發(fā)酵過程中青梅酵素的活性成分及其抗氧化性能

姜峰，晏子玉，樂治平，2

(1.南昌大學化學學院，江西 南昌330031;2.貴州荔波億隆之家農業(yè)科技有限公司，貴州 荔波 558400)

自由基和活性氧是造成人體氧化損傷的主要原因，致使脂質過氧化以及細胞中的蛋白質變性，由此加速細胞衰老并誘發(fā)一系列常見的慢性疾病[1]。隨著年齡增長和外界環(huán)境的影響，人體內防御系統(tǒng)不足以應對自由基和活性氧造成的氧化應激，因此需要攝入一定的抗氧化劑來維持體內的氧化還原平衡，這就引起了人們對天然抗氧化性食品的極大關注[2]。

青梅為薔薇科喬木植物梅的一種，含有豐富的維生素、多種有機酸以及黃酮和多酚等營養(yǎng)物質。有研究[3]發(fā)現，青梅中含有的多酚類物質使青梅具有良好的抗氧化能力，且二者間存在顯著的線性相關性。國外學者的研究[4]也表明，多酚類物質是梅子具有抗氧化性的主要貢獻者，除此之外，類黃酮對自由基的清除作用也起了顯著作用。

食用酵素主要以新鮮水果和蔬菜為原料進行發(fā)酵，通過酵母菌等微生物自身的新陳代謝活動而制得，在很大程度上保留了果蔬中的營養(yǎng)物質及活性成分，具有較好的抗氧化作用。劉濤等[5]以桑葚為原料發(fā)酵制得的酵素具有明顯的抗氧化能力。董銀卯等[6]研究了火龍果酵素的抗氧化性能，結果表明火龍果酵素對超氧陰離子自由基和DPPH自由基具有很強的清除作用。

本文以新鮮青梅為原料，經發(fā)酵制得酵素，研究了青梅酵素在發(fā)酵過程中黃酮和總酚類物質成分的變化及其與抗氧化活性的相關性，為制取青梅酵素產品提供一定的理論基礎和數據支持。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

新鮮青梅，購于大理市下關鎮(zhèn)向陽村；白砂糖，市售；蕓香葉苷，分析對照品；沒食子酸，分析對照品；福林酚試劑，生物技術級；2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH)；2,2-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)；三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)；鄰苯三酚、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、濃鹽酸、過硫酸鉀、磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、氯化鐵、三氯乙酸、無水乙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設備

HC-3541高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；UV-5500PC紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南予華儀器有限公司)；雷磁PHS-25型pH計。

1.3 實驗方法

1.3.1 青梅酵素的制備

取新鮮青梅490 g，清洗干凈晾干后按1:1的比例加入適量白砂糖，放于已殺菌處理的密封罐中室溫避光發(fā)酵。發(fā)酵過程中每隔6 d取發(fā)酵酵素液，4 000 r·min-1離心10 min后放于冰箱保存，用于測定。

1.3.2 黃酮質量濃度的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定[7]。取適量發(fā)酵不同時間的酵素原液于帶塞比色管中，加入5%NaNO20.5 mL，6 min后加入10%Al(NO3)30.5 mL，6 min后加入4%NaOH 5 mL，用蒸餾水補齊至10 mL，搖勻后靜置15 min，于510 nm處測定吸光度值，以蒸餾水代替樣品作為參比溶液。以蘆丁為標準品，根據標準曲線回歸方程y=12.054x-0.002 4、R2=0.999 4，計算黃酮質量濃度，其中y為吸光度值，x為樣品質量濃度，mg·mL-1。

1.3.3 總酚質量濃度的測定

采用Folin-Ciocalteu法測定。取適量的發(fā)酵不同時間的酵素原液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度線。取1 mL稀釋過的樣品液于10 mL帶塞比色管中，加入0.25 mol·L-1福林酚試劑1 mL，5 min后加入20%碳酸鈉2 mL，用蒸餾水補齊至刻度線，于760 nm處測定吸光度值，以蒸餾水代替樣品作為參比溶液。以沒食子酸為標準品，根據標準曲線線性方程y=0.103 4x+0.009 5、R2=0.999 1，計算總酚質量濃度，其中y為吸光度值，x為樣品質量濃度，μg·mL-1。

