‘鳳丹’種子發(fā)育及其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量和相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化

鄒雨婷，朱銘瑋, 李永榮, 翟金庭，李淑嫻*

(1. 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2. 南京綠宙薄殼山核桃科技有限公司，江蘇 南京 210014；3.鹽城林場(chǎng)，江蘇 鹽城 224136)

‘鳳丹’(Paeoniaostii‘Feng Dan’)曾被稱為“鐵桿莊稼”[1]，具有結(jié)實(shí)率高、適應(yīng)能力強(qiáng)和可抵御風(fēng)蝕等特點(diǎn)[2]，其種子還具有含油率高、油品質(zhì)好的特點(diǎn)。牡丹籽油中不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)92.60%[3]，富含人體必需脂肪酸——亞油酸和α-亞麻酸[4]；不僅適于食用，還是一種重要的工業(yè)原材料[5]。此外，‘鳳丹’不僅可作為經(jīng)濟(jì)作物進(jìn)行種植，還可應(yīng)用于園林造景[6]。因此，‘鳳丹’是一種中國所特有的集生態(tài)、經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值為一體的優(yōu)良木本油料作物。目前，不少學(xué)者主要在牡丹(P.suffruticosa)籽油的提純方法、油脂成分分析、籽油抗氧化活性、籽粒儲(chǔ)藏等方面開展了系列研究[7-10]，在‘鳳丹’的育種、栽植管理和種子休眠等方面研究也進(jìn)展迅速[11-13]，對(duì)‘鳳丹’種子發(fā)育方面的研究主要集中在脂肪酸積累方面，但缺乏主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)間轉(zhuǎn)化關(guān)系的相關(guān)研究[14-16]。陳虹等[17]在核桃(Juglansregia)種子發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)油脂的累積與蛋白質(zhì)含量的增加呈正相關(guān)關(guān)系，可能會(huì)存在能源競(jìng)爭(zhēng)的現(xiàn)象，但油茶(Camelliaoleifera)[18]種子中油脂與蛋白質(zhì)的積累卻呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。由此可以看出，不同植物中，油脂積累與蛋白質(zhì)合成也存在不同的關(guān)系。

本研究以油用牡丹中的‘鳳丹’為材料，在觀察其果莢、種子發(fā)育過程中形態(tài)變化的同時(shí)，研究此過程中主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及其相關(guān)酶活性的變化，初步探究油脂合成與碳水化合物之間的關(guān)系，進(jìn)一步揭示油脂累積的規(guī)律，以期找到影響‘鳳丹’種子油脂合成的關(guān)鍵時(shí)期，為‘鳳丹’的科學(xué)栽培及籽油的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)所用果莢及種子采自南京綠宙油用牡丹研究所(118°34′～119°03′E，32°11′～32°27′N)6年生‘鳳丹’結(jié)實(shí)母樹，于盛花期選取生長(zhǎng)正常、株型一致(每株高度基本一致且均含5個(gè)分枝)、花朵大小一致且同天開放的植株掛牌，做好標(biāo)記?！P丹’通常在4月初開始開花，果期在4月下旬至8月上旬，花后0～45 d為授粉成功、胚珠形成階段[19]。本研究主要在‘鳳丹’蓇葖果及種子進(jìn)入快速生長(zhǎng)期即花后45、65、85、95、105和115 d后進(jìn)行采樣，隨機(jī)選取一定數(shù)量的新鮮蓇葖果和種子用于形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察、測(cè)定和含水率測(cè)定。其余種子密封于自封塑料袋中，貯藏在-80 ℃冰箱中以供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量以及相關(guān)酶活性測(cè)定，其中，除粗脂肪含量測(cè)定以冷凍干燥后的種子為材料外，其余均采用貯藏于-80 ℃冰箱中的新鮮蓇葖果和種子為材料。

