綠豆淀粉純化工藝及性質(zhì)的研究

劉 穎，袁 翔，黃惠庭，王文婷，唐苗苗，邢蕾，李海明

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州234000）

0 引言

綠豆在我國廣泛種植，其營養(yǎng)成分豐富，籽粒中淀粉含量可達(dá)50%，蛋白質(zhì)含量為19.7%~32.1%[1]。淀粉是一種儲(chǔ)存多糖，其在植物生長時(shí)期以淀粉粒形式儲(chǔ)存于細(xì)胞中，在種子、塊莖和塊根等器官中含量十分充足。植物淀粉在食品生產(chǎn)中發(fā)揮著很大作用，其對(duì)動(dòng)物體也有極其重要的生理功能，如供應(yīng)能量、形成機(jī)體組織、節(jié)約蛋白等。綠豆淀粉所提供的能量值很低，這在消費(fèi)者追求健康均衡生活的新時(shí)代顯得尤為重要。另外，綠豆淀粉也具備改善腸道菌群環(huán)境、減少大量有害物質(zhì)吸收的功能。綠豆淀粉被普遍應(yīng)用于食品加工中，也與其獨(dú)特的透明度、溶解度、膨潤力和凍融穩(wěn)定性等性質(zhì)有關(guān)，這些特性對(duì)食品成品的最終質(zhì)量有極其重要的影響。

如今，國內(nèi)外學(xué)者雖然對(duì)綠豆淀粉提取和性質(zhì)廣泛關(guān)注，但對(duì)其研究通常報(bào)道得不夠具體。我國的淀粉工業(yè)發(fā)展存在淀粉產(chǎn)率偏低、品種單一等問題[2]。綠豆中淀粉含量一般在50%以上，但其提取效率有限，不利于充分利用綠豆的優(yōu)良品質(zhì)，一定程度上對(duì)綠豆原料造成很大浪費(fèi)。試驗(yàn)利用水磨法提取綠豆淀粉后采用酶法除去蛋白以純化淀粉，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)獲得最佳純化工藝，既能保證綠豆淀粉提取率及純度，又能使生產(chǎn)能耗降低、純化時(shí)間縮短，研究純化后綠豆淀粉的理化性質(zhì)，以期為提高其綜合利用價(jià)值提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要原料與試劑

1.1.1 主要原料

綠豆，市售。

1.1.2 主要試劑

氫氧化鈉、氯化鈉、無水乙醇，西隴化工股份有限公司提供；鹽酸、乙醚，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司提供；牛血清白蛋白，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；堿性蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司提供。

1.2 主要儀器

全自動(dòng)豆?jié){機(jī)，九陽股份有限公司產(chǎn)品；SHZD（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；H1805型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；UV-5100H型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；SU1510型掃描電子顯微鏡，株式會(huì)社日立高新技術(shù)那柯事業(yè)所產(chǎn)品；PHS-3C型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 綠豆淀粉純化工藝

1.3.1 水磨法提取綠豆淀粉工藝

參照Liu W，王立東等人[3-4]對(duì)綠豆淀粉的提取方法，并加以改動(dòng)：按料液比1∶4（g∶mL）將50 g綠豆浸泡于水中，于40℃下浸泡時(shí)間14 h，加900 mL蒸餾水進(jìn)行第1次磨漿，豆?jié){用紗布過濾后收集殘?jiān)M(jìn)行第2次磨漿，再次過濾、離心，取底部淀粉用蒸餾水洗滌，得淀粉半成品。用無水乙醇對(duì)所得淀粉半成品進(jìn)行3次抽濾洗滌，再用無水乙醇和乙醚按1∶1比例混合抽濾1次，最后用乙醚抽濾1次，將除脂肪后的淀粉半成品置于45℃下烘干過夜。粉碎即為綠豆粗淀粉。

1.3.2 淀粉中蛋白質(zhì)含量測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

添加試劑見表1。

表1 添加試劑

采用紫外分光光度法測定綠豆淀粉中蛋白質(zhì)的含量。按表1依次加入質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL牛血清白蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.9%氯化鈉溶液，于波長280 nm處分別測出吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。

（2）待測樣品的測定。取待測淀粉溶解于0.9%氯化鈉溶液中，定容至100 mL，按上述方法測定在波長280 nm處的吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出淀粉中蛋白含量。

1.3.3 酶法除蛋白純化綠豆淀粉工藝

（1）工藝流程。提取的粗淀粉采用堿性蛋白酶進(jìn)行除蛋白質(zhì)純化操作，參考陳振家，胡愛軍等人[6-7]對(duì)豆類淀粉酶法提取純化工藝的研究方法并稍加改動(dòng)。分別稱取同一條件下制得的粗淀粉2.5 g于4支試管中，以1∶8（g∶mL）的料液比加入蒸餾水，并將其pH值調(diào)至所需的堿性環(huán)境，加入一定量的堿性蛋白酶，在一定溫度的水浴鍋中酶解一定時(shí)間后，以轉(zhuǎn)速3 400 r/min離心10 min，除上清液，取下層沉淀，用蒸餾水洗滌、離心，取沉淀，反復(fù)3次，置于45℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干過夜，得到純化綠豆淀粉。

