制片方法對(duì)棗花授粉熒光顯微觀察效果的影響

陳 娟，王 森，邵鳳俠

（中南林業(yè)科技大學(xué) a.經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；c.湖南省南方丘陵山地生態(tài)經(jīng)濟(jì)林產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

中秋酥脆棗Ziziphus jujubacv.Zhongqiusucui為鼠李科Rhamnaceae 棗屬Ziziphus植物[1]，是湖南省選育出來的一個(gè)高檔鮮食棗品種，具有果實(shí)大、甜度高的特點(diǎn)[2-3]。棗花為兩性完全花，呈黃綠色，具萼片、花瓣、雄蕊各5 枚。雌蕊著生蜜盤中央，柱頭二裂，稀三裂，短壯豐滿，呈圓錐體形，花朵盛開時(shí)先端分開[4]。棗樹花量大，花期長(zhǎng)，自然情況下坐果率很低[5]。

常用的植物制片技術(shù)有石蠟制片法、壓片法、冰凍切片法、半薄切片法及超薄切片法等，觀察技術(shù)有熒光顯微術(shù)、掃描電鏡術(shù)以及透射電鏡術(shù)等[6]。棗花花柱組織較硬，細(xì)胞組織較厚，用常規(guī)壓片法在光學(xué)顯微鏡下觀察棗樹花粉管的生長(zhǎng)，效果不理想，只能觀察到柱頭表面花粉管的萌發(fā)，看不到柱頭內(nèi)部的生長(zhǎng)過程。為使組織能被壓成薄層，以利在顯微鏡下檢查花粉管，在染色前常需要對(duì)材料進(jìn)行軟化。水煮和NaOH 溶液浸泡是常見的植物材料軟化方式[7]。熱水煮可以溶解掉植物材料內(nèi)部的無機(jī)鹽、糖、植物堿、單寧、色素、淀粉、果膠質(zhì)、多乳糖等多種成分；NaOH 和KOH 等強(qiáng)堿溶液除了能溶解上述成份外，還能溶解部分木質(zhì)素、戊聚糖、糖醛酸等。

成熟的花粉粒具有兩層細(xì)胞壁，即花粉內(nèi)壁和花粉外壁。花粉內(nèi)壁的化學(xué)組成為果膠質(zhì)和胼胝質(zhì)，結(jié)構(gòu)較薄，而外壁的組成成分為纖維素、角質(zhì)和孢粉素，結(jié)構(gòu)較厚[8-9]。研究花粉管最常用的熒光染料為水溶性苯胺藍(lán)，可與花粉管的胼胝質(zhì)特異性結(jié)合，在寬帶紫外光激發(fā)下產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，而花柱和子房組織的自發(fā)弱熒光則顏色較暗，兩者反差明顯，很容易區(qū)分，便于確定花粉管在花柱中的位置[6,10]。

棗樹普遍坐果率低，胚敗育現(xiàn)象嚴(yán)重，極大地制約了棗樹雜交育種進(jìn)程[3,11]。這些問題與受精過程密切相關(guān)，因此研究棗樹花粉管生長(zhǎng)顯得尤為重要。有關(guān)植物花粉管生長(zhǎng)的熒光觀察的研究比較多。胡適宜[12]簡(jiǎn)要介紹了供熒光顯微鏡下檢查花粉管的制片法；張學(xué)英等[13]、王堯等[14]利用熒光顯微鏡研究了棗樹授粉受精過程、柱頭可授性以及花粉管生長(zhǎng)。Asatryan 等[15]利用苯胺藍(lán)對(duì)棗花進(jìn)行染色拍照，在黑暗背景的反襯之下能明顯看到花粉管在花柱內(nèi)呈現(xiàn)的藍(lán)綠色熒光。以上研究均采用NaOH 溶液對(duì)材料軟化，苯胺藍(lán)染色，在熒光顯微鏡下觀察花粉管，但其觀察效果并不是非常理想。本研究采用熒光顯微技術(shù)，通過比較不同處理下棗花花粉管的熒光觀察效果，確定適合觀察棗花花粉管的制片方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)地為湖南省衡陽市祁東縣風(fēng)石堰鎮(zhèn)中南林業(yè)科技大學(xué)棗樹試驗(yàn)基地。