1.2 指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 發(fā)育過程中蓇葖果形態(tài)觀察

隨機(jī)選取各發(fā)育階段中具典型特征的完整聚合蓇葖果，觀察其顏色的變化。

1.2.2 種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化觀察

隨機(jī)選取各發(fā)育階段的種子10粒，縱向切開，用OLYMPUS SZX16體視顯微鏡(奧林帕斯公司，日本)對(duì)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行形態(tài)觀察。

1.2.3 蓇葖果和種子橫、縱徑測(cè)定

于每個(gè)發(fā)育階段隨機(jī)取5個(gè)新鮮采集的聚合蓇葖果，生物學(xué)重復(fù)3次，分別用游標(biāo)卡尺測(cè)量單個(gè)蓇葖果的橫徑及縱徑，精確到0.01 mm。剝開果莢，得到種子，隨機(jī)取30粒種子，生物學(xué)重復(fù)3次，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量種子的橫徑及縱徑，精確到0.01 mm。

1.2.4 含水率測(cè)定

隨機(jī)選取每個(gè)發(fā)育階段的種子20粒，重復(fù)3次，將其切成小于2 mm的小塊，稱其鮮質(zhì)量，精確至0.001 g。將切成小塊的種子置于-80 ℃冰箱中預(yù)冷2 h后取出，再將其置于初始溫度為-76 ℃，壓力為0.001 MPa的Alpha 1-4 LOC-1冷凍干燥機(jī)(Martin Christ，德國)中干燥直至樣品達(dá)到質(zhì)量恒定。最后將樣品放置在裝有硅膠的干燥器中。待樣品恢復(fù)至室溫后再次稱質(zhì)量，精確到0.001 g，以確定其干質(zhì)量。按下式計(jì)算每個(gè)發(fā)育階段種子的含水率。

1.2.5 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量測(cè)定

采用索氏提取法[20]測(cè)定粗脂肪含量，具體為：將各發(fā)育階段干燥后的樣品研磨成粉末，稱取1.0 g粉末(M0)，用脫脂濾紙(已于105 ℃下烘至質(zhì)量恒定)包裹后稱質(zhì)量，記為M1(精確到0.001 g)。用石油醚(30～60 ℃)對(duì)各發(fā)育階段的種子樣品采用索式抽提法提取籽油。抽提完成后，待石油醚完全揮發(fā)，再次稱質(zhì)量，記為M2(精確到0.001 g)，生物學(xué)重復(fù)3次。用相對(duì)于1.0 g初始干質(zhì)量的質(zhì)量(M0)損失百分?jǐn)?shù)表示樣品的粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算公式如下：

可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法[21]，粗淀粉含量測(cè)定采用高氯酸水解-蒽酮比色法[21]，可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)比色法[22]。以鮮質(zhì)量為單位計(jì)算各指標(biāo)的含量。

1.2.6 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)酶活性測(cè)定

分別利用乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)分光光度法試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，中國)和植物磷脂酸磷酸酯酶(PPase)ELISA 試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，中國)測(cè)定不同發(fā)育階段種子中油脂合成ACCase和PPase相關(guān)酶的活性。采用3，5-二硝基水楊酸比色法[23]和福林-酚比色法[24]分別測(cè)定淀粉水解相關(guān)酶-總淀粉酶和蛋白質(zhì)分解相關(guān)酶-總蛋白酶的活性，以鮮質(zhì)量為單位計(jì)算各酶的活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表制作，同時(shí)利用IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)及Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘鳳丹’發(fā)育過程中形態(tài)的變化

2.1.1 蓇葖果及種子發(fā)育過程中外觀形態(tài)及大小的變化

花后45～85 d時(shí)，‘鳳丹’蓇葖果果皮由青綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色，也稱綠熟期。隨著蓇葖果的不斷成熟，果皮由黃綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色(褐熟期)。除此之外，花后95 d時(shí)，少量果莢尖端沿著腹縫線開始開裂，直至花后115 d時(shí)，蓇葖果完全成熟，果莢尖端呈現(xiàn)灰褐色，且向下彎曲，并沿著腹縫線向基部開裂，露出黑褐色的種子。

