• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    含深共熔溶劑體系中晶膠微球固定化分枝桿菌生產(chǎn)雄烯二酮研究

    2021-10-10 00:02:20何京鍇樓小玲贠軍賢關(guān)怡新姚善涇
    關(guān)鍵詞:甾醇微球緩沖液

    何京鍇,肖 霞,樓小玲,贠軍賢,關(guān)怡新,姚善涇

    1.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310027;2.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,綠色化學(xué)合成技術(shù)國家重點實驗室培育基地,浙江 杭州 310032

    雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)及其衍生物是合成多種甾體類藥物的重要中間體,可通過分枝桿菌等微生物降解植物甾醇側(cè)鏈制備[1]。相比傳統(tǒng)的“黃姜-皂素-雙烯類-甾體藥物原料藥及制劑”工藝路線[2],生物轉(zhuǎn)化法能有效地解決薯蕷皂苷原料短缺和化學(xué)合成帶來的環(huán)境污染等問題,是甾體藥物的重要綠色合成途徑[3]。然而,受限于底物的低水溶性、產(chǎn)物抑制以及降解、細胞聚集等問題,目前生物轉(zhuǎn)化法的效率仍然較低,難以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。

    溶劑工程可有效促進底物的溶解或分散,避免產(chǎn)物的局部積累情況,是提高生物轉(zhuǎn)化效率的重要策略[4-6]。近年來,離子液體等新型綠色溶劑受到了人們的廣泛關(guān)注,深共熔溶劑(DESs)作為一種離子液體的類似物,具有離子液體的可設(shè)計性、環(huán)境友好和不揮發(fā)不可燃的特點,還有合成簡便且廉價的獨特優(yōu)勢[7]。DESs 由2 種及以上的物質(zhì)混合構(gòu)成,混合物的凝固點由于發(fā)生共熔作用而顯著降低,在室溫下能以液態(tài)形式存在,發(fā)揮其作為溶劑的作用。DESs 在細胞催化領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[8],能顯著提高酶催化性能,增強固定化細胞操作穩(wěn)定性等[9]。

    固定化細胞技術(shù)可以改善細胞的聚集情況、提供更加穩(wěn)定的微環(huán)境[10],并為實現(xiàn)半連續(xù)和連續(xù)生產(chǎn)提供了可能。晶膠介質(zhì)是一種新型的聚合材料,具有特征性的連通大孔、超大孔乃至海綿狀結(jié)構(gòu),早期主要作為生物分離層析介質(zhì)使用[11-12]。晶膠介質(zhì)的多孔特性使其能夠高載量地固定化細胞[13-14],在Efremenko 等[15]的研究中,聚乙烯醇晶膠介質(zhì)的微生物載量可以達到300 mg-DCW/g-基質(zhì)(細胞干重/基質(zhì))。通過對聚合單體的改性和種類的調(diào)節(jié),可改變基質(zhì)的電負性、親疏水性等性質(zhì),滿足不同細胞的固定化要求。

    本研究以甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)和甲基丙烯酸正丁酯(BMA)為聚合單體制備晶膠微球,考察晶膠微球固定化對分枝桿菌細胞的形態(tài)和催化活力的影響,優(yōu)化固定化分枝桿菌的晶膠微球添加量,構(gòu)建含DESs 的新型轉(zhuǎn)化體系,研究固定化細胞催化生產(chǎn)AD 的反應(yīng)進程和固定化細胞的重復(fù)利用,實現(xiàn)固定化細胞催化的半連續(xù)轉(zhuǎn)化。

