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    含深共熔溶劑體系中晶膠微球固定化分枝桿菌生產(chǎn)雄烯二酮研究

    2021-10-10 00:02:20何京鍇樓小玲贠軍賢關(guān)怡新姚善涇
    關(guān)鍵詞:甾醇微球緩沖液

    何京鍇,肖 霞,樓小玲,贠軍賢,關(guān)怡新,姚善涇

    1.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310027;2.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,綠色化學(xué)合成技術(shù)國家重點實驗室培育基地,浙江 杭州 310032

    雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)及其衍生物是合成多種甾體類藥物的重要中間體,可通過分枝桿菌等微生物降解植物甾醇側(cè)鏈制備[1]。相比傳統(tǒng)的“黃姜-皂素-雙烯類-甾體藥物原料藥及制劑”工藝路線[2],生物轉(zhuǎn)化法能有效地解決薯蕷皂苷原料短缺和化學(xué)合成帶來的環(huán)境污染等問題,是甾體藥物的重要綠色合成途徑[3]。然而,受限于底物的低水溶性、產(chǎn)物抑制以及降解、細胞聚集等問題,目前生物轉(zhuǎn)化法的效率仍然較低,難以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。

    溶劑工程可有效促進底物的溶解或分散,避免產(chǎn)物的局部積累情況,是提高生物轉(zhuǎn)化效率的重要策略[4-6]。近年來,離子液體等新型綠色溶劑受到了人們的廣泛關(guān)注,深共熔溶劑(DESs)作為一種離子液體的類似物,具有離子液體的可設(shè)計性、環(huán)境友好和不揮發(fā)不可燃的特點,還有合成簡便且廉價的獨特優(yōu)勢[7]。DESs 由2 種及以上的物質(zhì)混合構(gòu)成,混合物的凝固點由于發(fā)生共熔作用而顯著降低,在室溫下能以液態(tài)形式存在,發(fā)揮其作為溶劑的作用。DESs 在細胞催化領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[8],能顯著提高酶催化性能,增強固定化細胞操作穩(wěn)定性等[9]。

    固定化細胞技術(shù)可以改善細胞的聚集情況、提供更加穩(wěn)定的微環(huán)境[10],并為實現(xiàn)半連續(xù)和連續(xù)生產(chǎn)提供了可能。晶膠介質(zhì)是一種新型的聚合材料,具有特征性的連通大孔、超大孔乃至海綿狀結(jié)構(gòu),早期主要作為生物分離層析介質(zhì)使用[11-12]。晶膠介質(zhì)的多孔特性使其能夠高載量地固定化細胞[13-14],在Efremenko 等[15]的研究中,聚乙烯醇晶膠介質(zhì)的微生物載量可以達到300 mg-DCW/g-基質(zhì)(細胞干重/基質(zhì))。通過對聚合單體的改性和種類的調(diào)節(jié),可改變基質(zhì)的電負性、親疏水性等性質(zhì),滿足不同細胞的固定化要求。

    本研究以甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)和甲基丙烯酸正丁酯(BMA)為聚合單體制備晶膠微球,考察晶膠微球固定化對分枝桿菌細胞的形態(tài)和催化活力的影響,優(yōu)化固定化分枝桿菌的晶膠微球添加量,構(gòu)建含DESs 的新型轉(zhuǎn)化體系,研究固定化細胞催化生產(chǎn)AD 的反應(yīng)進程和固定化細胞的重復(fù)利用,實現(xiàn)固定化細胞催化的半連續(xù)轉(zhuǎn)化。

    1 實驗部分

    1.1 菌種與試劑

    分枝桿菌菌株Mycobacteriumsp.MB 3683 購自中科院微生物研究所菌種保藏中心。植物甾醇(β-谷甾醇45%,豆甾醇26.2%,菜油甾醇23.5%,菜籽甾醇3.2%,純度≥95%)購自西安海斯夫生物科技有限公司。甲基丙烯酸羥乙酯(純度≥97%)、甲基丙烯酸正丁酯(純度≥99%)、聚乙二醇二丙烯酸酯[PEGDA,數(shù)均分子量(Mn)約為250,純度≥99%]、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA,純度≥98%)、四甲基乙二胺(TEMED,純度≥99%)和過硫酸銨(APS,純度≥98%)均購自德國Sigma-Aldrich 公司。其它試劑均為分析純市售試劑。

