毛竹不同組織總RNA提取質(zhì)量的比較

方 婷，徐 倩，金愛武，，鄧 瑩，駱爭榮，朱強(qiáng)根

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 省部共建亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗室，浙江 杭州 311300；2.麗水學(xué)院 生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000）

毛竹Phyllostachys edulis為禾本科剛竹屬，單軸散生型常綠喬木狀竹類植物，地下由鞭根相連，屬于大型克隆植物，兼具筍、材兩用，是我國南方重要的森林資源之一，也是我國竹類資源中分布最廣的竹種[1]。以往對竹類植物的研究主要集中在生態(tài)功能、生理結(jié)構(gòu)形態(tài)、理化性質(zhì)和竹材的分類、生長繁殖以及生產(chǎn)加工利用等方面，并且已經(jīng)取得了一定的成果，同時竹類的遺傳改良研究也取得了一定進(jìn)展[2-4]。但是，竹類植物作為禾本科中木質(zhì)化程度高的喬木狀植物，其分子生物學(xué)研究嚴(yán)重滯后于同科的其他農(nóng)作物如水稻、小麥等。

植物組織中含有的酚類、糖類及其它次級代謝產(chǎn)物會造成提取出的RNA 降解、提取效率低或抑制后續(xù)操作的酶促反應(yīng)等[16]。目前雖已建立了許多較為成熟的分離RNA 的方法[17-18]，但由于不同植物或者同種植物不同部位組織中蛋白質(zhì)、多糖、酚類、脂類等成分含量的差異，不同部位組織的幼嫩程度不同，即使使用相同方法所得的結(jié)果也會大相徑庭[19]。毛竹不同組織中主要內(nèi)含物差異較大，例如毛竹葉片富含多糖物質(zhì)[20]，竹筍的主要成分為木質(zhì)素和纖維素[21]，種子中含有大量淀粉[22]。目前采用Trizol 法或者試劑盒方法提取毛竹葉片、花、筍等地上部分組織RNA 的技術(shù)已趨成熟，操作也相對簡易[8,23]，而針對毛竹地下部分生長、代謝異?；钴S的細(xì)根RNA 的提取方法以及毛竹種子RNA 的提取方法卻鮮有報道。因此，本研究以毛竹多個地上、地下組織及種子為材料，分別采用柱式Trizol法、Trizol 法、SDS 法、改良CTAB 法提取各組織的RNA，比較4 種方法提取的RNA 的質(zhì)量，篩選出不同組織最適的提取方法，為進(jìn)一步深入研究毛竹功能基因的作用機(jī)制、基因工程等奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料器皿

本試驗所用的毛竹細(xì)根（2年生）、冬筍于2019年10月—2020年1月采自麗水市遂昌縣，成熟葉、幼葉、枝采自麗水學(xué)院生態(tài)園林基地的毛竹2年生實(shí)生苗，氣霧根來自氣霧栽培的實(shí)生苗，種子購于四川眉山毛竹栽植基地。各個組織材料收集后立即放入液氮速凍，并保存于-70℃超低溫冰箱，備用。

RNA 提取中所用的溶液均用0.1%DEPC 處理過的水配制并高壓滅菌。研缽、玻璃器皿在使用之前180℃烘4～6 h，離心管、槍頭等塑料器材使用121℃高壓蒸汽滅菌40 min。RNA 電泳檢測均使用RNA 專用的電泳槽、梳子等，避免RNase的污染。

1.2 實(shí)驗方法

本研究采用了4 種RNA 提取方法，分別為柱式Trizol 法（上海生工公司）、Trizol 法、SDS 法、改良CTAB 法。

1.2.1 柱式Trizol 法

所用試劑盒為柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒（生工生物工程，上海），提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。1 mL Trizol 溶液中加入0.2 g 樣品粉末，充分混勻后，室溫放置5～10 min；加入0.2 mL 氯仿，劇烈震蕩30 s，室溫放置3 min；4℃，12 000 r/min 離心10 min；吸取上清液到新的離心管中，加入1/2 體積無水乙醇，混勻；將吸附柱放入收集管中，用移液器將上述混勻溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，靜置2 min，12 000 r/min 離心3 min，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，加入500 μL RPE solution，靜置2 min，12 000 r/min 離心30 s，倒掉收集管中廢液，重復(fù)該步驟一次；將吸附柱放回收集管中，10 000 r/min 離心2 min；之后吸附柱放入干凈的1.5 mL 離心管中，在吸附膜中央加入30 μL DEPC-treated 水，靜置5 min 后，12 000 r/min 離心2 min，所得到的RNA 溶液置于-70℃保存。