    1 實驗部分

    1.1 菌種與試劑

    分枝桿菌菌株Mycobacteriumsp.MB 3683 購自中科院微生物研究所菌種保藏中心。植物甾醇(β-谷甾醇45%,豆甾醇26.2%,菜油甾醇23.5%,菜籽甾醇3.2%,純度≥95%)購自西安海斯夫生物科技有限公司。甲基丙烯酸羥乙酯(純度≥97%)、甲基丙烯酸正丁酯(純度≥99%)、聚乙二醇二丙烯酸酯[PEGDA,數(shù)均分子量(Mn)約為250,純度≥99%]、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA,純度≥98%)、四甲基乙二胺(TEMED,純度≥99%)和過硫酸銨(APS,純度≥98%)均購自德國Sigma-Aldrich 公司。其它試劑均為分析純市售試劑。

    1.2 培養(yǎng)基

    種子培養(yǎng)基:5 g/L 葡萄糖,3 g/L 牛肉浸膏,5 g/L 胰蛋白胨,15 g/L NaCl,0.9%體積分數(shù)甘油,pH 值為7.0,每50 mL 裝液量加入15 顆玻璃珠。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:8 g/L 葡萄糖,2 g/L 檸檬酸,6 g/L (NH4)2HPO4,0.05 g/L 檸檬酸鐵銨,0.5 g/L K2HPO4,0.5 g/L MgSO4,0.3%體積分數(shù)Tween 80,1 g/L 植物甾醇,pH 值為7.1。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 晶膠微球的制備和表征

    晶膠微球使用滴加冷凍聚合法制備[16]。將7.5%(質(zhì)量分數(shù))HEMA、7.5%(質(zhì)量分數(shù))BMA、2.5%(質(zhì)量分數(shù))PEGDA 和2.5%(質(zhì)量分數(shù))EGDMA 溶于去離子水中,預(yù)冷至3~5 ℃。往上述聚合單體溶液加入0.6%(質(zhì)量分數(shù))TEMED 為引發(fā)劑和0.8%(質(zhì)量分數(shù))APS 為加速劑,迅速混勻溶液,并勻速滴加至-20 ℃的白油中。定型后,取出微球置于-20 ℃冰箱中過夜以充分聚合。聚合完成的晶膠微球于室溫下解凍,用大量去離子水沖洗,冷凍干燥保存。

    晶膠微球拍照后,使用Nano Measurer 1.2 軟件分析晶膠微球的平均粒徑(dm)。在25 ℃下測定晶膠微球的干重和相應(yīng)微球的水飽和重量,確定微球的最大孔隙率(φmax)。同時,在25 ℃下測定晶膠微球的干重和被濾紙擠壓出自由水的相應(yīng)微球重量,確定微球的有效孔隙率(φe)。

    1.3.2 DESs 的合成

    Bet/Mal(甜菜堿/麥芽糖,兩者的物質(zhì)的量之比為4:1)合成:稱取相應(yīng)質(zhì)量的各組分,置于反應(yīng)器中,60 ℃水浴攪拌加熱,反應(yīng)2 h 并得到澄清液體后,加入超純水至DESs 濃度為80%(質(zhì)量分數(shù)),繼續(xù)攪拌加熱至液體均一,于30 ℃恒溫保存。

    Bet/Gal(甜菜堿/半乳糖,兩者的物質(zhì)的量之比為5:2)合成:稱取相應(yīng)質(zhì)量的各組分,置于反應(yīng)器中,加過量超純水,搖勻至完全溶解,于60 ℃水浴中以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干水分至DESs 濃度為80%(質(zhì)量分數(shù)),于30 ℃恒溫保存。

    1.3.3 懸浮培養(yǎng)靜息細胞和固定化細胞制備

    從保藏的斜面中挑取菌落,轉(zhuǎn)移至種子培養(yǎng)基中。在180 r/min、28 ℃的條件下培養(yǎng)48 h 后,以11%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基,在200 r/min、30 ℃的條件下培養(yǎng)60 h。4 ℃、6 000 r/min 下離心10 min收集菌餅,用0.1 mol/L 磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH 值為7.1)重復(fù)洗滌3 次,即得到懸浮培養(yǎng)靜息細胞。固定化細胞的制備需要在發(fā)酵培養(yǎng)基中額外加入20 g/L 滅菌后的干燥晶膠微球,相同條件培養(yǎng)完成后收集固定化細胞的晶膠微球,用0.1 mol/L PBS 緩沖液(pH 值為7.1)洗滌至少3 次,至無明顯細胞脫落,所得即為固定化細胞。