    1.2 培養(yǎng)基

    種子培養(yǎng)基:5 g/L 葡萄糖,3 g/L 牛肉浸膏,5 g/L 胰蛋白胨,15 g/L NaCl,0.9%體積分數(shù)甘油,pH 值為7.0,每50 mL 裝液量加入15 顆玻璃珠。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:8 g/L 葡萄糖,2 g/L 檸檬酸,6 g/L (NH4)2HPO4,0.05 g/L 檸檬酸鐵銨,0.5 g/L K2HPO4,0.5 g/L MgSO4,0.3%體積分數(shù)Tween 80,1 g/L 植物甾醇,pH 值為7.1。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 晶膠微球的制備和表征

    晶膠微球使用滴加冷凍聚合法制備[16]。將7.5%(質(zhì)量分數(shù))HEMA、7.5%(質(zhì)量分數(shù))BMA、2.5%(質(zhì)量分數(shù))PEGDA 和2.5%(質(zhì)量分數(shù))EGDMA 溶于去離子水中,預(yù)冷至3~5 ℃。往上述聚合單體溶液加入0.6%(質(zhì)量分數(shù))TEMED 為引發(fā)劑和0.8%(質(zhì)量分數(shù))APS 為加速劑,迅速混勻溶液,并勻速滴加至-20 ℃的白油中。定型后,取出微球置于-20 ℃冰箱中過夜以充分聚合。聚合完成的晶膠微球于室溫下解凍,用大量去離子水沖洗,冷凍干燥保存。

    晶膠微球拍照后,使用Nano Measurer 1.2 軟件分析晶膠微球的平均粒徑(dm)。在25 ℃下測定晶膠微球的干重和相應(yīng)微球的水飽和重量,確定微球的最大孔隙率(φmax)。同時,在25 ℃下測定晶膠微球的干重和被濾紙擠壓出自由水的相應(yīng)微球重量,確定微球的有效孔隙率(φe)。

    1.3.2 DESs 的合成

    Bet/Mal(甜菜堿/麥芽糖,兩者的物質(zhì)的量之比為4:1)合成:稱取相應(yīng)質(zhì)量的各組分,置于反應(yīng)器中,60 ℃水浴攪拌加熱,反應(yīng)2 h 并得到澄清液體后,加入超純水至DESs 濃度為80%(質(zhì)量分數(shù)),繼續(xù)攪拌加熱至液體均一,于30 ℃恒溫保存。

    Bet/Gal(甜菜堿/半乳糖,兩者的物質(zhì)的量之比為5:2)合成:稱取相應(yīng)質(zhì)量的各組分,置于反應(yīng)器中,加過量超純水,搖勻至完全溶解,于60 ℃水浴中以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干水分至DESs 濃度為80%(質(zhì)量分數(shù)),于30 ℃恒溫保存。

    1.3.3 懸浮培養(yǎng)靜息細胞和固定化細胞制備

    從保藏的斜面中挑取菌落,轉(zhuǎn)移至種子培養(yǎng)基中。在180 r/min、28 ℃的條件下培養(yǎng)48 h 后,以11%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基,在200 r/min、30 ℃的條件下培養(yǎng)60 h。4 ℃、6 000 r/min 下離心10 min收集菌餅,用0.1 mol/L 磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH 值為7.1)重復(fù)洗滌3 次,即得到懸浮培養(yǎng)靜息細胞。固定化細胞的制備需要在發(fā)酵培養(yǎng)基中額外加入20 g/L 滅菌后的干燥晶膠微球,相同條件培養(yǎng)完成后收集固定化細胞的晶膠微球,用0.1 mol/L PBS 緩沖液(pH 值為7.1)洗滌至少3 次,至無明顯細胞脫落,所得即為固定化細胞。