試驗(yàn)樹為4年生中秋酥脆棗健康植株，從其生長(zhǎng)發(fā)育良好的棗吊上采摘不同開放階段的棗花作為試驗(yàn)材料，用FAA（福爾馬林-乙酸-50%酒精混合液）固定液固定保存。

1.2 方 法

1.2.1 不同軟化方法處理對(duì)棗花花柱軟化效果的影響

本試驗(yàn)采用NaOH 溶液對(duì)棗花進(jìn)行軟化，設(shè)置了不同濃度的NaOH 溶液和處理時(shí)間（表1）。將棗花從固定液中取出，依次在50%和30%乙醇溶液中浸泡各30 min 后，用蒸餾水沖洗數(shù)次，然后進(jìn)行軟化處理。以相同時(shí)間用蒸餾水浸泡的棗花作為對(duì)照，比較不同軟化方法對(duì)棗花花柱的軟化效果，并用OLYMPUS SZ51 體視顯微鏡觀察拍照。每個(gè)處理重復(fù)3 次，每處理?xiàng)椈〝?shù)不少于10 個(gè)。

表1 軟化方法試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The experimental design of softening method

1.2.2 不同染色方法處理對(duì)棗花花粉管觀察效果的影響

將經(jīng)過不同軟化方法處理后的棗花取出，蒸餾水沖洗干凈后，用水溶性苯胺藍(lán)染液（0.15 mol/L 磷酸鹽緩沖液配制，pH 值8.2）對(duì)棗花進(jìn)行避光染色，比較不同染色方法對(duì)棗花花粉管熒光觀察效果的影響（表2）。每個(gè)處理重復(fù)3 次，每處理?xiàng)椈〝?shù)不少于10 個(gè)。

表2 染色方法試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 The experimental design of dyeing method

用熒光染料染色的標(biāo)本不能長(zhǎng)期保存，所以應(yīng)及時(shí)制片觀察。棗花染色完全后，將其取出，用吸水紙吸去多余水分。用刀片縱向剖取花柱及子房部分，置于載玻片上，用玻棒蘸取少許甘油滴于花柱上，蓋上蓋玻片，并用鑷子稍加壓力，使花柱展開。用OLYMPUS BX51 熒光顯微鏡觀察并拍照記錄[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同軟化方法處理對(duì)棗花花柱軟化效果的影響

棗花經(jīng)不同軟化方法處理后，用蒸餾水沖洗干凈，在體視鏡下直接鏡檢，拍照后進(jìn)行后續(xù)染色處理和壓片觀察。

由表3、圖1可知，經(jīng)蒸餾水浸泡0.5 h 的棗花，花柱組織呈淺黃色（圖1A），用刀片剖取花柱時(shí)，花柱組織完整，但壓片時(shí)材料不平整；延長(zhǎng)浸泡時(shí)間，棗花花柱外觀變化不明顯（圖1G）。經(jīng)1、2 mol/L NaOH 溶液處理0.5、1 h 的棗花，花柱和柱頭的顏色加深，花柱組織基本完整，壓片也較平整，組織軟化效果較好（圖1B—C，H—I）。經(jīng)3 mol/L NaOH 溶液處理0.5 h 后，棗花柱組織呈黑色（圖1D），剖取花柱時(shí)組織較完整、壓片平整；經(jīng)3 mol/L NaOH 溶液處理1 h 后，剖取花柱時(shí)組織易碎，壓片平整（圖1J）。經(jīng)4、8 mol/L NaOH 溶液處理的棗花花柱組織松軟，用刀片剖取花柱以及用鑷子輕壓蓋玻片時(shí)組織易碎（圖1E—F）；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，棗花顏色明顯變深，用刀片剖取花柱時(shí)組織軟化程度也明顯加深（圖1K—L）。

圖1 不同濃度NaOH 溶液處理后的棗花效果Fig.1 The effect picture of jujube flowers after different concentration NaOH softening

