Tfh細胞相關(guān)作用分子在EAE中的調(diào)節(jié)作用

沈新月 石鄭浩 任安艷 葛汝麗 范雪麗

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的與免疫相關(guān)的慢性炎性脫髓鞘疾病，其具體發(fā)病機制尚不明確，可能與感染、自身免疫反應(yīng)、遺傳與環(huán)境因素有關(guān)。既往研究認(rèn)為MS是自身反應(yīng)性T細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病[1]，但越來越多研究表明體液免疫在MS疾病的形成中不可或缺[2]。濾泡輔助性T細胞(Tfh)是一種重要的輔助B細胞的CD4+Th細胞亞型[3]，其定位于生發(fā)中心(germinal center，GC)，分泌白細胞介素21(interleukin21，IL-21)，表達程序性死亡因子-1(programmed death-1，PD-1)、可誘導(dǎo)的共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)、轉(zhuǎn)錄因子B細胞淋巴6(B cell lymphoma 6，Bcl-6)等[4]。Tfh細胞參與體液免疫反應(yīng)，對GC形成、B細胞在GC親和力的成熟、高親和力抗體和記憶性B細胞的產(chǎn)生至關(guān)重要[5]。Tfh細胞功能失調(diào)可導(dǎo)致自身免疫性疾病、免疫缺陷病、腫瘤等多種疾病[6]。該研究通過觀察實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠腦、脊髓PD-1、ICOS、IL-21的表達情況，探討Tfh細胞相關(guān)作用分子在MS/EAE中的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 動物選擇SPF級6～8周齡C57BL/6雌性小鼠40只，體重(18±2)g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物許可證號：SCXK(魯)20140007。置SPF級、恒溫(20～24℃)、恒濕(40%～70%)環(huán)境飼養(yǎng)，自由進食、飲水。所有操作均符合濱州醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會規(guī)定。將小鼠隨機分為對照組和EAE模型組，各20只。剔除死亡及造模失敗小鼠，最終對照組18只(死亡2只，余18只未出現(xiàn)癥狀)、EAE模型組17只(死亡2只，1只未出現(xiàn)明顯癥狀)入組。

1.2 主要試劑及儀器髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG)35-55肽段購自美國GenScript公司，完全福氏佐劑(FAC)購自美國Sigma Aldrich公司，滅活結(jié)核分枝桿菌(H37Ra)購自美國BD Difco公司，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購自美國Gibco公司，百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)購自德國Merck Millipore公司，HE染色試劑盒購自Solarbio公司，PCR試劑盒購自Takara公司，IL-21、PD-1、ICOS抗體購自Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1EAE模型制備：配制MOG35-55肽段溶液(溶于PBS，濃度為2 mg/mL)、結(jié)核分枝桿菌溶液(加至FAC中，濃度為8 mg/mL)、PTX溶液(溶于PBS，濃度為300 ng/mL)。將MOG35-55肽段溶液與結(jié)核分枝桿菌溶液等比例混合，充分乳化MOG抗原，給予小鼠200 μg皮下多點注射，并于注射后及48 h腹腔注射PTX溶液。對照組以等量PBS代替MOG35-55肽段溶液，余操作步驟同模型組。

1.3.2EAE小鼠評分：隨機取對照組小鼠6只，EAE模型組5只，于主動免疫后的第1天至第29天，每天清晨同一時間對小鼠稱重并進行臨床表現(xiàn)評分。EAE小鼠評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，正常；1分，尾部無力，不能抬起或步態(tài)蹣跚；1.5分，尾部無力伴蹣跚步態(tài)；2分，除尾部無力外，可見單后肢癱或雙后肢不全癱；2.5分，小鼠單后肢全癱伴對側(cè)后肢不全癱；3分，雙后肢全癱；4分，雙后肢癱且伴前肢單肢或雙肢受累；5分，死亡。