    1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察固定化細胞晶膠微球

    用0.9%(質(zhì)量分數(shù))的NaCl 生理鹽水重懸樣品,并洗滌2 次。加入2.5%(質(zhì)量分數(shù))的戊二醛固定液,于4 ℃環(huán)境中固定3 h,離心去上清液。之后分別以30%,50%,70%,90%,100%(體積分數(shù))的乙醇溶液按順序室溫下處理15 min。最后將完全脫水的樣品用冷凍干燥機干燥,噴金后用掃描電鏡(SU-8010,Hitachi,Japan)進行觀察。

    1.3.5 含深共熔溶劑體系的細胞轉(zhuǎn)化

    將50 g/L 的分枝桿菌懸浮培養(yǎng)靜息細胞或100 g/L 的固定化細胞晶膠微球、含有12.5%體積分數(shù)的80% DESs、2 g/L 葡萄糖和3 g/L 植物甾醇加入裝有0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 值為7.5)的錐形瓶中(懸浮培養(yǎng)時使用帶玻璃擋板的錐形瓶),30 ℃和200 r/min 條件下反應(yīng)一定時間。半連續(xù)轉(zhuǎn)化時,每一批次轉(zhuǎn)化36 h,取出固定化細胞晶膠微球,以0.1 mol/L PBS 緩沖液(pH 值為7.1)簡單洗滌后投入下一個循環(huán)。轉(zhuǎn)化完成后加入等體積乙酸乙酯,室溫下均勻混合15 min 以萃取溶液中的AD。離心后,取澄清的上相(乙酸乙酯相)通風(fēng)風(fēng)干,并加入5 倍體積的甲醇以充分溶解。用高效液相色譜(HPLC,Agilent 1100,Agilent,USA)測定AD 的濃度:使用Hypersil ODS-2 C18 反相色譜柱(5 μm,250 mm4.6 mm,Thermo Fisher Scientific,USA);流動相采用甲醇/水混合物(體積比為8:2),流速為1 mL/min;進樣量為20 μL;檢測波長為254 nm;洗脫時間為6 min。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 晶膠微球的表征與細胞固定化

    由于分枝桿菌細胞壁富有分枝菌酸等脂質(zhì),細胞會表現(xiàn)出一定的疏水性,易聚集于固定化基質(zhì)的疏水性空腔內(nèi)。然而,基質(zhì)過高的疏水性容易使分枝桿菌在空腔內(nèi)過度堆積,因此實驗中使用的晶膠微球由親水性單體HEMA 和疏水性單體BMA 等質(zhì)量聚合而成,確保分枝桿菌靜息細胞以合適的密度吸附在基質(zhì)上。晶膠微球的形態(tài)可通過外觀形貌和微觀結(jié)構(gòu)進行觀察。圖1 顯示了微球外部形態(tài),可以看到,制備所得的晶膠微球為輕質(zhì)白色小球。利用Nano Measurer 1.2 軟件分析平均粒徑為(2.78±0.03) mm。晶膠微球內(nèi)部具有大量空隙,最大孔隙率為85.43%±0.30%,有效孔隙率為72.82%±0.41%。

    圖1 HEMA-BMA 聚合制備的晶膠微球Fig.1 The cryogel beads prepared by polymerization of HEMA and BMA