表3 不同軟化方法對(duì)棗花花柱壓片效果的影響Table 3 The effect of different softening methods on jujube flowers tableting

相同的軟化時(shí)間，NaOH 溶液濃度越高，棗花軟化程度也越高，壓片時(shí)棗花也越容易壓平，但NaOH 溶液濃度超過4 mol/L 后，棗花組織明顯變松軟，過度軟化，壓片時(shí)組織也容易破碎而不便觀察。NaOH 溶液濃度越高，所需軟化處理時(shí)間越短；而使用低濃度NaOH 溶液處理軟化效果較差，且需要較長(zhǎng)處理時(shí)間。選擇1、2 和3 mol/L NaOH 溶液對(duì)棗花進(jìn)行軟化，都能取得良好的壓片效果。

2.2 不同染色方法處理對(duì)棗花花粉管觀察效果的影響

相同軟化處理?xiàng)l件下，通過比較棗花在相同處理時(shí)間下不同濃度水溶性苯胺藍(lán)溶液的染色效果，以及同一濃度水溶性苯胺藍(lán)溶液染色不同時(shí)間的效果，探究適合觀察棗花粉管萌發(fā)的染色方法。

在不軟化的條件下，棗花經(jīng)0.01%水溶性苯胺藍(lán)溶液染色0.5 h，能觀察到花柱細(xì)胞呈現(xiàn)微弱的熒花，且與暗色背景對(duì)比不明顯，而花粉管形態(tài)清晰可見，呈現(xiàn)出明亮的藍(lán)綠色熒光（圖2A）；經(jīng)0.05%水溶性苯胺藍(lán)溶液染色0.5 h，花柱與背景的顏色對(duì)比明顯，組織結(jié)構(gòu)完整，花柱表面花粉?？梢?，但無法觀察到花粉管（圖2B）；經(jīng)0.1%水溶性苯胺藍(lán)溶液染色0.5 h，可以觀察到柱頭表面有少量花粉粒，花柱細(xì)胞現(xiàn)呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，花粉粒與花柱其他部分顯色對(duì)比不明顯（圖2C）。棗花經(jīng)3 種濃度水溶性苯胺藍(lán)溶液染色1 h，圖片較難分辨花柱與背景的交界，但均能觀察到花粉和花粉管產(chǎn)生的強(qiáng)烈熒光（圖2D—F）。經(jīng)3 種濃度水溶性苯胺藍(lán)溶液染色4 h，可觀察到棗花花柱與背景顏色對(duì)比較明顯，花粉管發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)綠色熒光，但與花柱相比花粉管分辨度不高（圖2G—I）。

圖2 不經(jīng)NaOH 溶液軟化時(shí)不同濃度水溶性苯胺藍(lán)溶液染色效果Fig.2 Different concentration of aniline blue water soluble dyeing without softening

在1 mol/L NaOH 溶液軟化0.5 h 的條件下，棗花經(jīng)0.01%水溶性苯胺藍(lán)溶液染色0.5 h，能觀察到花柱產(chǎn)生的熒光較弱，這可能是花柱著色不充分或者染色時(shí)間較短的緣故（圖3A）；經(jīng)0.05%水溶性苯胺藍(lán)染色0.5 h，可清晰觀察到棗花柱頭表面的花粉管（圖3B）；經(jīng)0.1%水溶性苯胺藍(lán)染色0.5 h，花柱細(xì)胞與暗色背景對(duì)比不明顯，可以觀察到柱頭表面有少量花粉粒和花粉管（圖3C）。染色時(shí)間為1、4 h 時(shí)，3 種濃度染色的棗花花柱在周圍暗背景的反襯下，均能觀察到強(qiáng)烈的藍(lán)綠色熒光，都能清晰地觀察到花粉管結(jié)構(gòu)，且花柱細(xì)胞與花粉管顏色對(duì)比明顯（圖3D—F，G—I）。

圖3 1 mol/L NaOH 溶液軟化0.5 h 不同濃度水溶性苯胺藍(lán)溶液染色效果Fig.3 Different concentration of aniline blue water soluble dyeing after 1 mol/L NaOH softening 0.5 h