1.2.2 Trizol 法

1 g 樣品粉末中加入3 mL Trizol 裂解液（生工生物工程，上海），充分混勻，室溫放置5～10 min；加入0.6 mL 氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min。4℃，12 000 r/min 離心10 min；取上清液到新的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20 min；4℃，12 000 r/min 離心10 min，棄上清液；加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀。4℃，12 000 r/min 離心3 min 后，棄上清液。室溫干燥5～10 min；加入30 μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA，將所得到的RNA 溶液置于-70℃保存。

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1.2.3 SDS 法

參考Vineeta 等[24]用于提取毛竹節(jié)間RNA 的方法。樣品用液氮研磨，取1 g 樣品至4 mL 提取緩沖液和80 μL 巰基乙醇中，常溫孵育30 min，每5 min 渦旋一次；加入4 mL 混合液（V氯仿∶V異戊醇=24∶1）后渦旋5 min；室溫11 000～12 000 g 離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到新的10 mL 離心管中；添加等體積的混合液（V苯酚∶V氯仿∶V異戊醇=25∶24∶1），渦旋5 min；室溫12 000 g 離心10 min 后，吸取上清液轉(zhuǎn)移到新的10 mL 離心管中，重復(fù)此步驟直到觀察到干凈的界面（大約2 次）；加入等體積的混合液（V氯仿∶V異戊醇=24∶1）渦旋5 min；室溫12 000 g 離心10 min 后，轉(zhuǎn)移上清液到新的10 mL 離心管中，加入1/10 體積的3 mol NaOAc（pH 值5.2）和2.5 體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻后4℃放置2～3 h；4℃，12 000 g 離心30 min，棄上清液，重新加入750 μL DEPC 水，轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中，加入250 μL 8 mol 的LiCl，4℃過夜；次日，4℃，12 000 g 離心30 min，棄上清液；加入1 mL 2 mol 的LiCl，4℃，17 000 g 離心10 min，棄上清液，重復(fù)一次該步驟；用1 mL 70%乙醇洗滌沉淀后4℃12 000 g 離心5 min，棄上清液，再用1 mL 無水乙醇4℃ 12 000 g 離心5 min，棄上清液，室溫干燥5～10 min，最后加入30 μL DEPC 水溶解，所得到的RNA 溶液置于-70℃保存。

1.2.4 改良CTAB 法

在CTAB 方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，適用于提取富含多糖、多酚、色素以及單寧等次級代謝物的木本植物的改良CTAB 法，參照Chang 等[18]的方法，具體步驟如下：4 mL 的CTAB 提取液中加入80 μL 巰基乙醇，65℃水浴加熱；樣品用液氮研磨成粉末后，取1 g 加入到上述預(yù)熱的提取混合液中，渦旋混勻，65℃水浴10 min；冷卻后，加入4 mL 氯仿，渦旋混勻后室溫6 000 r/min 離心15 min；吸取上清液至新管中，再加入4 mL 氯仿，渦旋之后6 000 r/min 離心15 min；取上清液至新管中，加入600 μL LiCl（8 mol）4℃過夜；次日，4℃，6 000 r/min 離心30 min，倒掉液體后，加入65℃預(yù)熱的SSTE 溶液400 μL，反復(fù)吸打，將液體轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管里，加入等體積氯仿，混勻后10 000 r/min 離心10 min；取上清液并加入2 倍體積預(yù)冷的無水乙醇，混勻后在-70℃中放置30 min；之后在4℃下10 000 r/min 離心20 min；棄上清液，吸出殘余液體后室溫放置10 min，每管加30 μL DEPC 水溶解沉淀。

1.2.5 RNA 樣品質(zhì)量及純度檢測

取1 μL RNA 樣品，使用NanoDrop 2000 微量分光光度計檢測RNA 樣品的純度，分別記錄OD260/OD280以及OD260/OD230比值，如果OD260/OD280在1.8～2.0范圍內(nèi)，說明RNA 質(zhì)量良好，雜質(zhì)污染少。同時用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，通過28 S、18 S rRNA 條帶亮度判斷RNA 的完整性。1.2.6 DNA 的去除和cDNA 的合成

