鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

高 宇，凌 琳，邢信昊，趙 亮，王欣榮，王 彥 （. 解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心，北京 00700；. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 00；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院軍特藥研究中心，上海 00；. 上海市寶山區(qū)羅店醫(yī)院藥劑科，上海 0908）

暈動(dòng)病又稱暈動(dòng)癥、運(yùn)動(dòng)病，主要包括暈車、暈船、暈機(jī)（又稱空暈?。1-2]。暈動(dòng)癥在海軍部隊(duì)較為常見，主要發(fā)生于對(duì)航海環(huán)境尚未習(xí)服的官兵，遇到海況較差和乘坐較小船只時(shí)，暈動(dòng)癥的發(fā)生率會(huì)顯著升高[3-4]。目前臨床上用于治療暈動(dòng)病的藥物非常有限，常用藥物主要包括抗膽堿能藥物（如東莨菪堿）和抗組胺藥物（如苯海拉明、茶苯海明）。但是兩者都有明顯的中樞神經(jīng)抑制作用，會(huì)造成服藥者出現(xiàn)困倦、嗜睡等副作用[1,5]?？Х纫蚴怯行У闹袠信d奮藥，課題組將鹽酸苯海拉明與咖啡因組成復(fù)方，在發(fā)揮鹽酸苯海拉明抗暈動(dòng)病作用的同時(shí)，利用咖啡因降低其中樞抑制導(dǎo)致的不良反應(yīng)。前期課題組開展了鹽酸苯海拉明咖啡因防治暈動(dòng)病的藥效學(xué)研究，沿用了鹽酸苯海拉明用于暈動(dòng)病防治的常用劑量，即25 mg/人次（70 kg），探索咖啡因的合用劑量，發(fā)現(xiàn)鹽酸苯海拉明與咖啡因以1:2.4的比例組成復(fù)方效果最佳，既可以保持抗暈動(dòng)病的效果，又可以克服鹽酸苯海拉明單用導(dǎo)致的嗜睡不良反應(yīng)。

既往的報(bào)道多用HPLC法、毛細(xì)管電泳法測(cè)定制劑中鹽酸苯海拉明的含量；對(duì)生物樣品中鹽酸苯海拉明、咖啡因的測(cè)定方法也有研究報(bào)道，樣品處理過程大都采用液-液萃取或固相萃取的方法，操作較為煩瑣。本研究建立了UPLC-MS/MS方法測(cè)定大鼠血漿中鹽酸苯海拉明與咖啡因的濃度，進(jìn)一步考察了鹽酸苯海拉明咖啡因復(fù)方在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)，為該復(fù)方制劑的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290 UPLC 超高效液相色譜（安捷倫，美國(guó)）；Agilent 6 470 Triple Quad 三重四極桿質(zhì)譜（安捷倫，美國(guó)），配備AJS-ESI 噴射流電噴霧離子源、MassHunter 分析工作站；Fresco 21 低溫離心機(jī)（賽默飛，美國(guó)）；SECURA125-1CN 型十萬分之一電子天平（賽多利斯，德國(guó)）；Arium?mini 超純水機(jī)（賽多利斯，德國(guó)）。

1.2 試藥

對(duì)照品鹽酸苯海拉明（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100066-200807，純度99.9%）；內(nèi)標(biāo)鹽酸苯海拉明-D6（加拿大TRC，批號(hào)8-CNN-25-2，純度98%）；對(duì)照品咖啡因（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)171215-200608，純度＞98%）；內(nèi)標(biāo)咖啡因-D9（美國(guó)MTAR，批號(hào)90342，純度97%）；甲酸為色譜純（麥克林，中國(guó)）；甲醇、乙腈為質(zhì)譜純（霍尼韋爾，美國(guó)）；水為超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD 大鼠，6～8周齡[上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006。合格證編號(hào)：20180006019969]。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱為ACE 3 C18-PFP（3.0 mm×150 mm，3 μm）；流動(dòng)相系統(tǒng)采用0.1%甲酸水溶液-乙腈（62∶38，V/V），等度洗脫，流速0.4 ml/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μl，分析時(shí)間5 min。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用AJS-ESI離子源，正離子模式，離子源參數(shù)設(shè)置：干燥氣溫度350℃；干燥氣流速11 L/min；霧化器壓力40 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V。多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的參數(shù)設(shè)置：鹽酸苯海拉明256.2→167.0（m/z），碎片電壓75 V，碰撞能量10 eV；鹽酸苯海拉明-D6（IS）262.0→167.0（m/z），碎片電壓75 V，碰撞能量10 eV。鹽酸苯海拉明和氘代內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間均為3.73 min?？Х纫?195.0→138.0（m/z），碎片電壓80 V，碰撞能量20 eV；內(nèi)標(biāo)咖啡因-D9（IS）204.0→116.2（m/z），碎片電壓80 V，碰撞能量40 eV?？Х纫蚝碗鷥?nèi)標(biāo)的保留時(shí)間均為2.35 min。