在2 mol/L NaOH 溶液軟化0.5 h 的條件下，棗花經(jīng)0.01%水溶性苯胺藍(lán)溶液染色0.5 h，花柱與背景的顏色對(duì)比明顯，但沒有觀察到花粉粒和花粉管（圖4A），這可能是因?yàn)闂椈ㄋ庨_放階段較早，花粉未成熟或沒有進(jìn)行授粉；經(jīng)0.05%水溶性苯胺藍(lán)溶液染色0.5 h，在柱頭上能觀察到花柱表面的藍(lán)綠色熒光顆粒以及花粉管發(fā)出的明亮熒光，可見花柱表面花粉粒及花粉在柱頭上的萌發(fā)情況，但在花柱中只觀察到部分花粉管萌發(fā)（圖4B）；經(jīng)0.1%水溶性苯胺藍(lán)溶液染色0.5 h，只見有花粉管的點(diǎn)狀熒光，未觀察到完整的花粉管（圖4C）。染色1、4 h 時(shí)，棗花花柱經(jīng)過3種濃度水溶性苯胺藍(lán)溶液染色后，均能觀察到花粉粒發(fā)出的強(qiáng)烈熒光，與圖片背景對(duì)比明顯（圖4D—F，G—I）。

圖4 2 mol/L NaOH 溶液軟化0.5 h 不同濃度水溶性苯胺藍(lán)溶液染色效果Fig.4 Different concentration of aniline blue water soluble dyeing after 2 mol/L NaOH softening 0.5 h

在3 mol/L NaOH 溶液軟化0.5 h 的條件下，棗花經(jīng)0.01%水溶性苯胺藍(lán)溶液染色0.5 h，花柱與背景的顏色對(duì)比明顯，花柱表面觀察到少量花粉粒（圖5A）；經(jīng)0.05%水溶性苯胺藍(lán)溶液染色0.5 h，在柱頭上能觀察到明亮的藍(lán)綠色熒光區(qū)域，柱頭表面能觀察到少量的花粉管（圖5B）；經(jīng)0.1%水溶性苯胺藍(lán)溶液染色0.5 h，未觀察到完整的花粉管，只見有點(diǎn)狀的花粉管熒光（圖5C）。染色1 h（圖5D—F）和4 h（圖5G—I），經(jīng)過3 種濃度水溶性苯胺藍(lán)溶液染色的棗花花柱上，均能觀察到花粉發(fā)出的強(qiáng)烈熒光，與背景對(duì)比十分明顯。

圖5 3 mol/L NaOH 溶液軟化0.5 h 不同濃度水溶性苯胺藍(lán)溶液染色效果Fig.5 Different concentration of aniline blue water soluble dyeing after 3 mol/L NaOH softening 0.5 h

綜合以上分析，經(jīng)1、2 和3 mol/L NaOH 溶液軟化處理后，對(duì)棗花進(jìn)行染色觀察發(fā)現(xiàn)，棗花花柱與圖片背景對(duì)比明顯，清晰可見花粉粒和花粉管產(chǎn)生的藍(lán)綠色熒光。在相同軟化方法處理的條件下，隨著相同濃度水溶性苯胺藍(lán)溶液染色時(shí)間的增加，對(duì)花粉管的染色效果并沒有產(chǎn)生明顯的增強(qiáng)作用。而相同染色時(shí)間內(nèi)，用高濃度的水溶性苯胺藍(lán)溶液對(duì)棗花進(jìn)行染色，染色效果比低濃度的好。