1.3.3組織切片的制備：主動免疫后第21天(發(fā)病高峰期)，隨機取EAE模型組及對照組小鼠各6只，將小鼠深度麻醉，用恒流泵灌流，觀察小鼠肝臟顏色，變至灰白色時改用4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛灌注，待小鼠全身僵硬、肝臟質(zhì)地堅韌，停止灌流。立即取其腦、脊髓組織，進行固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，制作石蠟切片備用，片厚4～6 μm，用于HE染色和免疫組化檢測。

1.3.4HE染色：依照HE染色盒試劑說明書將腦、脊髓石蠟切片進行脫蠟水化、染色、脫水、透明、中性樹膠封固，置光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠腦、脊髓組織的炎癥細胞浸潤情況，并采集圖片。

1.3.5免疫組化：將上述制備好的腦、脊髓石蠟切片進行脫蠟水化，高壓修復(fù)后將玻片浸泡至3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2溶液內(nèi)，避光浸泡15 min，清洗玻片。用免疫組化筆劃定組織范圍，玻片上滴加山羊血清，置37℃溫箱內(nèi)封閉30 min，清洗玻片。滴加Ⅰ、Ⅱ抗，置37℃溫箱內(nèi)分別放置2 h、30 min，清洗玻片。滴加DAB顯色盒中的試劑至玻片顯色，經(jīng)染色、分化、脫水、封片等步驟，置鏡下觀察ICOS、IL-21、PD-1的表達情況。顯微鏡下細胞核呈藍色，腦、脊髓組織ICOS、IL-21、PD-1陽性表達呈棕褐色，采用IPP6.0軟件定量分析其陽性染色相應(yīng)累積光密度值(IOD)。

1.3.6實時熒光定量PCR檢測：將發(fā)病高峰期(造模后第21天)的剩余EAE小鼠6只及對照組6只斷頭處死，置冰上快速取腦組織。根據(jù)PCR試劑盒(含GAPDH內(nèi)參、PD-1、ICOS、IL-21引物)說明書進行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、擴增等步驟，采用2-△△T法定量分析PD-1、ICOS、IL-21 mRNA水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩均數(shù)間比較采用t檢驗，多組均數(shù)間比較采用重復(fù)測量的單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，采用秩和檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

注：EAE：實驗性自身免疫性腦脊髓炎，圖2～5，表1～2同；與EAE模型組比較，aP<0.05圖1 兩組小鼠主動免疫后不同時間體重變化

2 結(jié)果

2.1 體重變化結(jié)果見圖1。對照組小鼠隨時間延長體重增加(F=89.833，P=0.000)；EAE模型組免疫后不同時間點間體重變化有統(tǒng)計學(xué)差異(F=174.159，P=0.000)，自主動免疫第13天時體重下降，發(fā)病高峰(主動免疫后第21天下降最明顯，之后體重逐漸增加(均P<0.05)。與對照組比較，EAE模型組小鼠主動免疫后1～3 d體重比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，從第4天開始其體重降低(均P<0.05)。

2.2 EAE小鼠行為學(xué)評分EAE模型組小鼠免疫后不同天數(shù)間的癥狀評分比較有統(tǒng)計學(xué)差異(F=80.860，P=0.000)；對照組小鼠不同天數(shù)之間的評分無統(tǒng)計學(xué)差異(F=0，P=1)。EAE模型組小鼠于主動免疫后第13天開始發(fā)病，第21天癥狀評分達高峰，隨后癥狀逐漸好轉(zhuǎn)(均P<0.05)。對照組小鼠未出現(xiàn)任何癥狀，評分均為0分。EAE模型組主動免疫后 1～12 d行為學(xué)評分與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)變化(P>0.05)，第13～29天行為學(xué)評分高于對照組(均P<0.05)。結(jié)果見圖2。

注：與對照組比較，aP<0.05圖2 各組小鼠不同時間臨床癥狀評分變化

2.3 病理學(xué)改變對照組小鼠腦、脊髓組織中無明顯炎性細胞浸潤；EAE模型組小鼠腦、脊髓組織可見大量炎性細胞浸潤，小血管周圍可見炎性細胞浸潤，可見袖套樣改變。結(jié)果見圖3。