1.3.4 羥基自由基清除能力的測定

分別取0.15 mL發(fā)酵不同時間的酵素原液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度線。在每支試管中分別依次加入9 mmol·L-1FeSO41 mL、9 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液1 mL和0.03% H2O21 mL，最后加入稀釋過的樣品液1 mL，用蒸餾水補齊至10 mL，搖勻后置于37 ℃水浴中反應15 min，于530 nm處測定吸光度值為A2，以蒸餾水代替樣品作為空白組A1，以不加過氧化氫的為參比溶液，羥基自由基清除率用X1表示，計算公式如下：

ρ(蘆丁)/(mg·mL-1)

ρ(沒食了酸)/(μg·mL-1)

1.3.5 超氧陰離子自由基清除能力的測定

分別取0.8 mL發(fā)酵不同時間的酵素原液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度線。在試管中分別依次加入50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=8.2)4.5 mL和稀釋過的樣品液1 mL，然后加入3 mmol·L-1鄰苯三酚(用10 mmol·L-1HCl配制)0.5 mL，立刻放入比色皿中，于320 nm處每隔30 s測定一次吸光度值，計算5 min內鄰苯三酚的自氧化速率為ΔA2/Δt，以蒸餾水代替樣品為空白組ΔA1/Δt，以10 mmol·L-1HCl代替鄰苯三酚作為參比溶液，超氧陰離子自由基清除率用X2表示，計算公式如下：

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定

分別取50 μL發(fā)酵不同時間的酵素原液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度線。在每支試管中分別加入0.04 mg·mL-1DPPH-乙醇溶液4 mL，然后加入稀釋過的樣品液2 mL，搖勻后在室溫下避光靜置30 min，于517 nm處測定吸光度為A2，以蒸餾水代替樣品為空白組A1，以不加DPPH-乙醇溶液的為參比溶液，DPPH自由基清除率用X3表示，計算公式如下：

1.3.7 ABTS自由基清除能力的測定

取7.4 mmol·L-1的ABTS儲備液和2.6 mmol·L-1的K2S2O8溶液等量混合，置于黑暗處反應12～16 h，用蒸餾水稀釋45倍作為ABTS標準液，使其在734 nm處的吸光度值為0.7左右。分別取70 μL發(fā)酵不同時間的酵素原液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度線。在每支試管中分別加入ABTS標準液4 mL，然后加入稀釋過的樣品液1 mL，搖勻后在暗處靜置6 min，于734 nm處測定吸光度值為A2，以蒸餾水代替樣品為空白組A1，以不加ABTS標準液作為參比溶液，ABTS自由基清除率用X4表示，計算公式如下：

1.3.8 總還原力的測定

采用鐵氰化鉀法。分別取150 μL發(fā)酵不同時間的酵素原液于10 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋并定容至刻度線。在試管中分別依次加入稀釋過的樣品液1 mL、PBS(pH=6.6)2.5 mL，搖勻后在50 ℃水浴中靜置20 min，之后加入10 g·L-1的TCA 2.5 mL，靜置10 min后取上清液2.5 mL，加入0.1%氯化鐵0.5 mL和蒸餾水2.5 mL，搖勻后靜置10 min，于700 nm處測定吸光度值，以蒸餾水代替樣品參比溶液。以所測定的吸光度值的大小反映樣品還原能力的強弱，吸光度越大，還原力越強，抗氧化能力越強。

1.3.9 SOD酶活性的測定

根據1.3.5測得的超氧自由基清除率求得SOD酶活性，μmol·min-1·mL-1。

式中：X2為超氧陰離子自由基清除率，%；V總為反應液的總體積，mL；V樣為加入樣品液的體積，mL；n為樣品稀釋倍數。

2 結果與討論

2.1 黃酮和總酚質量濃度的變化

黃酮可以與自由基反應鏈中的過氧自由基發(fā)生反應，生成穩(wěn)定的半醌式自由基，從而達到清除自由基的目的，因此具有良好的抗氧化能力[8]。酚類物質可以通過直接清除自由基、抑制氧化酶系、激活抗氧化酶系以及與過渡金屬螯合等方式而實現抗氧化作用，是極好的天然抗氧化劑[9]。發(fā)酵過程中總酚和黃酮質量濃度的變化如圖3、圖4所示。