每個(gè)發(fā)育階段的蓇葖果及種子橫、縱徑的變化如表1所示。花后45～85 d期間(綠熟期)，蓇葖果進(jìn)入快速膨大期，橫徑和縱徑快速增長(zhǎng)，分別顯著增長(zhǎng)了12.7%和19.9%；而花后95～115 d期間(褐熟期)，蓇葖果橫徑間的變化差異不顯著，但縱徑卻呈減小趨勢(shì)，花后105、115 d時(shí)的縱徑相同，兩個(gè)階段均較花后95 d時(shí)顯著減少了3.1%。

表1 ‘鳳丹’蓇葖果及種子發(fā)育過程中的橫、縱徑變化Table 1 Changes of horizontal and vertical diameters during the development of Paeonia ostii ‘Feng Dan’ follicles and seeds

種子的橫、縱徑變化趨勢(shì)與蓇葖果大致相同，于花后95 d時(shí)，分別達(dá)到此次測(cè)定最大值8.4 mm和11.1 mm，較45 d時(shí)分別顯著增加了33.3%和32.1%。此后橫徑變化不顯著，而花后115 d時(shí)的縱徑較95 d時(shí)顯著減少了10.9%。

2.1.2 ‘鳳丹’種子發(fā)育過程中內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察

花后45 d(圖1A)的‘鳳丹’種子，外種皮較薄，呈淡黃色，與珠被組織較易剝離；種子內(nèi)部主要為珠被組織和胚乳組織。其中與種皮相鄰的珠被組織較幼嫩，呈半液態(tài)；中央的胚乳組織則為透明狀的液體，汁液豐富(圖1A中藍(lán)色圈內(nèi)所示)。此時(shí)，珠孔端的胚僅為極小的一個(gè)點(diǎn)?；ê?5～85 d(圖1B、1C)時(shí)，外種皮變厚，種皮、種仁變?yōu)槿榘咨?；珠被組織逐漸變?。稽c(diǎn)狀胚開始初具雛形；合點(diǎn)端出現(xiàn)了一小塊黑色區(qū)域(圖1C黑色箭頭所示)；花后95～115 d(圖1D、1E、1F)時(shí)，種皮逐漸向黑棕色轉(zhuǎn)變，珠被組織消失，胚乳逐漸變硬，并在中央處出現(xiàn)裂縫；胚根極短，子葉呈卵圓形，位于胚乳中央細(xì)長(zhǎng)線條處。

A-F均為‘鳳丹’種子的縱切面，觀測(cè)時(shí)間分別為花后45、65、85、95、105、115 d。 A-F are the longitudinal anatomies of Paeonia ostii seeds, and the observation time is 45, 65, 85, 95, 105, 115 days after flowering. I. 珠被組織 integument；En. 胚乳endosperm；Em. 胚 embryo；T. 種皮 testa；Ch. 合點(diǎn)chalaza。黑色箭頭表示合點(diǎn)端出現(xiàn)了一小塊黑色區(qū)域，藍(lán)色圈出的部分表示胚乳部分。The black arrow indicates a black area at the chalaza and the part circled in blue represents the endosperm.圖1 ‘鳳丹’種子發(fā)育過程中的體視顯微鏡觀察Fig.1 Stereoscopic microscope images of Paeonia ostii ‘Feng Dan’ seeds development

2.2 ‘鳳丹’種子發(fā)育過程中含水率的變化

‘鳳丹’種子的含水率在整個(gè)發(fā)育階段處于持續(xù)失水趨勢(shì)(圖2)，花后95 d時(shí)，含水率較45 d時(shí)顯著下降了27.8%；花后95～115 d期間，含水率下降速度減緩，花后115 d時(shí)的含水率較95 d時(shí)僅下降了4.9%。但即使在完全成熟(花后115 d)時(shí)，‘鳳丹’種子中的含水率仍然較高，為41.6%。