    1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察固定化細胞晶膠微球

    用0.9%(質(zhì)量分數(shù))的NaCl 生理鹽水重懸樣品,并洗滌2 次。加入2.5%(質(zhì)量分數(shù))的戊二醛固定液,于4 ℃環(huán)境中固定3 h,離心去上清液。之后分別以30%,50%,70%,90%,100%(體積分數(shù))的乙醇溶液按順序室溫下處理15 min。最后將完全脫水的樣品用冷凍干燥機干燥,噴金后用掃描電鏡(SU-8010,Hitachi,Japan)進行觀察。

    1.3.5 含深共熔溶劑體系的細胞轉(zhuǎn)化

    將50 g/L 的分枝桿菌懸浮培養(yǎng)靜息細胞或100 g/L 的固定化細胞晶膠微球、含有12.5%體積分數(shù)的80% DESs、2 g/L 葡萄糖和3 g/L 植物甾醇加入裝有0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 值為7.5)的錐形瓶中(懸浮培養(yǎng)時使用帶玻璃擋板的錐形瓶),30 ℃和200 r/min 條件下反應(yīng)一定時間。半連續(xù)轉(zhuǎn)化時,每一批次轉(zhuǎn)化36 h,取出固定化細胞晶膠微球,以0.1 mol/L PBS 緩沖液(pH 值為7.1)簡單洗滌后投入下一個循環(huán)。轉(zhuǎn)化完成后加入等體積乙酸乙酯,室溫下均勻混合15 min 以萃取溶液中的AD。離心后,取澄清的上相(乙酸乙酯相)通風(fēng)風(fēng)干,并加入5 倍體積的甲醇以充分溶解。用高效液相色譜(HPLC,Agilent 1100,Agilent,USA)測定AD 的濃度:使用Hypersil ODS-2 C18 反相色譜柱(5 μm,250 mm4.6 mm,Thermo Fisher Scientific,USA);流動相采用甲醇/水混合物(體積比為8:2),流速為1 mL/min;進樣量為20 μL;檢測波長為254 nm;洗脫時間為6 min。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 晶膠微球的表征與細胞固定化

    由于分枝桿菌細胞壁富有分枝菌酸等脂質(zhì),細胞會表現(xiàn)出一定的疏水性,易聚集于固定化基質(zhì)的疏水性空腔內(nèi)。然而,基質(zhì)過高的疏水性容易使分枝桿菌在空腔內(nèi)過度堆積,因此實驗中使用的晶膠微球由親水性單體HEMA 和疏水性單體BMA 等質(zhì)量聚合而成,確保分枝桿菌靜息細胞以合適的密度吸附在基質(zhì)上。晶膠微球的形態(tài)可通過外觀形貌和微觀結(jié)構(gòu)進行觀察。圖1 顯示了微球外部形態(tài),可以看到,制備所得的晶膠微球為輕質(zhì)白色小球。利用Nano Measurer 1.2 軟件分析平均粒徑為(2.78±0.03) mm。晶膠微球內(nèi)部具有大量空隙,最大孔隙率為85.43%±0.30%,有效孔隙率為72.82%±0.41%。

    圖1 HEMA-BMA 聚合制備的晶膠微球Fig.1 The cryogel beads prepared by polymerization of HEMA and BMA