各方法提取的RNA 通過PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（Takara）去除基因組DNA 和反轉(zhuǎn)錄。去除DNA 的10 μL 反應(yīng)體系包括2 μL 的5×g DNA Eraser Buffer、1 μL的gDNA Eraser 以及1 μg 的RNA 樣品，用RNase free ddH2O 定容至10 μL?；旌戏磻?yīng)液置于42℃放置2 min 或者室溫5 min，得到的RNA 樣品用來進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。20 μL cDNA 合成反應(yīng)體系包括10 μL上述RNA溶液、1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I、1 μL RT Primer Mix、4 μL 5×PrimeScript Buffer 2和4 μL RNase Free ddH2O，于37℃放置15 min，85℃反應(yīng)5 s，最后保存于4℃。

1.2.7 定量PCR 檢測

獲得的cDNA 經(jīng)過稀釋進(jìn)行內(nèi)參基因PhPP2A的檢測，使用TB GreenPremix Ex TaqtTMⅡ（Tli RnaseH Plus）進(jìn)行Real Time PCR 反應(yīng)。25 μL 反應(yīng)體系包括12.5 μL 2×TB GreenPremix Ex TaqⅡ（Tli RnaseH Plus）、1 μL 的PCR Forward Primer（10 μmol）、1 μL PCR Reverse Primer（10 μmol）、2 μL cDNA 作為模板和8.5 μL 滅菌水。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃延伸30 s，讀板，循環(huán)40 次；95 ℃ 10 s，熔解曲線分析65 ℃到95 ℃，每5 s 升高1 ℃。其中內(nèi)參基因PhPP2A的選擇參考文獻(xiàn)[25]（FP：TGTTGGCGAGTCAGTTAGGTGTTG，RP：TCAAGTTGTTAGCGGCAGCATCTC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法對時間和試劑的消耗

運(yùn)用不同的方法對毛竹主要的組織進(jìn)行RNA提取，其中細(xì)根是指毛竹地下鞭節(jié)上的細(xì)根，是吸收營養(yǎng)的主要部分，氣霧根為氣霧栽培實(shí)生苗的根系，種子為去除種皮后的部分（圖1）。從操作難度、耗時、成本、RNA 質(zhì)量和產(chǎn)量5 個方面對4 種提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。由表1可知，每種方法各有優(yōu)勢，SDS 法所需試劑較為復(fù)雜繁多。試劑盒法耗時短且試劑準(zhǔn)備簡單，但與其他方法相比成本較高，尤其是當(dāng)樣品量大時所需要Trizol 試劑用量也相應(yīng)增加。

表1 4 種提取毛竹組織總RNA 方法的比較Table 1 Comparison of 4 methods for extracting RNA from moso bamboo

圖1 毛竹的不同組織Fig.1 Different tissues of moso bamboo

2.2 RNA 樣品的凝膠電泳分析

RNA 的凝膠電泳是判斷其質(zhì)量高低的一種重要方法，從18 S 和28 S rRNA 的完整性可以判斷RNA 有無降解及降解程度，同時還可以判斷有無DNA 污染。改良CTAB 法適用于提取毛竹各種組織的RNA，柱狀Trizol 法、Trizol 法和SDS法能從毛竹細(xì)根、葉片、枝以及筍等組織中提取出質(zhì)量相對較好的RNA，28 S rRNA 的亮度約是18 S rRNA 的2 倍，但對于種子、細(xì)根則提取效果不佳（圖2）。SDS 法提取成熟葉、種子的RNA 發(fā)生了不同程度的降解，條帶拖帶較為嚴(yán)重，其他組織18 S 和28 S rRNA 條帶較為清晰，部分樣品5 S rRNA 條帶不明顯。SDS 法包括一個額外的有機(jī)溶劑精制步驟，可去除內(nèi)源性酚類化合物和酸性酚（pH 值4.2），以穩(wěn)定提取緩沖液中的RNA。除此之外，還引入了2 次2 mol 氯化鋰的洗滌步驟，可以消除DNA 和多糖污染。因此，SDS 法提取的RNA 中的DNA 污染少，且A260/A280大多大于2，但SDS 法耗時較長，所需試劑較多，并易發(fā)生降解（圖2）。不同方法對于DNA 的去除程度不一樣，電泳圖顯示改良CTAB 法提取出來的RNA 中的DNA 污染較為明顯（圖2），而其余3 種方法可以較好地除去大部分的DNA，增加RNA 的純度。