圖2 ‘鳳丹’種子發(fā)育過程中含水率的變化Fig.2 Changes of water content during Paeonia ostii Feng Dan’ seeds development

2.3 種子發(fā)育過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化

不同發(fā)育階段‘鳳丹’種子中可溶性糖、粗淀粉、可溶性蛋白和粗脂肪含量的變化規(guī)律不盡相同(圖3)。種子發(fā)育初期(花后45～85 d)可溶性糖含量快速下降，并于花后85 d達(dá)到本次測(cè)定的最小值，較45 d時(shí)顯著下降了44.5%；發(fā)育中期(花后85～95 d)可溶性糖快速積累，隨后再次下降并趨于穩(wěn)定。粗淀粉含量變化趨勢(shì)與可溶性糖大致相同，也是在花后45～85 d時(shí)呈下降趨勢(shì)，花后85 d時(shí)的粗淀粉含量較45 d時(shí)顯著下降了73.1%；種子發(fā)育中后期(花后85～105 d)，粗淀粉含量呈快速上升趨勢(shì)，花后105 d時(shí)的含量較85 d顯著增加了187.2%，發(fā)育末期(花后105～115 d)時(shí)其含量達(dá)至穩(wěn)定狀態(tài)?？扇苄缘鞍缀康淖兓厔?shì)和前兩種物質(zhì)有所不同，花后45～85 d時(shí)，其含量顯著增加，花后85 d時(shí)較45 d大幅增加了294.1%；而在發(fā)育中期，可溶性蛋白含量快速下降；花后105～115 d時(shí)，可溶性蛋白含量波動(dòng)較小。

圖3 ‘鳳丹’種子發(fā)育過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 The dynamic changes of nutrients during Paeonia ostii ‘Feng Dan’ seeds development

粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)在整個(gè)種子發(fā)育階段呈不斷上升趨勢(shì)，變化趨勢(shì)大概分為兩個(gè)階段：花后45～85 d，種子含油率迅速增加，從本次測(cè)定最低值13.8%顯著上升到30.1%；隨后，含油率增加趨勢(shì)變緩，花后105 d時(shí)的含油率較85 d僅上升了1.3%；花后105～115 d期間，種子含油率的增加速度又略有上升，最終于花后115 d時(shí)，達(dá)到本次測(cè)定最大值33.1%。

2.4 種子發(fā)育過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)酶活性的變化

總淀粉酶和總蛋白酶分別具有水解淀粉和蛋白的作用?！P丹’種子發(fā)育過程中，這兩種酶的活性處于不斷變化中(圖4A)?；ê?5～65 d即種子發(fā)育初期，總淀粉酶活性顯著上升，從本次測(cè)定最低值53.2 μg/(mg· min)上升至196.4 μg/(mg· min)，顯著增加了269.2%；花后65～85 d時(shí)總淀粉酶活性略有上升，但變化不顯著；種子發(fā)育的中后期(85～105 d)，總淀粉酶活性呈顯著下降的趨勢(shì)，花后105～115 d期間，其活性差異不顯著。

圖4 ‘鳳丹’種子發(fā)育過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)酶活性的變化Fig.4 Changes of nutrient-related enzymes activities during Paeonia ostii ‘Feng Dan’ seeds development

種子內(nèi)總蛋白酶活性的變化趨勢(shì)與淀粉酶的變化趨勢(shì)大致相反(圖4A)?；ê?5～65 d期間，種子總蛋白酶活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，花后65 d時(shí)的總蛋白酶活性較45 d時(shí)顯著下降了70.4%；花后65～85 d期間，酶活性差異不顯著；花后85～95 d時(shí)，總蛋白酶活性則又重新呈顯著上升的趨勢(shì)，花后95 d時(shí)酶的活性較85 d顯著增加了185.3%；隨后(花后95～115 d)酶活性呈線性下降趨勢(shì)，且各時(shí)間點(diǎn)間差異顯著，花后115 d時(shí)的總蛋白酶活性較95 d下降了36.1%。