2.4 免疫組化EAE模型組小鼠腦、脊髓組織中IL-21、ICOS表達較對照組增高，而PD-1表達降低(P<0.05)。結(jié)果見表1、圖4、圖5。

圖4 兩組小鼠腦組織IL-21、ICOS及PD-1表達(免疫組化，×20)

圖5 兩組小鼠脊髓IL-21、ICOS及PD-1表達(免疫組化，×20)

表1 兩組小鼠腦和脊髓組織ICOS、IL-21、PD-1表達累積光密度值比較

2.5 實時熒光定量PCR與對照組比較，EAE模型組腦組織PD-1 mRNA相對表達量降低，而ICOS、IL-21 mRNA相對表達量增高(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 兩組小鼠腦組織PD-1、ICOS、IL-21 mRNA相對表達水平比較

3 討論

MS是一種累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的與免疫相關(guān)的慢性炎性脫髓鞘疾病，表現(xiàn)為脫髓鞘、軸突損傷、炎癥細胞浸潤和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增生[7]。該研究Tfh細胞在體液免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，能夠輔助B細胞分化成漿細胞和記憶性B細胞。Tfh細胞表達的ICOS、PD-1及其分泌的IL-21，對Tfh細胞和B細胞的活化、分化和存活至關(guān)重要。Tfh細胞及其相關(guān)分子的異常可導(dǎo)致致病性自身抗體的產(chǎn)生，繼而引發(fā)自身免疫疾病。Rikke等[9]研究表明，MS患者中的Tfh細胞活性增強。作者團隊既往研究表明MS、NMOSD患者外周循環(huán)中的記憶性Tfh細胞數(shù)量增多[10]，可能參與疾病的發(fā)病機制。

該研究結(jié)果顯示EAE小鼠腦、脊髓組織Tfh細胞表達的ICOS水平增高。這與Guo等[11]研究結(jié)果相一致。Guo等[11]研究發(fā)現(xiàn)，EAE小鼠脊髓組織ICOS水平表達增高，且在發(fā)病高峰期達高峰。推測ICOS水平升高可能對MS/EAE的發(fā)病有促進作用。Tfh細胞表達的ICOS與其配體(ICOSL)結(jié)合，可促進Tfh細胞和GC的形成，阻斷ICOS-ICOSL通路可能抑制Tfh細胞的功能，因此抗ICOS/ICOSL單抗治療可能成為難治性或嚴(yán)重自身免疫性疾病的潛在治療辦法[12]。

該研究結(jié)果顯示EAE小鼠腦、脊髓組織IL-21表達水平較對照組高。IL-21在GC B 細胞的增殖、生存和分化以及Tfh細胞的生存中發(fā)揮主要作用[13]，也是最有效促進漿細胞分化的細胞因子[14]。在MS患者的活動性病灶中，分泌IL-21的CD4+T細胞可進一步促進Tfh細胞的活化[15]。Gharibi等[16]亦報道了MS患者炎性細胞浸潤病變部位的淋巴細胞中IL-21呈高表達。推測IL-21水平的升高可能與EAE/MS的嚴(yán)重程度和進展呈正相關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，破壞BALB/c小鼠PD-1的編碼基因可致自身免疫性心臟?。磺贸齈D-1的C57BL/6小鼠可出現(xiàn)漸進性關(guān)節(jié)炎、狼瘡樣腎小球腎炎以及急性自身免疫性糖尿病[17-19]。Haile等[20]研究表明PD-1缺陷的EAE小鼠癥狀更為嚴(yán)重。該研究結(jié)果顯示，EAE小鼠腦、脊髓組織PD-1的表達水平較對照組小鼠降低。因此作者推測，PD-1在MS/EAE的發(fā)病中起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，并可能成為治療靶點。

綜上所述，該研究結(jié)果顯示，EAE模型組小鼠腦、脊髓組織IL-21、ICOS及其mRNA表達較對照組增高，而PD-1及其mRNA表達低，提示上述分子可能參與了EAE的發(fā)病，并可能成為治療疾病的新靶點。有關(guān)Tfh細胞及其相關(guān)作用分子在MS/EAE中的確切作用尚需進一步研究，為臨床治療提供更充分的依據(jù)。