3 討 論

對(duì)熒光顯微結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，花粉管在很大程度上依然被花柱組織遮擋，花粉管觀察效果不理想。這可能是棗花柱組織過厚、透明效果較差，導(dǎo)致花粉管生長(zhǎng)被花柱組織遮擋。本研究?jī)H進(jìn)行了染色前的軟化方法對(duì)壓片效果的試驗(yàn)，對(duì)軟化過程中棗花花柱的透明效果未進(jìn)行探討。如何對(duì)花柱進(jìn)行透明并在軟化過程中兼顧透明效果或者采用更多形式的軟化方式，如使用透明劑、水煮等方法[17-18]，可以成為下一步研究的方向。實(shí)驗(yàn)中常用的3 種透明劑，即強(qiáng)堿（NaOH 或KOH）、冬青油和甘油對(duì)不同植物材料進(jìn)行處理，都取得了良好的效果[18]。程云清等[17]對(duì)木質(zhì)化的榛子花柱進(jìn)行NaOH 溶液浸泡并水煮20 min 處理后，花粉管結(jié)構(gòu)更清晰，軟化效果更好。吳軍等[19]研究發(fā)現(xiàn)使用2 mol/L NaOH 溶液對(duì)麻瘋樹雌蕊組織進(jìn)行透明處理比較適宜。侯思皓等[20]、任海燕等[21]使用2 mol/L NaOH 溶液浸泡并水煮棗花花柱30 min，使花柱組織得到了最大程度的透明化處理，花粉管熒光顯微效果較好，排除了花柱組織的干擾，可更準(zhǔn)確地觀察花粉管生長(zhǎng)進(jìn)程及判斷花粉管生長(zhǎng)受抑制的部位。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，處在萼片展平期前期的棗花，經(jīng)水溶性苯胺藍(lán)溶液染色后在熒光顯微鏡下拍照，僅能觀察到少量的花粉和花粉管出現(xiàn)。中秋酥脆棗棗花柱頭在未展開時(shí)已具可授性，蕾扁期至萼片展平期柱頭可授性由弱增強(qiáng)，棗花柱頭可授性最強(qiáng)時(shí)為萼片展平期至花瓣展平期[22]。選擇處在花瓣展平期和雄蕊下垂期的棗花，通常能清晰地觀察到花粉在柱頭表面萌發(fā)以及伸入花柱道。受精成功是多數(shù)果樹獲得較高坐果率及產(chǎn)量的必要條件，但前提是花粉管能夠在花柱中順利生長(zhǎng)并穿過花柱在胚喪失活力之前到達(dá)胚珠[23]。研究發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)的棗花粉管大多集中在柱頭附近或者向下伸至花柱1/3 處，少部分花粉管或橫向生長(zhǎng)，或向上生長(zhǎng)，或扭曲、盤旋，未見有正常伸入花柱道1/2 處或進(jìn)入子房的情況。花粉粒多數(shù)能在柱頭表面萌發(fā)，大部分能進(jìn)入柱頭繼續(xù)生長(zhǎng)，在花柱道內(nèi)生長(zhǎng)過程中，有的逐漸停止生長(zhǎng)，因此在實(shí)驗(yàn)中只能觀察到少數(shù)花粉管到達(dá)子房。這可能是由于棗樹存在自交不親和現(xiàn)象，柱頭表面細(xì)胞產(chǎn)生胼胝質(zhì)，阻止花粉管延伸進(jìn)入花柱，或者生長(zhǎng)的花粉管頂端產(chǎn)生大量胼胝質(zhì)，形成胼胝質(zhì)塞從而抑制了花粉管向下生長(zhǎng)[8,14]。

4 結(jié) 論

1）選擇1、2 mol/L NaOH 溶液處理?xiàng)椈ɑㄖ?，都能取得良好的制片效果。在相同處理時(shí)間下，NaOH 溶液濃度越高，棗花軟化程度也越高；而NaOH 溶液濃度越高，所需軟化處理時(shí)間越短。

2）在軟化時(shí)間的選擇上，軟化0.5 h 就能取得較好的壓片效果，這能縮短試驗(yàn)需要的時(shí)間。在相同軟化方法處理的條件下，同一濃度水溶性苯胺藍(lán)溶液的染色時(shí)間增加，對(duì)花粉管的染色效果并沒有產(chǎn)生明顯的增強(qiáng)作用；而相同染色時(shí)間下，用高濃度的水溶性苯胺藍(lán)溶液對(duì)棗花進(jìn)行染色，染色效果比低濃度的好。