‘鳳丹’種子發(fā)育過程中ACCase和PPase活性的變化趨勢(shì)大致相似(圖4B)?；ê?5～85 d期間，ACCase和PPase的活性均呈上升趨勢(shì)，85 d時(shí)酶活性較45 d分別顯著上升了164.0%和82.4%；花后85～95 d，ACCase活性顯著下降，從52.8 μmol/(g·h)下降至26.3 μmol/(g·h)；PPase在85～105 d期間顯著下降，活性由34.3 U/L顯著下降至21.0 U/L；后期這兩個(gè)酶的活性再次上升，特別是ACCase，115 d時(shí)活性較95 d上升了183.7%；PPase活性則在種子發(fā)育末期(花后105～115 d)略有上升，但差異不顯著。

2.5 種子發(fā)育過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量及其酶活性的相關(guān)性分析

‘鳳丹’種子發(fā)育過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量及其相關(guān)酶活性之間存在一定的相關(guān)性(表2)。其中，可溶性糖與粗淀粉含量呈顯著正相關(guān)(P< 0.05)，而可溶性蛋白與粗淀粉含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P< 0.05)，與可溶性糖含量之間則呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P< 0.01)，與粗脂肪含量之間也呈正相關(guān)關(guān)系且達(dá)到極顯著程度(P< 0.01)；總淀粉酶活性與總蛋白酶活性之間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P< 0.05)，可溶性糖含量與總蛋白酶活性之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系(P< 0.05)；磷脂酸磷酸酯酶活性與粗淀粉之間存在極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P< 0.01)，與總淀粉酶活性則呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)關(guān)系(P< 0.01)。據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，粗脂肪與含水率之間也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系且達(dá)到極顯著程度(P< 0.01)，相關(guān)系數(shù)為-0.93。

表2 ‘鳳丹’種子發(fā)育過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量及其酶活性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of nutrients content and nutrient-related enzymes activities during Paeonia ostii‘Feng Dan’ seed development

3 討 論

3.1 ‘鳳丹’種子生長(zhǎng)發(fā)育特性與栽培管理的關(guān)系

‘鳳丹’種子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累、轉(zhuǎn)化與植株的光合作用及其栽培管理存在著密不可分的關(guān)系?；ê?5～65 d時(shí)，通過體視顯微鏡觀察到，半液態(tài)化珠被組織的面積不斷縮小，胚乳組織則由液態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，并且面積在不斷增加，這與董兆磊[19]觀察到的‘鳳丹’種子胚乳的發(fā)育以及紫斑牡丹(P.rockii)[25]胚乳發(fā)育觀察到的結(jié)果基本相同，說明胚乳從珠被等母體細(xì)胞中吸收的可溶性糖和粗淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要應(yīng)用于自身形態(tài)建成，此時(shí)期也是種子胚乳固態(tài)化的重要時(shí)期。花后45～65 d，蓇葖果和種子的橫、縱徑處于大幅增長(zhǎng)狀態(tài)，是蓇葖果和種子的膨大期。此時(shí)，‘鳳丹’植株不僅對(duì)水分的需求量較大，還對(duì)土壤中磷元素需求較高，應(yīng)盡量保持水肥供應(yīng)，有助于種子中光合產(chǎn)物的運(yùn)輸以及碳水化合物的代謝，保證種子的充分發(fā)育，這也從側(cè)面反映了‘鳳丹’生產(chǎn)中多在花后半個(gè)月左右開展施用磷肥管理的必要性和科學(xué)性。