    圖2 為未固定(a,b)和固定(c,d)分枝桿菌細胞的晶膠微球表面掃描電鏡(SEM)圖。由圖2 可見,晶膠微球的微觀結(jié)構(gòu)具有大量直徑為40 μm 以上的孔洞,有利于細胞吸附并提供通暢的物質(zhì)交換環(huán)境。經(jīng)固定化后,長約2 μm 的細胞均勻地分散吸附在微球表面,有效緩解了懸浮培養(yǎng)細胞的聚集現(xiàn)象。烘干后稱重,計算晶膠微球的分枝桿菌細胞載量為(70.5±7.2) mg-DCW/g-基質(zhì),高于已報道的其它吸附性基質(zhì)對分枝桿菌的細胞載量(硅藻土的分枝桿菌細胞載量為11.4 mg-DCW/g-基質(zhì),硅膠的分枝桿菌細胞載量為5.7~6.0 mg-DCW/g-基質(zhì))[17]。

    圖2 固定化細胞前(a,b)后(c,d)的晶膠微球表面結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of cryogel beads before (a,b) and after (c,d) cells immobilization

    表1 為懸浮培養(yǎng)細胞和晶膠微球固定化細胞在緩沖液中轉(zhuǎn)化24 h 后的AD 產(chǎn)量。得益于晶膠微球的促細胞分散性和高細胞載量,細胞的轉(zhuǎn)化效率顯著提高,單位細胞的AD 產(chǎn)量(以細胞干重計,下同)為懸浮培養(yǎng)細胞的6.8 倍。表明晶膠微球作為分枝桿菌的固定化基質(zhì),顯著提高了細胞的利用率。

    表1 懸浮培養(yǎng)細胞和固定化晶膠微球轉(zhuǎn)化24 h 的AD 產(chǎn)量Table 1 AD production using suspension cultured cells or beads immobilizing cells after 24 h biotransformation

    2.2 固定化細胞晶膠微球添加量對AD 產(chǎn)量的影響

    相比懸浮培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化體系中50 g/L 的細胞濃度,上文中固定化細胞轉(zhuǎn)化體系中細胞濃度較低,因此探討了不同的固定化分枝桿菌的晶膠微球添加量對轉(zhuǎn)化效率的影響。圖3 所示為不同添加量的固定化晶膠微球在緩沖液體系中轉(zhuǎn)化24 h 的AD 產(chǎn)量和單位細胞AD 產(chǎn)量。由圖3 可知,隨著固定化晶膠微球添加量的增加,總AD 產(chǎn)量迅速提高。將固定化晶膠微球添加量提高到180 g/L 的情況下,仍未受到明顯的傳質(zhì)限制。這是因為一方面固定在晶膠微球內(nèi)部的分枝桿菌為靜息細胞,對外界營養(yǎng)物質(zhì)要求較低;另一方面,晶膠微球內(nèi)部的大量孔道使得物質(zhì)可以自由通過,傳質(zhì)阻力極低[11]。

    圖3 不同固定化細胞晶膠微球添加量時轉(zhuǎn)化24 h 的AD 產(chǎn)量Fig.3 AD production after 24 h biotransformation with different additions of immobilized cryogel beads

    在植物甾醇降解過程中,因為底物在發(fā)酵液中溶解性極差,一般的策略是過量加入植物甾醇,通過提高固定化細胞晶膠微球的添加量,可以大大提高細胞對植物甾醇的利用率,也有利于降低生物轉(zhuǎn)化的設(shè)備和時間成本。

    2.3 含DESs 體系中分枝桿菌轉(zhuǎn)化反應(yīng)歷程

    研究表明,含DESs 的轉(zhuǎn)化體系在全細胞催化反應(yīng)和固定化細胞反應(yīng)中具有很好的應(yīng)用潛力[18]。采用合成的Bet/Mal 深共熔溶劑和Bet/Gal 深共熔溶劑,構(gòu)建了2 種含10%(質(zhì)量分數(shù))的DESs 轉(zhuǎn)化體系,研究了48 h 的懸浮培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化以及固定化細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)歷程,結(jié)果見圖4。

    圖4 含10% DESs 體系中懸浮培養(yǎng)細胞(a)和固定化細胞(b)降解植物甾醇反應(yīng)歷程Fig.4 AD production course for the biotransformation of phytosterols in systems with 10% DESs by suspension cultured cells (a) and immobilized cells (b)