    圖2 為未固定(a,b)和固定(c,d)分枝桿菌細胞的晶膠微球表面掃描電鏡(SEM)圖。由圖2 可見,晶膠微球的微觀結(jié)構(gòu)具有大量直徑為40 μm 以上的孔洞,有利于細胞吸附并提供通暢的物質(zhì)交換環(huán)境。經(jīng)固定化后,長約2 μm 的細胞均勻地分散吸附在微球表面,有效緩解了懸浮培養(yǎng)細胞的聚集現(xiàn)象。烘干后稱重,計算晶膠微球的分枝桿菌細胞載量為(70.5±7.2) mg-DCW/g-基質(zhì),高于已報道的其它吸附性基質(zhì)對分枝桿菌的細胞載量(硅藻土的分枝桿菌細胞載量為11.4 mg-DCW/g-基質(zhì),硅膠的分枝桿菌細胞載量為5.7~6.0 mg-DCW/g-基質(zhì))[17]。

    圖2 固定化細胞前(a,b)后(c,d)的晶膠微球表面結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of cryogel beads before (a,b) and after (c,d) cells immobilization

    表1 為懸浮培養(yǎng)細胞和晶膠微球固定化細胞在緩沖液中轉(zhuǎn)化24 h 后的AD 產(chǎn)量。得益于晶膠微球的促細胞分散性和高細胞載量,細胞的轉(zhuǎn)化效率顯著提高,單位細胞的AD 產(chǎn)量(以細胞干重計,下同)為懸浮培養(yǎng)細胞的6.8 倍。表明晶膠微球作為分枝桿菌的固定化基質(zhì),顯著提高了細胞的利用率。

    表1 懸浮培養(yǎng)細胞和固定化晶膠微球轉(zhuǎn)化24 h 的AD 產(chǎn)量Table 1 AD production using suspension cultured cells or beads immobilizing cells after 24 h biotransformation

    2.2 固定化細胞晶膠微球添加量對AD 產(chǎn)量的影響

    相比懸浮培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化體系中50 g/L 的細胞濃度,上文中固定化細胞轉(zhuǎn)化體系中細胞濃度較低,因此探討了不同的固定化分枝桿菌的晶膠微球添加量對轉(zhuǎn)化效率的影響。圖3 所示為不同添加量的固定化晶膠微球在緩沖液體系中轉(zhuǎn)化24 h 的AD 產(chǎn)量和單位細胞AD 產(chǎn)量。由圖3 可知,隨著固定化晶膠微球添加量的增加,總AD 產(chǎn)量迅速提高。將固定化晶膠微球添加量提高到180 g/L 的情況下,仍未受到明顯的傳質(zhì)限制。這是因為一方面固定在晶膠微球內(nèi)部的分枝桿菌為靜息細胞,對外界營養(yǎng)物質(zhì)要求較低;另一方面,晶膠微球內(nèi)部的大量孔道使得物質(zhì)可以自由通過,傳質(zhì)阻力極低[11]。

    圖3 不同固定化細胞晶膠微球添加量時轉(zhuǎn)化24 h 的AD 產(chǎn)量Fig.3 AD production after 24 h biotransformation with different additions of immobilized cryogel beads

    在植物甾醇降解過程中,因為底物在發(fā)酵液中溶解性極差,一般的策略是過量加入植物甾醇,通過提高固定化細胞晶膠微球的添加量,可以大大提高細胞對植物甾醇的利用率,也有利于降低生物轉(zhuǎn)化的設(shè)備和時間成本。

    2.3 含DESs 體系中分枝桿菌轉(zhuǎn)化反應(yīng)歷程

    研究表明,含DESs 的轉(zhuǎn)化體系在全細胞催化反應(yīng)和固定化細胞反應(yīng)中具有很好的應(yīng)用潛力[18]。采用合成的Bet/Mal 深共熔溶劑和Bet/Gal 深共熔溶劑,構(gòu)建了2 種含10%(質(zhì)量分數(shù))的DESs 轉(zhuǎn)化體系,研究了48 h 的懸浮培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化以及固定化細胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)歷程,結(jié)果見圖4。

    圖4 含10% DESs 體系中懸浮培養(yǎng)細胞(a)和固定化細胞(b)降解植物甾醇反應(yīng)歷程Fig.4 AD production course for the biotransformation of phytosterols in systems with 10% DESs by suspension cultured cells (a) and immobilized cells (b)