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可知，隨著發(fā)酵時間的延長，青梅中的黃酮被不斷浸出，在第72天達到最大值4.32 mg·mL-1，發(fā)酵后較發(fā)酵前增加了2.42 mg·mL-1。有研究表明[10]，發(fā)酵過程中黃酮質量濃度與酒精體積分數之間呈顯著的相關性，隨著微生物代謝產生的乙醇逐漸增多，青梅中的黃酮不斷被提取出來，酵素液中黃酮的質量濃度隨之增加。總酚質量濃度在發(fā)酵的前30 d快速增加，30 d以后質量濃度增加趨緩，在第72天達到最大值3.33 mg·mL-1，整個發(fā)酵中總酚質量濃度增加了1.85 mg·mL-1。這可能是因為在發(fā)酵前期，可溶性酚類物質逐漸析出，同時微生物代謝產生的碳水化合物代謝酶將青梅中以共軛形式與糖、有機酸、胺和脂質相連的酚類化合物進行酶促水解，大分子酚類物質被轉化為小分子酚類物質，從而增加了酵素中游離酚類物質[11]的質量濃度。Zhu等[12]通過實驗發(fā)現，楊梅果渣發(fā)酵過程中，類黃酮和總酚質量濃度明顯增加，發(fā)酵后楊梅果渣液體比未發(fā)酵的楊梅果渣液體具有更高水平的抗氧化活性。Ding等[13]研究表明，發(fā)酵增加了黑大麥中類黃酮和總酚的質量濃度并提高了其抗氧化能力。

2.2 羥基自由基清除能力的變化

在各種活性氧自由基中，羥基自由基的反應活性和破壞作用最強。不同發(fā)酵時間的青梅酵素對羥基自由基的清除能力如圖5所示。

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可知，發(fā)酵的前30 d，青梅酵素對羥基自由基的清除能力迅速增大，在第30天達到最大清除率61.07%，之后清除能力趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結束后羥基清除率達59.61%，較發(fā)酵前增加了31.28%。李飛等發(fā)酵的蘋果酵素對羥基自由基的清除能力最高達到了77%[14]。

2.3 超氧自由基清除能力的變化

超氧自由基在細胞氧化反應中最先生成，它可以與羥基自由基共同引發(fā)脂質過氧化，同時又可產生其他種類的有害自由基和氧化劑[15]。不同發(fā)酵時間的青梅酵素對超氧自由基的清除能力如圖6所示。

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可得，發(fā)酵前30 d超氧自由基清除能力增加了29.71%，第30天清除能力達到72.61%。30 d以后清除能力較之前有所浮動，但依然維持較高的清除率?？赡苁且驗榘l(fā)酵過程中產生的SOD酶等抗氧化性酶的酶活力增大，有效地清除了氧自由基；同時，酚類化合物的游離羥基以及具有游離的3-羥基取代的類黃酮分子也具有良好的抗氧化能力[16]。

2.4 DPPH自由基清除能力的變化

DPPH作為一種穩(wěn)定的自由基，可以接受電子或氫自由基而成為穩(wěn)定的抗磁性分子，導致其顏色發(fā)生變化，因此被廣泛用于測量活性化合物的抗氧化能力[17]。不同發(fā)酵時間的青梅酵素對DPPH自由基的清除能力如圖7所示。

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可得，在發(fā)酵的前18 d，DPPH清除能力幾乎呈直線上升，18 d后清除能力基本保持穩(wěn)定，在發(fā)酵后期有小幅度增加，發(fā)酵78 d后，DPPH清除率達到68.62%，較發(fā)酵前增加了35%。據報道[18]，DPPH清除能力的變化主要與多酚質量濃度的變化有關。