2.1.3 溶液的配制

（1）鹽酸苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)溶液

取鹽酸苯海拉明對(duì)照品適量，精密稱定，置10 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為1.0 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液；取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇按比例逐級(jí)稀釋，配成濃度分別為20～20 000 ng/ml的系列對(duì)照品溶液，置4 ℃冰箱保存，備用。

（2）鹽酸苯海拉明-D6內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液

取鹽酸苯海拉明-D6對(duì)照品適量，精密稱定，置10 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為1.0 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液；取上述儲(chǔ)備液用甲醇稀釋為50 ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

（3）咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液

取咖啡因?qū)φ掌愤m量，精密稱定，置10 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為1.0 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液；取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇按比例逐級(jí)稀釋，配成濃度范圍分別為300～3×106ng/ml的系列對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

（4）咖啡因D-9內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液

取咖啡因-D9對(duì)照品適量，精密稱定，置10 ml量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，配成濃度為1.0 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液；取上述儲(chǔ)備液用甲醇稀釋為2×103ng/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，置于4 ℃冰箱保存，備用。

2.1.4 血漿樣品前處理方法

取50 μl血漿樣品，依次加入50 μl的鹽酸苯海拉明-D6內(nèi)標(biāo)溶液（50 ng/ml）、200 μl的100%乙腈，渦旋1 min，于5 ℃下以12 000 r/min高速離心5 min，取上清液100 μl進(jìn)樣，用于測(cè)定鹽酸苯海拉明的含量。

取50 μl血漿樣品，依次加入100 μl的咖啡因-D9內(nèi)標(biāo)溶液（2 000 ng/ml）、700 μl的100%乙腈，渦旋1 min，于5 ℃下以12 000 r/min高速離心5 min，取上清液100 μl進(jìn)樣，用于測(cè)定咖啡因的含量。

2.2 方法驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 選擇性

取空白大鼠血漿樣品、空白大鼠血漿加鹽酸苯海拉明與咖啡因的模擬血漿樣品（鹽酸苯海拉明濃度為100 ng/ml，咖啡因濃度為5×103ng/ml）、定量下限模擬血漿樣品（鹽酸苯海拉明濃度為1 ng/ml，咖啡因濃度為15 ng/ml），以及大鼠給藥后血漿樣品，分別按“2.1.4”項(xiàng)下血漿樣品前處理方法操作，進(jìn)樣，獲得樣品的色譜圖。結(jié)果空白血漿中的內(nèi)源性成分不干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)出峰，選擇性良好，見圖1。

圖1 血漿中鹽酸苯海拉明、咖啡因及內(nèi)標(biāo)典型色譜圖

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與范圍

取空白大鼠血漿，精密加入不同濃度的對(duì)照品溶液，制得濃度為1、5、10、50、100、200、500、1×103ng/ml的鹽酸苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)曲線模擬樣品和濃度為15、50、200、1×103、5×103、2×104、1×105、1.5×105ng/ml的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線模擬樣品。以血漿中待測(cè)物濃度 (X)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值 (Y)為縱坐標(biāo)，用1/X權(quán)重進(jìn)行回歸計(jì)算，求得鹽酸苯海拉明回歸方程：Y=0.022 662X-0.006 273，r=0.999 6，線性范圍為1～1×103ng/ml；咖 啡 因 回 歸 方 程：Y=0.004 275X-0.017 169，r=0.999 9，線性范圍為15～1.5×105ng/ml。鹽酸苯海拉明與咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，權(quán)重因子在整個(gè)方法驗(yàn)證中保持一致。

