高效液相色譜法同時檢測降糖中成藥中的鹽酸羅格列酮和鹽酸吡格列酮

劉舜慧，吳麗萍

（漳州衛(wèi)生職業(yè)學院藥學系，福建 漳州 363000）

少數(shù)生產(chǎn)企業(yè)片面追求藥物療效、期望獲取更多利益，不按標準規(guī)定處方生產(chǎn)，在中成藥及保健品中非法添加化學藥物的事件屢有發(fā)生。據(jù)文獻報道，被檢測出存在非法添加的藥物有補腎壯陽藥［1-4］、降壓藥［5-8］、減肥藥［9-15］、降糖藥［16-20］、安神藥［21-23］、抗風濕藥［24-25］、抗癲癇藥［26］、止咳平喘藥［27-28］等。

糖尿病是一種病情較復雜且難治愈的慢性疾病。傳統(tǒng)中藥在降糖藥物中具有重要地位，其具有調(diào)理和治療的雙重功效且不良反應小等特點，但其治療周期相對較長，起效較慢。因此，不法分子利用患者對中藥的信賴，同時為了滿足他們用藥后急于見效的心理，在降糖中成藥、保健品中非法添加化學藥物。降糖化學藥物主要有磺酰脲類、雙胍類、噻唑烷二酮類等，對于前兩者的檢測技術(shù)日趨成熟，但檢測降糖中成藥中噻唑烷二酮類未見報道，本實驗以鹽酸羅格列酮和鹽酸吡格列酮作為篩查目標，建立了HPLC檢測方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent-1200高效液相色譜儀。

1.2 試藥鹽酸羅格列酮（含量為91.3%批號：100673-200401）、鹽酸吡格列酮（批號：100634-200401）均由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇、乙酸銨為色譜純；水為超純水；降糖中成藥的試驗樣品有降糖寧膠囊、參芪降糖膠囊、糖脈康顆粒、玉泉丸、消渴寧片、消渴降糖片。

2 實驗方法

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 對照品溶液的制備精密稱取常溫減壓干燥12 h的鹽酸羅格列酮和鹽酸吡格列酮對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得含鹽酸羅格列酮18μg·mL-1、鹽酸吡格列酮80μg·mL-1的混合溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備若供試品為膠囊劑，傾出膠囊內(nèi)容物碾成細粉，稱取約0.1 g；若供試品為顆粒劑、片劑或丸劑，碾成細粉后稱取約0.5 g，置25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min后，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，濾液用0.45μm濾膜濾過即得。

2.1.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-乙酸銨（0.01 mol·L-1）溶液（62∶38）為流動相，流速：1 mL·min-1；柱溫：30℃；進樣量：10μL；二極管陣列檢測器，檢測波長為246 nm及200～400 nm。此色譜條件下，鹽酸羅格列酮和鹽酸吡格列酮2種對照成分分離良好。色譜圖見圖1；光譜圖見圖2、圖3。

圖1 對照品色譜圖

圖2 鹽酸羅格列酮光譜圖

圖3 鹽酸吡格列酮光譜圖

2.1.4 標準曲線的制備配制對照品混合溶液，含鹽酸羅格列酮0.46 mg·mL-1、鹽酸吡格列酮2.05 mg·mL-1。精密吸取上述溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1、2、5 mL置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以峰面積Y對進樣量X（μg）進行線性分析，得回歸方程。結(jié)果見表1、圖4、圖5。

圖4 鹽酸羅格列酮線性關(guān)系圖

圖5 鹽酸吡格列酮線性關(guān)系圖

表1 對照品溶液的線性結(jié)果

2.1.5 精密度試驗取對照品混合溶液重復連續(xù)進樣6次，每次10μL，測得鹽酸羅格列酮各次峰面積RSD的平均值為0.22%，鹽酸吡格列酮的RSD為0.20%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗取對照品混合溶液，放置0、4、6、8、10、12、24 h測定峰面積，鹽酸羅格列酮和鹽酸吡格列酮的RSD分別為0.19%和0.18%，見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.1.7 各種劑型的加樣回收率取已確定不含鹽酸羅格列酮和鹽酸吡格列酮的4種不同劑型（膠囊劑、顆粒劑、丸劑、片劑）的樣品作為背景，每種劑型6份，每份加入對照品混合溶液（鹽酸羅格列酮和鹽酸吡格列酮的濃度分別為0.451 9 mg·mL-1、2.050 0 mg·mL-1）1 mL，按“供試品溶液的制備”項下處理后，進樣分析，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各種劑型的加樣回收率/n＝6

2.1.8 檢測限取對照品混合溶液，以不同比例稀釋，在2.1.3項下的高效液相色譜條件下測定，取4～10 min范圍的基線進行噪聲檢測，結(jié)果見表4。

表4 HPLC檢測限

2.2 樣品測定分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，按2.1.3項下的高效液相色譜條件測定，同時記錄二極管陣列紫外光譜。經(jīng)過HPLC分析，所得供試品溶液不含有鹽酸羅格列酮和鹽酸吡格列酮。樣品色譜圖見圖6。

圖6 供試樣品色譜圖

3 小結(jié)

3.1同時檢測降糖中成藥中的鹽酸羅格列酮和鹽酸吡格列酮還未見報道，在高效液相色譜方法的摸索過程中，當流動相中甲醇的比例＞70%時，二者完全疊加在一起，色譜圖中只出現(xiàn)一個色譜峰。逐漸降低甲醇的比例，二者的分離度加大。確定的液相色譜流動相，除了確保二者的分離度，還能跟樣品中的雜質(zhì)峰分離。

3.2鹽酸羅格列酮和鹽酸吡格列酮的分子結(jié)構(gòu)中均含有N原子，因此，可向流動相中加入乙酸銨改性劑，且乙酸銨的濃度大小對二者的峰形和出峰時間的影響不大，只需采用0.01 mol·L-1乙酸銨即可保證二者色譜峰形對稱，不拖尾。

3.3從光電二極管陣列檢測器所得到的190～400 nm這一范圍內(nèi)2種對照品的光譜圖來看，鹽酸羅格列酮的λmax為246 nm，鹽酸吡格列酮的λmax為267 nm。在246 nm和267 nm下，鹽酸吡格列酮的吸收值差異不大，因此可選擇246 nm作為這2種化學藥物同時檢測的波長。