2.5 ABTS自由基清除能力的變化

相對DPPH自由基來說，ABTS自由基更易被清除且與抗氧化劑反應時間更短，因此ABTS能更好地評價食品的抗氧化性能[19]。不同發(fā)酵時間的青梅酵素對ABTS自由基的清除能力如圖8所示。

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可得，在發(fā)酵的前30 d，ABTS自由基清除能力逐漸增強，30 d之后清除率在70%上下波動，最高達到74.7%。發(fā)酵結束后，清除能力較發(fā)酵前增加了35.76%。蔣增良等[20]研究藍莓酵素的發(fā)酵過程中，ABTS清除能力與未發(fā)酵前相比僅增加了16.5%。

2.6 總還原力的變化

鐵氰化鉀還原法是一種廣泛用于測定抗氧化活性的方法，樣品的還原能力可以通過測量700 nm處的吸光度來表示，吸光度越大表明還原能力越強[21]。發(fā)酵過程中青梅酵素總還原力的變化如圖9所示。

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可得，發(fā)酵前42 d，還原力從0.19增加到0.45，42 d后還原力趨于穩(wěn)定，在第66天前后有小幅度增加。可能是因為發(fā)酵后期，溶解和轉化在酵素中的各種活性物質達到飽和，質量濃度趨于穩(wěn)定。

2.7 SOD酶活力的變化

SOD酶是生物體內抗氧化酶系的主要組成之一，它能快速清除體內的氧自由基，保護組織細胞免受損傷[22]。發(fā)酵過程中青梅酵素中SOD酶活性的變化如圖10所示。

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可得，發(fā)酵過程中SOD酶活力呈現先期快速增加、后期趨于穩(wěn)定的趨勢。在第30天達到最大活性108.92 μmol·min-1·mL-1，發(fā)酵結束后，SOD酶活力維持在108.45 μmol·min-1·mL-1。表明青梅酵素在發(fā)酵過程中具有良好的清除氧自由基的能力。

2.8 抗氧化性能與黃酮及總酚質量濃度之間的相關性分析

通過SPSS軟件，研究ABTS清除能力、DPPH清除能力、超氧自由基清除能力、羥基清除能力以及還原力和黃酮及總酚質量濃度之間的相關性。青梅酵素在自然發(fā)酵過程中抗氧化性能和黃酮及總酚質量濃度之間的相關性分析如表1所示。

表1 抗氧化性能與總酚和黃酮之間的相關性

Wang等[23]通過研究表明，發(fā)酵后番石榴葉茶的可溶性酚提取物表現出更高的抗氧化活性，證實了可溶性酚是抗氧化活性和還原能力的主要貢獻者。蔣增良等[24]的實驗表明，葡萄酵素在自然發(fā)酵過程中具有良好的抗氧化性能，且與酚類物質的質量濃度呈顯著的正相關性。

表1結果顯示，青梅酵素在自然發(fā)酵的過程中，還原力、ABTS清除能力、DPPH清除能力、超氧自由基清除能力以及羥基自由基清除能力與黃酮和總酚質量濃度之間均具有極顯著的正相關性(P<0.01)，且總酚質量濃度與4種自由基的清除能力和還原力之間的相關性要大于黃酮。由此可知，青梅酵素在自然發(fā)酵過程中所表現出的良好的抗氧化能力主要和酚類物質及黃酮有關。

3 結論

本文研究了78 d內青梅經自然發(fā)酵制備青梅酵素過程中活性成分的變化規(guī)律，并測定了它們的抗氧化性能。結果顯示，羥基自由基、超氧自由基、DPPH自由基和ABTS自由基清除能力在發(fā)酵前期均呈現出快速增加的趨勢，中后期略有波動或小幅度增加，還原力也呈現出先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，這和總酚質量濃度變化趨勢相似。黃酮質量濃度在整個發(fā)酵過程中逐步增加，SOD酶活力亦是先期快速增加后趨于穩(wěn)定。還原力以及4種自由基的清除能力和黃酮及總酚質量濃度變化之間均呈現極顯著的相關性(P<0.01)，并且和總酚質量濃度的相關性要高于黃酮。青梅酵素在自然發(fā)酵的過程中表現出良好的抗氧化能力，這主要與酚類物質和黃酮質量濃度的變化有關。