UPLC-MS/MS法測(cè)定五倍子洗劑中5種指標(biāo)性成分的含量

張 群，陳 瑜，支曉偉，須秋萍，楊英楠，趙 亮，李盛建 （. 上海市寶山區(qū)老年護(hù)理院，上海 00435；. 上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院，上海 0908）

五倍子洗劑是我院依據(jù)中醫(yī)藥理論為基礎(chǔ)應(yīng)用于臨床多年的協(xié)定方，主要用于復(fù)雜性肛瘺術(shù)后治療，能促進(jìn)術(shù)后創(chuàng)面的愈合，減輕術(shù)后水腫、疼痛、排尿障礙等不良反應(yīng)[1-3]。五倍子洗劑由五倍子、槲寄生、黃柏、紫花地丁、大黃等八味中藥經(jīng)水煎提取制備而成?，F(xiàn)有的五倍子洗劑是采用傳統(tǒng)方法水煎劑直接處理得到，雖然臨床應(yīng)用多年，但是其基礎(chǔ)研究薄弱，缺乏制劑相應(yīng)規(guī)范化的提取標(biāo)準(zhǔn)，且存在質(zhì)量差異，制劑穩(wěn)定性受到很大影響。隨著中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)步和發(fā)展，有必要對(duì)其質(zhì)量控制進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。根據(jù)2020年版《中國(guó)藥典》中藥材“含量測(cè)定”項(xiàng)中規(guī)定，五倍子、槲寄生、黃柏、紫花地丁和大黃的指標(biāo)性成分分別為沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸[4]。目前已有研究對(duì)五倍子、黃柏、大黃等單味藥材中的指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定[5-7]，未有對(duì)五倍子洗劑指標(biāo)性成分含量同時(shí)測(cè)定的報(bào)道。

質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有專屬性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確度好的特點(diǎn)，已經(jīng)越來越多的用于中藥中多種成分的檢測(cè)[8-10]。本研究基于2020年版《中國(guó)藥典》，建立了一種穩(wěn)定、快速的，同時(shí)測(cè)定五倍子洗劑中沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸含量的UPLC-MS/MS法，為五倍子洗劑的質(zhì)量控制提供一種可靠的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

6 460 Triple Quad LC/MS高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司），十萬分之一電子天平（力辰科技）。

1.2 試藥

五倍子（批號(hào)：201101，產(chǎn)地：安徽），白礬（批號(hào)：200501，產(chǎn)地：安徽），荊芥（批號(hào)：200102，產(chǎn)地：江蘇），紫花地?。ㄅ?hào)：200902，產(chǎn)地：山東），黃柏（批號(hào)：200601，產(chǎn)地：四川），大黃（批號(hào)：200601，產(chǎn)地：甘肅），槲寄生（批號(hào)：200501，產(chǎn)地：遼寧），炒五靈脂（批號(hào)：200401，產(chǎn)地：陜西）；沒食子酸（批號(hào)：5946，純度≥98.0%）、紫丁香苷（批號(hào)：7568，純度≥98.0%）、黃柏堿（批號(hào)：7682，純度≥98.0%）、秦皮乙素（批號(hào)：127，純度≥98.0%）、大黃酸（批號(hào)：5946，純度≥98.0%）、苦杏仁苷（批號(hào)：5930，純度≥98.0%）均購(gòu)自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純（SIGMA公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×150 mm, 2.7 μm），流動(dòng)相：A相為0.2%甲酸溶液，B相為乙腈；線性梯度洗脫，洗脫程序如下：0～1.5 min，10 % B；1.5～7 min，10%～90% B：流速：0.3 ml/min，平衡時(shí)間：3 min，柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：2 μl。

2.2 質(zhì)譜條件

采用AJS ESI動(dòng)態(tài)多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(DMRM)進(jìn)行二級(jí)掃描；離子源參數(shù)設(shè)置：干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化器壓力40 psi（1 psi=6 894.7 Pa）；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V；5種成分及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間見表1，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1，典型MRM色譜圖見圖2。

圖1 5種指標(biāo)性成分及內(nèi)標(biāo)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖2 5種指標(biāo)性成分及內(nèi)標(biāo)的典型色譜圖

表1 5種指標(biāo)性成分以及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液

精密稱取沒食子酸10.25 mg、紫丁香苷10.31 mg、黃柏堿10.53 mg、秦皮乙素10.14 mg、大黃酸10.54 mg、苦杏仁10.43 mg置于10 ml容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻備用，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液，濃度分別為沒食子酸1.025 mg/ml，大黃酸1.031 mg/ml，紫丁香苷1.053 mg/ml，秦皮乙素1.014 mg/ml，黃柏堿1.054 mg/ml，苦杏仁1.043 mg/ml。精密移取單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，置于10 ml容量瓶中混合，加甲醇定容至刻度，得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密移取混合儲(chǔ)備液適當(dāng)體積于10 ml容量瓶中，用甲醇依次逐級(jí)梯度稀釋。配成混合對(duì)照品系列溶液，濃度分別為沒食子酸：0.153 8～15.38 μg/ml，大黃酸: 1.054～105.4 ng/ml，紫丁香苷：10.31～1 031 ng/ml，秦皮乙素：50.00～5 000 ng/ml，黃柏堿：5.265～526.5.5 ng/ml，苦杏仁:1 043 ng/ml，上述溶液保存于4 ℃冰箱待用。