    如圖4 所示,在無DESs 的轉(zhuǎn)化體系中,懸浮培養(yǎng)細胞和固定化細胞分別在轉(zhuǎn)化36 h 和24 h 時達到最大的AD 產(chǎn)量,隨后細胞內(nèi)AD 的降解途徑占據(jù)優(yōu)勢,AD 積累逐漸下降。而在兩種含DESs轉(zhuǎn)化體系中,不論是懸浮培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化還是固定化細胞轉(zhuǎn)化過程,AD 的降解過程都被明顯抑制,使得AD 產(chǎn)量的積累階段得以延長,大大提高了AD 的產(chǎn)量。尤其是在固定化細胞轉(zhuǎn)化過程,含DESs體系中24~36 h 階段的AD 降解被明顯抑制。在10% Bet/Mal 和10% Bet/Gal 體系中,轉(zhuǎn)化36 h 后AD 產(chǎn)量分別為257.5 mg/g-DCW 和235.3 mg/g-DCW。值得注意的是,不論是在緩沖液對照組還是DESs 組中,相比懸浮培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化,固定化細胞轉(zhuǎn)化過程中AD 的降解階段均出現(xiàn)的更早些,意味著固定化細胞受產(chǎn)物抑制和產(chǎn)物降解的影響更顯著。因為在固定化細胞體系中單位細胞的AD 產(chǎn)量遠高于懸浮培養(yǎng)細胞,疏水性產(chǎn)物AD 在細胞所處微環(huán)境的局部濃度更高,使得產(chǎn)物抑制作用更強,且更易觸發(fā)產(chǎn)物降解途徑。

    2.4 含DESs 體系中固定化細胞的重復(fù)利用

    細胞的多批次重復(fù)利用是固定化細胞技術(shù)在生物轉(zhuǎn)化過程中的一個突出優(yōu)勢。在單批次轉(zhuǎn)化達到最大產(chǎn)量即轉(zhuǎn)化36 h 后,回收固定化細胞并重復(fù)使用,可以最大限度地提高細胞利用率。實驗測定了在不同溶劑體系中,每批次轉(zhuǎn)化中AD 的產(chǎn)量,另外為了考察晶膠微球內(nèi)部積累的AD 對回收后固定化細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)量的影響,測定了每批次轉(zhuǎn)化前晶膠微球內(nèi)部富集的AD 含量,結(jié)果見表2。

    表2 含10% DESs 體系中固定化細胞重復(fù)利用性能Table 2 Performances of repeated used immobilized cells in systems with 10% DESs

    由表2 可見,在3 種體系中重復(fù)利用的固定化細胞催化活力都出現(xiàn)了大幅下降,其中緩沖液組的下降最為明顯,第3 批次轉(zhuǎn)化過程中的AD 產(chǎn)量只有第1 批次的13.1%。導(dǎo)致細胞催化活力喪失的主要原因是AD 在晶膠微球內(nèi)部的堆積。在分枝桿菌催化植物甾醇側(cè)鏈降解反應(yīng)時,AD 容易在細胞表面析出,而晶膠微球內(nèi)部的半疏水環(huán)境進一步加劇了AD 在局部堆積的傾向,阻礙了AD 向主體溶液的擴散。如表2 所示,在第1 個循環(huán)批次開始前,由于靜息細胞制備過程中的植物甾醇誘導(dǎo),晶膠微球內(nèi)部已存在少量的AD。在經(jīng)過第1 批次的循環(huán)后,晶膠微球內(nèi)部AD 濃度顯著上升,抑制了第2循環(huán)批次中的AD 產(chǎn)量。因此在第2 批次后,擴散出晶膠微球的AD 量反而大于該批次中細胞生產(chǎn)的AD 量,導(dǎo)致晶膠微球內(nèi)部AD 濃度有少許下降。含DESs 體系相對于緩沖液體系,有助于改善AD在晶膠微球內(nèi)和緩沖液中的分配。以第1 批次反應(yīng)完成后為例,兩種DESs 體系中分別將溶液中AD占總AD 的比例從20.6%提高到了49.6%和51.5%。通過促進產(chǎn)物從晶膠微球中擴散至外部緩沖液中,含DESs 體系部分緩解了固定化細胞循環(huán)利用后的催化活力損失。多項研究[9,19-20]也證實,DESs 有助于提高固定化細胞經(jīng)循環(huán)回收后的催化活力,認為DESs 可以提高細胞的操作穩(wěn)定性。