2.2.3 精密度和準(zhǔn)確度

分別制備低、中、高3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品，其中鹽酸苯海拉明濃度為2.5、250、800 ng/ml，咖啡因濃度為30、5×104、1.2×105ng/ml，每個(gè)濃度平行操作5份，連續(xù)分析3 d，計(jì)算批內(nèi)、批間的精密度（RSD）及準(zhǔn)確度（RE），結(jié)果見表1。

2.2.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

以6個(gè)不同來源的空白大鼠血漿作為基質(zhì)，分別制備低、中、高3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品，其中鹽酸苯海拉明濃度為2.5、250、800 ng/ml，咖啡因濃度為30、5×104、1.2×105ng/ml，按“2.1.4”項(xiàng)下進(jìn)行處理并進(jìn)樣分析，記錄鹽酸苯海拉明和咖啡因峰面積A和A1；將6個(gè)不同來源的空白大鼠血漿提取后，加入待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)溶液，使其最終濃度分別與低、中、高濃度質(zhì)控樣品的進(jìn)樣濃度一致，進(jìn)樣分析，記錄峰面積B和B1；同時(shí)配制待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤?，濃度分別與低、中、高濃度質(zhì)控樣品的進(jìn)樣濃度一致，進(jìn)樣分析，記錄峰面積C和C1。以A/B 的值計(jì)算提取回收率，B/C 的值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表1。

表1 鹽酸苯海拉明、咖啡因精密度和準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 穩(wěn)定性

首先通過新鮮配制鹽酸苯海拉明、咖啡因和內(nèi)標(biāo)的儲(chǔ)備液1.0 mg/ml，考察對(duì)照品儲(chǔ)備液于4 ℃下放置30 d的穩(wěn)定性；再以空白大鼠血漿作為基質(zhì)，分別制備低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，其中鹽酸苯海拉明濃度為2.5、250、800 ng/ml，咖啡因濃度為30、5×104、1.2×105ng/ml，考察血漿樣品室溫放置穩(wěn)定性（3 h）、自動(dòng)進(jìn)樣器穩(wěn)定性（4 ℃放置24 h），凍融穩(wěn)定性（反復(fù)凍融3次）、長(zhǎng)期穩(wěn)定性（-80 ℃放置30 d），結(jié)果見表2。

表2 鹽酸苯海拉明-咖啡因復(fù)方穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.3 藥動(dòng)學(xué)研究

2.3.1 樣品采集與測(cè)定

SD大鼠24只，隨機(jī)分成4組，每組6只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h不禁水，給藥前稱重并記錄。灌胃組給予鹽酸苯海拉明10 mg/kg、咖啡因24 mg/kg（低劑量組）；鹽酸苯海拉明20 mg/kg、咖啡因48 mg/kg（中劑量組）；鹽酸苯海拉明30 mg/kg、咖啡因72 mg/kg（高劑量組），收集給藥前及給藥后0.08、0.17、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8和12 h的血樣各0.15 ml；靜脈注射組給予鹽酸苯海拉明2 mg/kg、咖啡因4.8 mg/kg，收集給藥前及給藥后0.05、0.13、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、8和12 h的血樣各0.15 ml。所有血樣均放置30 min后，于3 000 r/min 離心5 min，分離得血漿，于-80 ℃保存待測(cè)。

2.3.2 大鼠血漿樣本濃度測(cè)定結(jié)果

對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中采集的大鼠血漿樣本，按“2.1.4”項(xiàng)下進(jìn)行處理并進(jìn)樣分析，將測(cè)得的血漿樣品中鹽酸苯海拉明和咖啡因的濃度與相應(yīng)的采血點(diǎn)時(shí)間繪制藥時(shí)曲線，見圖2。