（2）單因素試驗(yàn)。設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，研究當(dāng)酶解溫度55℃，酶用量600 U/g，酶解液pH值9時(shí)，不同酶解時(shí)間（2，3，4，5，6 h）對(duì)綠豆淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響；當(dāng)酶解時(shí)間4 h，酶用量600 U/g，酶解液pH值9時(shí)，不同酶解溫度（35，45，55，65，75℃）對(duì)綠豆淀粉中蛋白殘余量的影響；當(dāng)酶解時(shí)間4 h，酶解溫度55℃，酶解液pH值9時(shí)，不同酶用量（400，500，600，700，800 U/g）對(duì)綠豆淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響；當(dāng)酶解時(shí)間4 h，酶解溫度55℃，酶用量600 U/g時(shí)，不同酶解液pH值（7，8，9，10，11）對(duì)綠豆淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響[7]。

（3）正交試驗(yàn)。按表2設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)，確定純化工藝最佳參數(shù)。

酶法除蛋白質(zhì)純化淀粉正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 酶法除蛋白質(zhì)純化淀粉正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.4 綠豆淀粉理化性質(zhì)的研究

（1）淀粉顆粒形貌觀察。掃描電子顯微鏡觀察淀粉顆粒形貌，參照裴亞瓊等人[8]的方法進(jìn)行測定。

（2）淀粉糊透明度測定。參考侯蕾等人[9]的方法并加以改動(dòng)進(jìn)行測定。

（3）淀粉糊溶解度和膨潤力測定。參考郭神旺等人[10]對(duì)主要雜豆淀粉理化性質(zhì)的分析方法并加以改動(dòng)進(jìn)行測定。

（4）淀粉糊凍融穩(wěn)定性測定。參考王鵬等人[11]對(duì)豆類淀粉的研究方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶法除蛋白純化綠豆淀粉試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

（1）酶解時(shí)間對(duì)淀粉中蛋白殘余量的影響。

不同酶解時(shí)間對(duì)淀粉中蛋白殘余量的影響見圖1。

圖1 不同酶解時(shí)間對(duì)淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響

由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的增加，蛋白殘余量逐漸遞減，酶解時(shí)間超過4 h后，蛋白殘余量變化不大，基本趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)殚_始時(shí)溶液中酶的濃度較高，所以在2~4 h綠豆淀粉中的蛋白質(zhì)殘余量不斷減少，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，溶液中酶濃度逐漸變小，酶的活性也逐漸降低，導(dǎo)致淀粉與蛋白質(zhì)分離速度減慢甚至不再分離，且淀粉中蛋白近乎除盡，因此蛋白質(zhì)殘余量基本不變[12]。因此，選擇4 h為最適酶解時(shí)間。

（2）酶解溫度對(duì)淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響。

不同酶解溫度對(duì)淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響見圖2。

圖2 不同酶解溫度對(duì)淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響

由圖2可知，當(dāng)酶解溫度上升到55℃時(shí)，淀粉中蛋白質(zhì)殘余量最少，為5.4 mg/g；當(dāng)溫度超過55℃后，蛋白質(zhì)殘余量呈上升趨勢，這可能是因?yàn)闇囟冗^高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，從而降低其溶解度，不利于蛋白質(zhì)的溶出而隨淀粉下沉[6]；并且高溫也會(huì)引起堿性蛋白酶變性失活，水解速度降低[13]。因此，選擇55℃為最適酶解溫度。

（3）酶用量對(duì)淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響。

不同酶用量對(duì)淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響見圖3。

由圖3可知，隨著酶用量的不斷增加，蛋白質(zhì)殘余量不斷減少，但當(dāng)酶用量達(dá)到600 U/g之后，蛋白質(zhì)殘余量較小幅度上升。這可能是由于剛開始酶用量低于底物濃度，酶促反應(yīng)速度隨著酶用量的增加而加快，當(dāng)酶用量繼續(xù)增加直到過量時(shí)，使蛋白質(zhì)過度水解從而暴露更多疏水性基團(tuán)，形成不溶性聚集體，降低了蛋白質(zhì)的溶解度，從而導(dǎo)致淀粉中蛋白質(zhì)殘余量上升[6]。因此，選擇600 U/g為最合適的酶用量。

圖3 不同酶用量對(duì)淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響

（4）酶解液pH值對(duì)淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響。

不同酶解液pH值對(duì)淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響見圖4。

圖4 不同酶解液pH值對(duì)淀粉中蛋白質(zhì)殘余量的影響

由圖4可知，當(dāng)酶解液pH值逐漸增大時(shí)，淀粉蛋白質(zhì)殘余量逐漸減少，這是因?yàn)殡S著酶解液pH值的增大，堿性蛋白酶的活性也逐漸提高[6]。當(dāng)酶解液pH值為9時(shí)，蛋白質(zhì)殘余量最少，為5.3 mg/g；但當(dāng)酶解液pH值繼續(xù)增大時(shí)，淀粉蛋白質(zhì)殘余量逐漸增加，這是因?yàn)楦遬H值的堿性環(huán)境可能會(huì)導(dǎo)致部分淀粉糊化，增大溶液的黏度[14]，使蛋白質(zhì)不易從淀粉中溶出，同時(shí)過高的pH值環(huán)境也會(huì)降低堿性蛋白酶的酶活。因此，選擇最適酶解液pH值為9。

