人腦膠質(zhì)瘤lncRNA PIK3CD-AS2表達(dá)及臨床意義

鄭江林 王 旋 汪珉杰 姜曉兵

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，具有難治療、易復(fù)發(fā)、生存期短的特點[1～3]，特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，中位生存期僅8 個月左右[4]。近年來，膠質(zhì)瘤潛在的分子生物學(xué)標(biāo)志物成為研究的重點。長鏈非編碼RNA（long-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 個核苷酸的非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄子，通過染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄修飾和轉(zhuǎn)錄后修飾等參與基因的表達(dá)調(diào)控，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、代謝、耐藥等緊密相關(guān)[5，6]。本文探討lncRNA PIK3CD-AS2在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)庫檢索 檢索TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）下載膠質(zhì)瘤組織RNA測序數(shù)據(jù)及對應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。納入標(biāo)準(zhǔn)為：①總生存期≥30 d；②WHO 分級明確；③IDH 突變、1p19q共缺失和MGMT 啟動子甲基化數(shù)據(jù)完整。最終納入符合標(biāo)準(zhǔn)的膠質(zhì)瘤共531 例。檢索GTEx 數(shù)據(jù)庫（https://gtexportal.org/）下載1 152例正常腦組織的RNA測序數(shù)據(jù)作為對照。所有RNA 測序數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 臨床病例 收集2010 年9 月至2015 年6 月手術(shù)切除的原發(fā)性膠質(zhì)瘤標(biāo)本127例，其中男84例，女43例；年齡19～76 歲，平均（45.14±11.50）歲；WHO 分級Ⅱ級45例，Ⅲ級55例，Ⅳ級27例。所有病人均為首次手術(shù)且術(shù)前未行放化療，術(shù)后均隨訪至2020 年6月或直至死亡。另收集2018 年1 月至2019 年10 月顱腦損傷內(nèi)減壓術(shù)中切除的正常腦組織標(biāo)本38 例作為對照，其中男22 例，女16 例；年齡24～69 歲，平均（44.24±11.53）歲。本研究由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院研究倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 臨床病例的lncRNA PIK3CD-AS2 的提取及檢測 采用Trizol 提取總RNA，測定RNA 純度和濃度，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara RR036A）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，qRT-PCR 采用TB Green Premix Ex TaqⅡ（Takara RR820A），檢測lncRNA PIK3CD-AS2 表達(dá)水平。引物序列：PIK3CD-AS2 正義鏈5'-GGGATCATAAATGCTTGCTGTT-3'，反義鏈5'-CGTATTAGTTACTGGTTGCTGTT-3'；內(nèi)參GAPDH 正義鏈5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3'，反義鏈 5'-TGGGTGGAATCATATTGGAACA-3'。采用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析，每個組織樣品實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0軟件分析；定量資料以表示，采用t檢驗；定性資料采用χ2檢驗和Fisher 確切概率法檢驗；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，采用Log-rank 檢驗；多因素Cox 風(fēng)險回歸模型分析預(yù)后影響因素；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 公共數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果 與正常腦組織（GTEx；n=1 152）相比，膠質(zhì)瘤組織（TCGA；n=531）lncRNA PIK3CD-AS2 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.001；圖1）。膠質(zhì)瘤WHO 分級越高，PIK3CD-AS2 表達(dá)水平明顯增高（P＜0.001；圖1）。

圖1 檢索TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫分析膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織lncRNA PIK3CD-AS2的表達(dá)情況

以PIK3CD-AS2表達(dá)水平中位數(shù)為界，將TCGA中531 例膠質(zhì)瘤分為高表達(dá)組（265 例）和低表達(dá)組（266例）。多因素Cox風(fēng)險回歸模型分析顯示，年齡增大、WHO 高級別以及PIK3CD-AS2 高表達(dá)是膠質(zhì)瘤預(yù)后不良的獨立危險因素（P＜0.001，圖3），而IDH突變和1p19q共缺失是膠質(zhì)瘤預(yù)后較好的獨立保護(hù)因素（P＜0.05，圖2）。生存曲線分析顯示，高表達(dá)組總生存期較低表達(dá)組顯著縮短（P＜0.001；圖3）。

圖2 檢索TCGA數(shù)據(jù)庫應(yīng)用多因素Cox比例回歸風(fēng)險模型分析膠質(zhì)瘤預(yù)后影響因素

圖3 檢索TCGA 數(shù)據(jù)庫應(yīng)用生存曲線分析PIK3CD-AS2 表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病人總生存期的關(guān)系

2.2 臨床病例分析結(jié)果 與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織lncRNA PIK3CD-AS2 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.0001）。隨膠質(zhì)瘤WHO分級升高，PIK3CD-AS2表達(dá)水平也明顯增加（圖4）。以PIK3CD-AS2 表達(dá)水平中位數(shù)為界，將127例膠質(zhì)瘤分為高表達(dá)組（63例和）低表達(dá)組（64 例）。多因素Cox 風(fēng)險回歸模型分析顯示例，WHO 高級別以及PIK3CD-AS2 高表達(dá)是膠質(zhì)瘤預(yù)后不良的獨立危險因素（P＜0.001；表1）。生存曲線分析顯示，高表達(dá)組總生存期較低表達(dá)組顯著縮短（P＜0.001；圖5）。

表1 臨床收集的127例膠質(zhì)瘤生存預(yù)后影響因素的Cox比例回歸風(fēng)險模型分析

圖4 臨床檢測125例膠質(zhì)瘤lncRNA PIK3CD-AS2表達(dá)水平

圖5 生存曲線分析臨床收集的127 例腦膠質(zhì)瘤lncRNA PIK3CD-AS2表達(dá)水平與病人總生存期的關(guān)系

3 討論

膠質(zhì)瘤為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，難以完全切除，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后極差，因此，尋找膠質(zhì)瘤潛在的分子生物學(xué)標(biāo)志物具有重要意義。Wu 等[7]發(fā)現(xiàn)lncRNA DUXAP10 通過HuR/Sox12 信號軸維持膠質(zhì)瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性。Cai 等[8]發(fā)現(xiàn)lncRNA LINC0098能夠通過CBX3介導(dǎo)的c-Met/Akt/mTOR 信號軸抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。這表明，lncRNA參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展過程。

lncRNA PIK3CD-AS2位于染色體1p36.22，大小為953 bp。Zheng 等[9]研究發(fā)現(xiàn)PIK3CD-AS2 在肺腺癌中高表達(dá)，并且通過PIK3CD-AS2/YBX1/p53信號軸促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖。本文首先檢索公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生信分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常腦組織比，膠質(zhì)瘤組織lncRNA PIK3CD-AS2顯著高表達(dá)，并且隨膠質(zhì)瘤WHO分級的升高，PIK3CD-AS2的表達(dá)也明顯增加。這提示PIK3CD-AS2與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展存在一定的關(guān)系。同時，本文還發(fā)現(xiàn)PIK3CD-AS2 高表達(dá)病人總生存期顯著低于低表達(dá)病人。為驗證數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果的可靠性，我們收集127 例臨床膠質(zhì)瘤病例進(jìn)行分析，結(jié)果與公共數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果相符，進(jìn)一步證實了PIK3CD-AS2作為膠質(zhì)瘤分子生物學(xué)標(biāo)志物的價值。

總之，lncRNA PIK3CD-AS2 在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，可作為膠質(zhì)瘤病人預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物。