圖2 各組織RNA 凝膠電泳Fig.2 RNA Gel electrophoresis of different tissues

2.3 RNA 濃度與純度分析

進(jìn)一步測定RNA 濃度，比較4 種方法提取的RNA 的質(zhì)量和純度。不同方法得到的RNA 濃度因材料而異，幼嫩的組織如幼葉、氣霧根、筍等濃度較高。Trizol法中的樣品受到5 S rRNA的影響，濃度偏大，尤其是在筍、氣霧根、成熟葉和幼葉中。SDS 方法中RNA 濃度雖然與其他3 種方法相比有顯著差異，但由于樣品發(fā)生降解，短片段增多導(dǎo)致濃度增大，其RNA 質(zhì)量不適合用于后續(xù)的分子生物學(xué)試驗。對于細(xì)根和種子樣品，改良CTAB法提取的RNA 濃度優(yōu)于其他方法，尤其是種子，與其他3 種方法相比均有顯著性差異（表2）。

表2 不同方法提取毛竹組織RNA 的濃度?Table 2 RNA concentrations by using different methods from tissue of moso bamboo

RNA 的純度可以通過A260/A280、A260/A230的比值判斷，一般情況下，A260/A280越接近2 則越純，低于1.8 可能存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)污染。柱式Trizol 法和Trizol 法提取細(xì)根和種子總RNA 的A260/A280低于1.8，其余均大于1.8，其中SDS 法和改良CTAB 法的A260/A280大多數(shù)在2～2.11 之間，表明RNA 純度較高，樣品中不含蛋白質(zhì)及苯酚的殘留或殘留少（圖3）。樣品中存在碳水化合物、鹽（胍鹽）、小分子物質(zhì)等污染物時，A230值會隨之增加，使用柱式Trizol 法和Trizol 法提取的RNA 中A260/A230均在2 以下，說明可能存在鹽（胍鹽）等殘留，其余兩種方法則大多在2 以上，進(jìn)一步說明RNA 純度較好（圖3）。

圖3 不同組織RNA 的質(zhì)量Fig.3 Quality of RNA in different tissues

綜合比較4 種總RNA 提取方法，柱式Trizol法和Trizol 試劑盒法所需樣品量少，提取總RNA的濃度相對較高，但不適用于對毛竹種子、細(xì)根的提??；SDS 法提取RNA 中DNA 污染少，但易降解且步驟繁瑣；改良CTAB 法適用于各組織，包括細(xì)根和種子，并且提取的總RNA 純度較好，但存在DNA 的污染。改良CTAB 法與其他3 種方法相比能更有效地提取RNA，且純度高，但DNA 雜質(zhì)較為明顯，表明DNA 處理不充分，后續(xù)通過對DNA 雜質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)處理后可以達(dá)到其他試驗的要求。

2.4 QRT-PCR 分析

樣品經(jīng)過去除DNA、反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，將得到的cDNA 樣品分別進(jìn)行2 倍、5 倍、10 倍稀釋，以PhPP2A為內(nèi)參基因進(jìn)行定量PCR，再以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、以測得的Cq值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從稀釋曲線上計算擴(kuò)增效率，其計算公式見文獻(xiàn)[26]，經(jīng)計算，擴(kuò)增效率約為102%，表明cDNA 樣品質(zhì)量較好（圖4a）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，每種方法所用組織樣品順序依次是細(xì)根、氣霧根、成熟葉、幼葉、枝、種子、筍，除了發(fā)生降解的樣品和部分種子樣品外，其他樣品的cDNA 均能擴(kuò)增出內(nèi)參基因PhPP2A片段，條帶單一清晰，長度約150 bp（圖4）。