圖2 鹽酸苯海拉明-咖啡因復(fù)方給藥后大鼠體內(nèi)血藥濃度

2.3.3 鹽酸苯海拉明和咖啡因的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

將對(duì)應(yīng)采血時(shí)間測(cè)得的藥物濃度采用非房室模型，計(jì)算主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，見表3。結(jié)果顯示，鹽酸苯海拉明在10～30 mg/kg和咖啡因24～72 mg/kg 3種不同劑量大鼠灌胃給藥后體內(nèi)呈線性藥動(dòng)學(xué)特征，鹽酸苯海拉明及咖啡因給藥劑量相關(guān)系數(shù)分別為0.974 3及0.995 3。

表3 鹽酸苯海拉明-咖啡因復(fù)方主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（xˉ±s）

同時(shí)觀察到雌性和雄性大鼠在藥動(dòng)學(xué)參數(shù)上差異較大，通過t檢驗(yàn)計(jì)算兩組數(shù)據(jù)的P值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。高劑量給藥時(shí)，咖啡因在雄性大鼠體內(nèi)的半衰期（t1/2）及達(dá)峰時(shí)間（tmax）明顯小于雌性；3個(gè)劑量給藥組中雌性大鼠體內(nèi)鹽酸苯海拉明及咖啡因的達(dá)峰濃度（cmax）及藥時(shí)曲線下面積（AUC）均大于雄性。

圖3 灌胃組雌雄性大鼠體內(nèi)鹽酸苯海拉明-咖啡因藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的差異比較

3 討論

鹽酸苯海拉明是經(jīng)典的抗暈動(dòng)病藥物，咖啡因是常用的中樞興奮藥，然而對(duì)其開展的藥動(dòng)學(xué)研究較少，文獻(xiàn)報(bào)道多為HPLC法、毛細(xì)管電泳法測(cè)定制劑中的含量[6-8]；亦有生物樣品中鹽酸苯海拉明、咖啡因的測(cè)定方法報(bào)道，但樣品處理過程大都需要采用液-液萃取或固相萃取的方法[9-14]，較為煩瑣。本文采用UPLC-MS/MS法定量血漿樣品中的鹽酸苯海拉明、咖啡因，采用乙腈作為蛋白沉淀劑，方法簡(jiǎn)便易操作。復(fù)方中鹽酸苯海拉明咖啡因的處方組成為鹽酸苯海拉明25 mg和咖啡因60 mg，兩藥在大鼠體內(nèi)的血藥濃度相差較大，鹽酸苯海拉明的血藥濃度很低，咖啡因的血藥濃度相對(duì)很高，兩藥同時(shí)檢測(cè)的難度很大。經(jīng)過比較樣品前處理的方法，最終確定將二者分開處理，按不同比例進(jìn)行蛋白沉淀，最終使鹽酸苯海拉明達(dá)到1 ng/ml較低的檢測(cè)下限，而咖啡因達(dá)到15～1.5×105ng/ml較大的線性范圍，該方法能準(zhǔn)確定量大鼠血漿樣本中鹽酸苯海拉明和咖啡因的濃度，是一次成功的方法學(xué)探索。

藥動(dòng)學(xué)研究顯示，鹽酸苯海拉明和咖啡因的達(dá)峰時(shí)間均在0.5 h左右、半衰期均在1 h左右，快速起效，鹽酸苯海拉明的抗暈動(dòng)作用和咖啡因的中樞興奮作用可能同時(shí)發(fā)揮，可滿足抗暈動(dòng)病的同時(shí)克服嗜睡不良反應(yīng)的需求。兩藥的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)在雌雄大鼠間具有明顯差異，可能與激素對(duì)代謝的影響有關(guān)。人們?cè)谌粘Ｉ钪幸矔?huì)遇到服用鹽酸苯海拉明的同時(shí)飲用茶或者咖啡的情況，茶或者咖啡因這樣的中樞興奮飲料中含有咖啡因，本研究考察了咖啡因與鹽酸苯海拉明同服的藥動(dòng)學(xué)特點(diǎn)，對(duì)日常生活中藥物的合理應(yīng)用也有借鑒意義。