2.1.2 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

酶法除蛋白質(zhì)純化綠豆淀粉正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表3。

表3 酶法除蛋白質(zhì)純化綠豆淀粉正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表3可知，綠豆淀粉蛋白質(zhì)殘余量的極差R值在0.16~0.60，每個(gè)因素對(duì)蛋白質(zhì)殘余量的影響作用順序?yàn)槊附鈺r(shí)間>酶解溫度>酶用量>酶解液pH值，綠豆淀粉純化的最佳工藝條件組合為A3B3C1D1，即酶解時(shí)間4.5 h，酶解溫度60℃，酶用量550 U/g，酶解液pH值9。

2.1.3 綠豆淀粉純化的驗(yàn)證性試驗(yàn)

參照正交優(yōu)化試驗(yàn)得到的最佳因素組合進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次并取平均值得到綠豆淀粉蛋白質(zhì)殘余量為3.9 mg/g。

2.2 綠豆淀粉理化性質(zhì)研究結(jié)果

2.2.1 淀粉顆粒掃描電鏡觀察

分別對(duì)除蛋白質(zhì)純化后的淀粉顆粒及未純化的淀粉顆粒進(jìn)行電鏡掃描。

純化及未純化綠豆淀粉顆粒形態(tài)圖見圖5。

圖5 純化及未純化綠豆淀粉顆粒形態(tài)圖

由圖5可知，體積較小的綠豆淀粉顆粒一般為圓形，而體積稍大的綠豆淀粉顆粒為橢圓形。圖a、圖b為用堿性蛋白酶純化除蛋白質(zhì)后的綠豆淀粉顆粒，表面雖有凹痕但較為光滑；圖c、圖d為未用堿性蛋白酶純化的淀粉顆粒，顆粒表面有少許附著物，不光滑，其可能是還未除去的淀粉殘余蛋白質(zhì)。

2.2.2 淀粉糊透明度

綠豆淀粉糊透明度隨時(shí)間的變化見圖6。

圖6 綠豆淀粉糊透明度隨時(shí)間的變化

淀粉的透明度反映了淀粉與水的結(jié)合能力，一般用透光率來表示透明度的強(qiáng)度，淀粉中的直支比是影響淀粉糊透明度的重要因素[15]。由圖6可知，綠豆淀粉糊的透光率隨著放置時(shí)間的增加而逐步下降，即透明度逐漸降低。在粉絲生產(chǎn)中，透明度與其口感、外觀的光澤度有直接關(guān)系。

2.2.3 淀粉糊溶解度和膨潤力

綠豆淀粉糊溶解度隨溫度的變化見圖7，綠豆淀粉糊膨潤力隨溫度的變化見圖8。

圖7 綠豆淀粉糊溶解度隨溫度的變化

圖8 綠豆淀粉糊膨潤力隨溫度的變化

淀粉分子與水分子之間的相互作用可依據(jù)不同溫度下的溶脹吸水和直鏈淀粉的析出表現(xiàn)出來[16]。由圖7可知，淀粉糊的溶解度與溫度呈正相關(guān)，當(dāng)溫度為100℃時(shí)，其溶解度達(dá)到最大，為31.11%；由圖8可知，綠豆淀粉糊的膨潤力隨著溫度的升高而逐步增大，最大為23.22%。

2.2.4 淀粉糊凍融穩(wěn)定性

凍融穩(wěn)定性隨淀粉糊質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化見圖9。

圖9 凍融穩(wěn)定性隨淀粉糊質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

凍融穩(wěn)定性為淀粉糊耐受冷凍、融解等劇烈物理變化的能力，一般用析水率來表示凍融穩(wěn)定性，析水率越大，凍融穩(wěn)定性就越差。從圖9可知，當(dāng)?shù)矸酆|(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，其析水率達(dá)到54.37%，極不穩(wěn)定，隨著綠豆淀粉糊的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷增加，析水率逐步下降且趨于平緩，凍融穩(wěn)定性越來越好。

3 結(jié)論

采用水磨法提取綠豆淀粉，并使用酶法除蛋白以純化淀粉，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)獲得最佳純化工藝條件為酶解時(shí)間4.5 h，酶解溫度60℃，酶用量550 U/g，酶解液pH值9，在此工藝條件下，所制得的綠豆淀粉中蛋白質(zhì)殘余量最少，為3.9 mg/g，淀粉純化效果最佳。綠豆淀粉顆粒表面較為光滑，呈圓形或橢圓形。綠豆淀粉糊的透明度與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，溶解度和膨潤力與溫度呈正相關(guān)，凍融穩(wěn)定性隨淀粉糊質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而越來越高。研究為更高效地提取純化綠豆淀粉及提高其綜合利用價(jià)值提供了一定的理論參考。