2.3.2 供試品溶液

按五倍子洗劑配方，分別稱取五倍子、白礬、荊芥、紫花地丁、黃柏、大黃、槲寄生、炒五靈脂15 g，加入2 500 ml純凈水，浸泡2 h，煎煮30 min，過濾，取適量濾液稀釋100倍，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液即得五倍子洗劑供試品溶液；取供試品溶液900 μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μl，混勻，待分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系考察

分別精密移取“2.3” 項(xiàng)中配置好的混合對(duì)照品系列溶液 900 μl，加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μl，混勻，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下UPLC-MS/MS條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，計(jì)算各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。以添加濃度(X)為橫坐標(biāo)，各成分與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。以信噪比大于10(S/N＞10)作為定量下限，S/N＞3作為檢測(cè)下限。檢測(cè)限、定量限、回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2，結(jié)果表明5種成分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 五倍子中5種指標(biāo)性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線 (n=5)

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品高（沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的濃度分別為3.076、206.2、105.3、1.014、21.08 ng/ml）、中（濃度分別為1 538、103.1、52.65、507.0、10.54 ng/ml）、低（濃度分別為769.0、51.55、26.32、253.5、5.270 ng/ml）三個(gè)濃度，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理樣品，并按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下UPLC-MS/MS條件進(jìn)樣分析，連續(xù)3 d測(cè)定，記錄各成分色譜峰面積，計(jì)算濃度，考察日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸在低濃度下的日內(nèi)精密度RSD值分別為1.92%、0.28%、1.09%、1.97%、1.46% (n=3)，日間精密度RSD值分別為5.57%、1.82%，4.18%、4.08%、2.08%；中濃度下的日內(nèi)精密度RSD值分別為1.55%、0.96%、1.09%、1.97%、0.87% (n=3)，日間精密度RSD值分別為1.61%、2.39%，1.33%、2.35%、4.68%；高濃度下的日內(nèi)精密度RSD值分別為1.08%、1.77%、1.20%、1.48%、1.31% (n=3)，日間精密度RSD值分別為1.41%、3.11%，1.50%、2.96%、1.89%、7.20%；結(jié)果顯示該方法精密度符合方法學(xué)要求，儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密取同一批五倍子洗劑溶液，共6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”和“2.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄各成分色譜峰面積，計(jì)算濃度，沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的濃度分別為1 968、99.87、66.23、892.4、10.09 ng/ml，RSD分別為1.69%、4.11%、3.49%、4.09%、2.5%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、3、7、12、24 h測(cè)定供試品溶液中沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的含量，考察供試品常溫放置穩(wěn)定性，沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的RSD分別為2.58%、4.26%、4.86%、1.24%、5.26%，結(jié)果表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率

精密量取五倍子供試品溶液，加入適量對(duì)照品溶液，平行操作6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備溶液，測(cè)定沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的含量，計(jì)算加樣回收率（見表3），結(jié)果表明該方法回收率良好。

表3 五倍子洗劑加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

精密量取3批次五倍子供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備溶液，測(cè)定沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的含量，結(jié)果如表4所示。

表4 五倍子洗劑中5種指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 稀釋倍數(shù)的確定

五倍子洗劑中不同成分的含量差異較大，不同稀釋倍數(shù)處理后進(jìn)樣，部分成分超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，如沒食子酸含量過高，大黃酸含量過低，進(jìn)一步擴(kuò)大線性范圍會(huì)導(dǎo)致線性方程r系數(shù)不達(dá)標(biāo)。因此，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)稀釋倍數(shù)進(jìn)行了探索，五倍子洗劑稀釋100倍處理后，6種成分的濃度均在線性范圍內(nèi)。

3.2 質(zhì)譜條件的選擇

前期采用高效液相色譜法檢測(cè)五倍子洗劑中多個(gè)化學(xué)成分，但五倍子洗劑的各成分復(fù)雜，待測(cè)成分相互干擾，因此在色譜柱中分離時(shí)間較長(zhǎng)，難以獲得分離效果較好的色譜系統(tǒng)；同時(shí)各成分的含量差異較大，含量偏低的成分如大黃酸、紫丁香苷，其響應(yīng)信號(hào)較低，不能滿足定量要求。故本實(shí)驗(yàn)采用高選擇性和高靈敏度的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定五倍子洗劑中5種指標(biāo)性成分的含量。由于各成分在結(jié)構(gòu)方面存在差異，為了兼顧各成分測(cè)定以使其具有較高的靈敏度，本實(shí)驗(yàn)采用正負(fù)離子切換模式同時(shí)定量5種成分，并優(yōu)化碎片電壓和碰撞能量，紫丁香苷和黃柏堿在正離子掃描模式下響應(yīng)更強(qiáng)，而沒食子酸、秦皮乙素、大黃酸在負(fù)離子掃描模式下的響應(yīng)值更高。

3.3 色譜條件的選擇

由于五倍子洗劑中沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的極性差異較大，預(yù)試驗(yàn)考察了不同色譜柱Waters HSS T3（2.10 mm×100 mm,2.5 μm）、BEH Amide（2.1 mm×100 mm, 1.7 μm）、Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×150 mm,2.7 μm）和不同流動(dòng)相體系（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液）對(duì)成分響應(yīng)和峰形的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱與乙腈-0.2%甲酸流動(dòng)相組合后，沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸的響應(yīng)強(qiáng)度和峰形較好，并在7 min內(nèi)完成分析。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定沒食子酸、紫丁香苷、黃柏堿、秦皮乙素、大黃酸6 種指標(biāo)性成分UPLCMS/MS方法，該方法樣品前處理簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，分析時(shí)間短，對(duì)五倍子洗劑的質(zhì)量控制研究具有重要意義，為五倍子洗劑的進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。