花后65～85 d時(shí)，種子內(nèi)的點(diǎn)狀胚逐漸明顯，珠被組織繼續(xù)退化直至消失，胚乳逐漸硬質(zhì)化。此階段中，蓇葖果和種子的橫、縱徑仍在不斷增加，種子內(nèi)的可溶性糖和粗淀粉含量下降顯著，而油脂和可溶性蛋白處于顯著上升階段，此時(shí)需適量施用氮肥促進(jìn)植株內(nèi)葉綠素的形成，從而促進(jìn)光合作用的進(jìn)行，以達(dá)到“以氮增碳”的作用。與此同時(shí)，適當(dāng)減少磷肥的施用、增施鉀肥，可提高糖類的積累、轉(zhuǎn)化及運(yùn)輸。此時(shí)植株對(duì)水分要求相對(duì)敏感，以淺澆灌為最佳，為蓇葖果的持續(xù)膨大以及種子內(nèi)部構(gòu)建提供正常的水分供給。

花后85～115 d時(shí)，隨著極短的胚根以及卵圓形子葉的不斷發(fā)育完全，胚乳與種皮的接觸愈加緊密，中央位置也逐漸開始形成一道長(zhǎng)條形的空隙，其作用主要是便于種子萌發(fā)時(shí)子葉的伸展[26]，種子內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐步構(gòu)建完成。在此階段中，蓇葖果尖端逐漸褐化、開裂。蓇葖果和種子的橫、縱徑基本保持穩(wěn)定甚至出現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中蓇葖果縱徑在花后85 d時(shí)就開始稍有下降，花后105 d時(shí)已較最大值下降顯著，明顯早于其他測(cè)定指標(biāo)，而造成這一變化的原因可能是，隨著蓇葖果的成熟以及脫水現(xiàn)象的產(chǎn)生，使得果皮皺縮，導(dǎo)致蓇葖果尖端向下彎曲。因此，此階段可以適當(dāng)減少水分供給，使土壤處于較干燥狀態(tài)，與此同時(shí)，花后85～95 d時(shí)，可溶性糖和粗淀粉含量顯著上升，可再次追施少量磷肥，促進(jìn)糖分和淀粉的代謝，為油脂和蛋白的積累提供充足的能源，利于提高種子的品質(zhì)。

3.2 ‘鳳丹’種子發(fā)育過程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量間的轉(zhuǎn)化

3.2.1 ‘鳳丹’種子發(fā)育過程中主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量與其相關(guān)酶活性的關(guān)系

種子發(fā)育初期，光合作用產(chǎn)生的物質(zhì)以可溶性糖和粗淀粉等碳水化合物形式儲(chǔ)藏在種子中。隨著種子的不斷發(fā)育，碳水化合物進(jìn)行代謝及轉(zhuǎn)化，種子中的蛋白和油脂不斷積累，而淀粉、蛋白質(zhì)和粗脂肪在代謝過程中都必須有酶的參與[27]。其中，總淀粉酶主要是將淀粉水解成葡萄糖等物質(zhì)，為其他物質(zhì)的合成提供原料；當(dāng)總淀粉酶活性增大時(shí)，將更多的粗淀粉水解，從而使粗淀粉的含量呈下降趨勢(shì)；反之，當(dāng)總淀粉酶活性降低時(shí)，粗淀粉含量則趨于上升變化趨勢(shì)。同樣，總蛋白酶的主要作用是將蛋白質(zhì)分解為可溶性含氮化合物，為其他物質(zhì)的合成提供氮源[28-29]。PPase和ACCase則為油脂合成中的主要調(diào)節(jié)酶，其活性高低可能影響油脂的合成[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，粗淀粉與可溶性蛋白含量的變化呈顯著負(fù)相關(guān)，并且總蛋白酶也與總淀粉酶活性呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與前人研究基本一致[31]。但與向日葵(Helianthusannuus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、油菜(Brassicanapus)和芝麻(Sesamumindicum)等大多數(shù)油料種子不同的是，它們種子油脂的快速積累主要集中在種子發(fā)育后期[32]，而‘鳳丹’種子油脂積累的旺盛時(shí)期主要集中在發(fā)育前期(45～85 d)。這一階段種子中的ACCase和PPase酶活性不斷上升，發(fā)育后期，這兩個(gè)酶的活性迅速下降，含油率的增長(zhǎng)也變得較為緩慢，這與山桐子(Idesiapolycarpa)種子油脂的積累規(guī)律[33]較為相似。