    如圖4 所示,在無DESs 的轉(zhuǎn)化體系中,懸浮培養(yǎng)細胞和固定化細胞分別在轉(zhuǎn)化36 h 和24 h 時達到最大的AD 產(chǎn)量,隨后細胞內(nèi)AD 的降解途徑占據(jù)優(yōu)勢,AD 積累逐漸下降。而在兩種含DESs轉(zhuǎn)化體系中,不論是懸浮培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化還是固定化細胞轉(zhuǎn)化過程,AD 的降解過程都被明顯抑制,使得AD 產(chǎn)量的積累階段得以延長,大大提高了AD 的產(chǎn)量。尤其是在固定化細胞轉(zhuǎn)化過程,含DESs體系中24~36 h 階段的AD 降解被明顯抑制。在10% Bet/Mal 和10% Bet/Gal 體系中,轉(zhuǎn)化36 h 后AD 產(chǎn)量分別為257.5 mg/g-DCW 和235.3 mg/g-DCW。值得注意的是,不論是在緩沖液對照組還是DESs 組中,相比懸浮培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化,固定化細胞轉(zhuǎn)化過程中AD 的降解階段均出現(xiàn)的更早些,意味著固定化細胞受產(chǎn)物抑制和產(chǎn)物降解的影響更顯著。因為在固定化細胞體系中單位細胞的AD 產(chǎn)量遠高于懸浮培養(yǎng)細胞,疏水性產(chǎn)物AD 在細胞所處微環(huán)境的局部濃度更高,使得產(chǎn)物抑制作用更強,且更易觸發(fā)產(chǎn)物降解途徑。

    2.4 含DESs 體系中固定化細胞的重復(fù)利用

    細胞的多批次重復(fù)利用是固定化細胞技術(shù)在生物轉(zhuǎn)化過程中的一個突出優(yōu)勢。在單批次轉(zhuǎn)化達到最大產(chǎn)量即轉(zhuǎn)化36 h 后,回收固定化細胞并重復(fù)使用,可以最大限度地提高細胞利用率。實驗測定了在不同溶劑體系中,每批次轉(zhuǎn)化中AD 的產(chǎn)量,另外為了考察晶膠微球內(nèi)部積累的AD 對回收后固定化細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)量的影響,測定了每批次轉(zhuǎn)化前晶膠微球內(nèi)部富集的AD 含量,結(jié)果見表2。

    表2 含10% DESs 體系中固定化細胞重復(fù)利用性能Table 2 Performances of repeated used immobilized cells in systems with 10% DESs

    由表2 可見,在3 種體系中重復(fù)利用的固定化細胞催化活力都出現(xiàn)了大幅下降,其中緩沖液組的下降最為明顯,第3 批次轉(zhuǎn)化過程中的AD 產(chǎn)量只有第1 批次的13.1%。導(dǎo)致細胞催化活力喪失的主要原因是AD 在晶膠微球內(nèi)部的堆積。在分枝桿菌催化植物甾醇側(cè)鏈降解反應(yīng)時,AD 容易在細胞表面析出,而晶膠微球內(nèi)部的半疏水環(huán)境進一步加劇了AD 在局部堆積的傾向,阻礙了AD 向主體溶液的擴散。如表2 所示,在第1 個循環(huán)批次開始前,由于靜息細胞制備過程中的植物甾醇誘導(dǎo),晶膠微球內(nèi)部已存在少量的AD。在經(jīng)過第1 批次的循環(huán)后,晶膠微球內(nèi)部AD 濃度顯著上升,抑制了第2循環(huán)批次中的AD 產(chǎn)量。因此在第2 批次后,擴散出晶膠微球的AD 量反而大于該批次中細胞生產(chǎn)的AD 量,導(dǎo)致晶膠微球內(nèi)部AD 濃度有少許下降。含DESs 體系相對于緩沖液體系,有助于改善AD在晶膠微球內(nèi)和緩沖液中的分配。以第1 批次反應(yīng)完成后為例,兩種DESs 體系中分別將溶液中AD占總AD 的比例從20.6%提高到了49.6%和51.5%。通過促進產(chǎn)物從晶膠微球中擴散至外部緩沖液中,含DESs 體系部分緩解了固定化細胞循環(huán)利用后的催化活力損失。多項研究[9,19-20]也證實,DESs 有助于提高固定化細胞經(jīng)循環(huán)回收后的催化活力,認為DESs 可以提高細胞的操作穩(wěn)定性。