圖4 內(nèi)參基因的凝膠成像Fig.4 Gelation of internal reference genes

反轉(zhuǎn)錄效率受到不同樣品中雜質(zhì)的影響，內(nèi)參基因的本底表達(dá)量也有所差異。氣霧根、成熟葉、幼葉、枝、筍等樣品的反轉(zhuǎn)效率較高，大多數(shù)的Cq值在21～22 之間。相比改良CTAB 法，其他3 種方法提取的細(xì)根樣品由于A260/A280比值均低于1.8，可能有蛋白等雜質(zhì)的影響，并且本身的濃度低，反轉(zhuǎn)錄效率較低，Cq值在25～28 之間，采用改良CTAB 法提取的細(xì)根RNA 在反轉(zhuǎn)錄相同量后，它的Cq值達(dá)到了23.07（表3）。毛竹種子淀粉含量多，RNA 提取難度較大，4 種方法中僅有改良CTAB 法適合提取，但純度不高，雜質(zhì)的影響使反轉(zhuǎn)錄后的Cq值為28.32，可用于一些常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗。

表3 不同提取方法各組織cDNA 內(nèi)參基因的Cq 值?Table 3 Cq value of internal reference gene in different methods and tissues

3 結(jié)論與討論

不同RNA 提取方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在物種或組織上的可適用性存在差異，選擇合適的方法是獲得高質(zhì)量RNA 的前提[27-29]。目前已經(jīng)總結(jié)出了很多科學(xué)高效的RNA 提取方法，基本原理是將植物組織細(xì)胞破碎以后，把RNA 與蛋白質(zhì)、糖類以及DNA 等雜質(zhì)分離出來，在實(shí)際操作中，可以根據(jù)實(shí)際情況，包括時間成本、所需試劑量以及不同組織的特點(diǎn)等進(jìn)行選擇。

Trizol 法是最常用的RNA 提取方法之一，柱式Trizol 法是在Trizol 的基礎(chǔ)上加入了吸附柱，利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來，把釋放出的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，這種載體只對核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力，對其他生化成分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則基本不吸附，最終把吸附在特異載體上的核酸洗脫下來，分離得到純化的核酸，使提取過程更加簡單易操作，這兩種方法耗時短，但可能會有胍鹽殘留，使A260/A230下降。同時這兩種方法有一定的局限性，不適用于一些多酚、糖類物質(zhì)比較高的組織，例如檀香心材、野生香蕉葉片等[30-31]，對毛竹木質(zhì)化程度較高的細(xì)根以及富含淀粉的種子等組織的提取效果也不好。本研究中兩種試劑盒法所提取的總RNA 產(chǎn)率低于另外兩種方法，與在菠蘿蜜中的研究結(jié)果一致[32]。SDS 法和改良CTAB 法適用于一些難提取的植物或組織，如木本植物的組織等[33]。本研究中的SDS 法參考毛竹節(jié)間RNA 提取方法，提取的RNA 濃度較高，但步驟繁瑣，耗時長，增加了RNase 污染機(jī)會，易發(fā)生RNA 降解。改良CTAB 法步驟較為簡單，對毛竹不同組織材料RNA 的提取均有不錯的效果，包括了細(xì)根和種子。從毛竹各組織的提取結(jié)果來看，改良CTAB法對各組織具有很好的適用性。

目前，關(guān)于毛竹的研究主要集中在葉片、花、筍等組織中，而一些木質(zhì)化程度較高的枝、根及淀粉含量高、堅硬的種子等還較少涉及，RNA 提取難度大可能是限制相關(guān)研究開展的一個重要因素。本研究中的4 種方法能夠提取出細(xì)根的RNA，但產(chǎn)率低，其中改良CTAB 法提取的RNA 反轉(zhuǎn)效率最高，Trizol 法次之。對于種子，改良CTAB 法提出的RNA 質(zhì)量最好，但反轉(zhuǎn)錄效率不高，可用于一般的分子生物學(xué)實(shí)驗。本研究可以為后續(xù)開展針對根系、葉片、種子等方面的研究提供一定的技術(shù)支持，但局限在于僅涉及到了較為常用的4種提取方法，對于試劑盒法不同公司產(chǎn)品的提取效率也會有所差異，因此在下一步研究中，可以通過多次優(yōu)化、合理組合等方式，進(jìn)一步地探索出提取毛竹各組織RNA 的最適方案，為加快竹類植物分子生物學(xué)研究提供理論參考。