雖然ACCase和PPase酶活性的變化趨勢(shì)以及花后85 d和花后115 d兩次峰值的結(jié)果與油脂合成速率基本一致。但油脂的合成過程是多種生理機(jī)制共同作用的結(jié)果，除ACCase和PPase兩種酶，還存在其他多種酶及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用，他們共同對(duì)油脂的合成進(jìn)行調(diào)節(jié)。本研究只是初步分析了主要貯藏物與其相關(guān)酶活性的關(guān)系，更多調(diào)節(jié)機(jī)制以及作用機(jī)理還需要進(jìn)一步探究。

3.2.2 ‘鳳丹’種子發(fā)育過程中油脂合成與碳水化合物的關(guān)系

種子發(fā)育過程中，油脂及蛋白的合成原料歸根結(jié)底來源于糖類物質(zhì)的分解與轉(zhuǎn)化[34]。King等[35]也發(fā)現(xiàn)，種子發(fā)育初期所產(chǎn)生的貯藏物質(zhì)大多來源于光合作用形成的糖類物質(zhì)，這些物質(zhì)主要以蔗糖的形式進(jìn)入種子，然后分解為己糖。己糖磷酸化后，碳的分配就開始了[36]，己糖既可生成淀粉等物質(zhì)，也可進(jìn)入糖分解途徑轉(zhuǎn)化為丙酮酸、磷酸丙糖等，用于油脂以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成[35]。由于種子中的淀粉和油脂分別處于糖氧化途徑的上游和下游，碳源分配將最終引起這兩類貯藏物質(zhì)間含量的變化[37]。Lin等[38]在擬南芥突變體中通過“向上調(diào)控”，提高淀粉合成速率，最終由于碳源向油脂合成途徑的流動(dòng)被“切斷”，導(dǎo)致種子油含量降低。趙翠格[39]研究發(fā)現(xiàn)，文冠果(Xanthocerassorbifolium)種子在油脂積累初期，體內(nèi)的淀粉含量不斷增加，而可溶性糖的含量卻不斷減少。本研究發(fā)現(xiàn)‘鳳丹’種子在油脂快速累積期(花后45～85 d)，淀粉和可溶性糖含量均呈快速下降趨勢(shì)，其原因可能是，油脂大量合成時(shí)主要是由可溶性糖提供原料，后期由于可溶性糖無法供應(yīng)充足的原料，才導(dǎo)致淀粉大量分解，以滿足油脂合成對(duì)原料的需求；花后85～105 d時(shí)，油脂累積基本趨于平緩，而淀粉的含量則顯著增加，說明此時(shí)碳源主要分配至淀粉處，從而使淀粉積累；種子最后的成熟階段(花后105～115 d)，油脂累積速度又開始緩慢增加，可溶性糖和淀粉的含量也再次突然下降。結(jié)合此發(fā)育過程中，淀粉酶活性與油脂合成關(guān)鍵酶之一——PPase活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，在‘鳳丹’種子發(fā)育過程中，淀粉與油脂之間可能存在著“碳源分配”問題，但此結(jié)論仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究還發(fā)現(xiàn)，‘鳳丹’種子發(fā)育過程中，可溶性蛋白含量與可溶性糖含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與粗淀粉含量之間也呈顯著負(fù)相關(guān)，雖然其與粗脂肪之間還存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，但在發(fā)育后期(花后85～115 d)時(shí)，可溶性蛋白的含量與粗脂肪含量的變化趨勢(shì)相反。因此，蛋白是否也參與油脂合成的碳源競(jìng)爭(zhēng)仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。