    2.5 含DESs 體系中固定化細胞的半連續(xù)轉(zhuǎn)化過程

    盡管重復(fù)使用細胞損失了細胞的大部分催化活力,但通過多批次半連續(xù)轉(zhuǎn)化過程,可以有效解決這一問題。在單批次轉(zhuǎn)化過程中,通過乙酸乙酯同時萃取發(fā)酵液和晶膠微球中的AD,萃取后晶膠微球中固定化細胞基本失活;而在半連續(xù)轉(zhuǎn)化時,僅萃取收集發(fā)酵液中的AD,固定化細胞仍具有催化活力并繼續(xù)參與下一批次的轉(zhuǎn)化,在所有批次的轉(zhuǎn)化完成后再對晶膠微球中的AD 進行萃取回收。

    表3 展示了每批次循環(huán)(36 h)后從緩沖液中萃取回收的AD 量,以及完成所有循環(huán)后從晶膠微球中萃取回收的AD 量。

    表3 含10% DESs 體系中固定化細胞半連續(xù)轉(zhuǎn)化的AD 產(chǎn)量Table 3 AD production of semi-continuous biotransformations using immobilized cells in systems with 10% DESs

    由表3 可知,在緩沖液體系中,由于AD 大部分積累在晶膠微球內(nèi)部,第一個批次中的AD 產(chǎn)量很低,且未處理晶膠微球內(nèi)的AD 抑制了后續(xù)批次的AD 生產(chǎn),限制了最終得到的總AD 產(chǎn)量。在緩沖液中,3 批次半連續(xù)轉(zhuǎn)化后AD 產(chǎn)量僅比單批次轉(zhuǎn)化時上升了17.6%。而在含DESs 體系中,由于DESs 抑制了AD 的降解并減少了AD 在晶膠微球內(nèi)的累積情況,AD 產(chǎn)量顯著提高。最終,在含10%Bet/Mal 的體系中,固定化細胞的3 批次半連續(xù)轉(zhuǎn)化的總AD 產(chǎn)量達到了0.491 g/L,即401.4 mg/g-DCW的單位細胞AD 產(chǎn)量,相比半連續(xù)轉(zhuǎn)化的緩沖液組有明顯提高,是緩沖液體系懸浮培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化單位細胞AD 產(chǎn)量(33.4 mg/g-DCW)的12 倍。

    3 結(jié) 論

    DESs 作為一種新型綠色溶劑,在生物轉(zhuǎn)化過程中具有促進底物分散、穩(wěn)定生物催化劑和提高轉(zhuǎn)化效率等優(yōu)勢。本研究構(gòu)建了10% Bet/Mal 和10% Bet/Gal 兩種含DESs 體系,將其應(yīng)用于分枝桿菌固定化細胞降解植物甾醇側(cè)鏈生產(chǎn)AD 過程中。合成了基于HEMA 和BMA 的晶膠微球,作為分枝桿菌固定化基質(zhì),有效分散了分枝桿菌細胞,提高了細胞的利用率。DESs 的添加抑制了AD 的降解,減少了AD 在晶膠微球內(nèi)的累積。在含10% Bet/Mal 的新型溶劑體系中,晶膠微球固定化分枝桿菌細胞經(jīng)過3 批次半連續(xù)轉(zhuǎn)化,單位細胞總AD 產(chǎn)量達到401.4 mg/g-DCW,是緩沖液體系懸浮培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化的12 倍,展示了工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

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