇體積分數(shù)（因素B）、液料比（因素C）的二次多項回歸方程，Y＝85.41＋5.92A＋5.23B＋6.31C－2.07AB－2.19AC－2.58BC－0.03A2－5.77B2－10.01C2。方 差分析數(shù)據(jù)見表5?？芍?，F(xiàn)＝6.75，P＝0.020 1＜0.05，表明回歸模型顯著；失擬項P＝0.061 9＞0.05，失擬度不顯著，表明模型選擇合適，可用于工藝的分析和預測。模型的一次項A和B呈顯著影響，因素C呈極顯著影響，影響順序為C＞A＞B；交互項影響不顯著，二次項A2影響不顯著，二次項B2對模型有顯著影響，二次項C2項對模型影響極顯著。

表3 因素水平表Tab.3 Factors and levels

表4 響應面試驗設(shè)計方案及結(jié)果Tab.4 Design scheme and results of the response surface test

表5 二元多項回歸擬合BBD響應面試驗設(shè)計方差分析結(jié)果Tab.5 Results of ANOVA of BBD response surface test design fitted by binary multiple regression

響應面圖分析：采用Design－Expert 8.0.5統(tǒng)計軟件，得到二次回歸方程的3D響應面圖（見圖3）?？梢?，提取時間、甲醇體積分數(shù)及液料比對綜合評分均有不同程度影響，其中因素C（提取時間）的影響最大。

最佳提取工藝確定及驗證試驗：利用Design－Expert 8.0.5統(tǒng)計軟件，以6種成分的綜合評分Y值的最大值為指標，通過對回歸模型極值的求解分析，得到最佳提取工藝為甲醇體積分數(shù)85%，液料比52∶1（V/m），提取時間45 min，此時綜合評分為92.31%。取3批樣品，按擬訂優(yōu)化提取條件試驗，得平均綜合評分為90.58%，測得值與預測值相對誤差為0.94%（n＝3），表明回歸模型預測性良好，工藝可行、合理。

A.甲醇體積分數(shù)－提取時間 B.甲醇體積分數(shù)－液料比 C.提取時間－液料比圖3 三因素交互作用對綜合評分的響應面圖A.Volume fraction of methanol－extraction time B.Volume fraction of methanol－solid ratio C.Extraction time－liquid－solid ratioFig.3 Response surface diagram of three factor interaction on comprehensive score

3 討論

BBD響應面法廣泛應用于中藥提取工藝優(yōu)選，具有直觀、方便、科學等優(yōu)點，能解決正交試驗難以解決的非線性數(shù)學問題，是集統(tǒng)計學和數(shù)學于一體的科學模型。本研究中考察了乙醇體積分數(shù)、液料比和提取時間三因素相互作用對綜合評分的影響，利用中心效應面法設(shè)計試驗方案，采用Design－Expert 8.0.5統(tǒng)計學軟件對結(jié)果進行擬合，求得二次多項方程，并進行了方差分析，推導出脂康顆粒中最佳提取工藝參數(shù)。同時，建立了同時測定脂康顆粒中槲皮素、橙黃決明素、綠原酸、蘆丁、大黃酚和大黃素含量的高效液相色譜法，并通過驗證試驗考察方法準確性，模型預測性良好，方法簡單實用，具有較好的參考價值。