    2.5 含DESs 體系中固定化細胞的半連續(xù)轉(zhuǎn)化過程

    盡管重復(fù)使用細胞損失了細胞的大部分催化活力,但通過多批次半連續(xù)轉(zhuǎn)化過程,可以有效解決這一問題。在單批次轉(zhuǎn)化過程中,通過乙酸乙酯同時萃取發(fā)酵液和晶膠微球中的AD,萃取后晶膠微球中固定化細胞基本失活;而在半連續(xù)轉(zhuǎn)化時,僅萃取收集發(fā)酵液中的AD,固定化細胞仍具有催化活力并繼續(xù)參與下一批次的轉(zhuǎn)化,在所有批次的轉(zhuǎn)化完成后再對晶膠微球中的AD 進行萃取回收。

    表3 展示了每批次循環(huán)(36 h)后從緩沖液中萃取回收的AD 量,以及完成所有循環(huán)后從晶膠微球中萃取回收的AD 量。

    表3 含10% DESs 體系中固定化細胞半連續(xù)轉(zhuǎn)化的AD 產(chǎn)量Table 3 AD production of semi-continuous biotransformations using immobilized cells in systems with 10% DESs

    由表3 可知,在緩沖液體系中,由于AD 大部分積累在晶膠微球內(nèi)部,第一個批次中的AD 產(chǎn)量很低,且未處理晶膠微球內(nèi)的AD 抑制了后續(xù)批次的AD 生產(chǎn),限制了最終得到的總AD 產(chǎn)量。在緩沖液中,3 批次半連續(xù)轉(zhuǎn)化后AD 產(chǎn)量僅比單批次轉(zhuǎn)化時上升了17.6%。而在含DESs 體系中,由于DESs 抑制了AD 的降解并減少了AD 在晶膠微球內(nèi)的累積情況,AD 產(chǎn)量顯著提高。最終,在含10%Bet/Mal 的體系中,固定化細胞的3 批次半連續(xù)轉(zhuǎn)化的總AD 產(chǎn)量達到了0.491 g/L,即401.4 mg/g-DCW的單位細胞AD 產(chǎn)量,相比半連續(xù)轉(zhuǎn)化的緩沖液組有明顯提高,是緩沖液體系懸浮培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化單位細胞AD 產(chǎn)量(33.4 mg/g-DCW)的12 倍。

    3 結(jié) 論

    DESs 作為一種新型綠色溶劑,在生物轉(zhuǎn)化過程中具有促進底物分散、穩(wěn)定生物催化劑和提高轉(zhuǎn)化效率等優(yōu)勢。本研究構(gòu)建了10% Bet/Mal 和10% Bet/Gal 兩種含DESs 體系,將其應(yīng)用于分枝桿菌固定化細胞降解植物甾醇側(cè)鏈生產(chǎn)AD 過程中。合成了基于HEMA 和BMA 的晶膠微球,作為分枝桿菌固定化基質(zhì),有效分散了分枝桿菌細胞,提高了細胞的利用率。DESs 的添加抑制了AD 的降解,減少了AD 在晶膠微球內(nèi)的累積。在含10% Bet/Mal 的新型溶劑體系中,晶膠微球固定化分枝桿菌細胞經(jīng)過3 批次半連續(xù)轉(zhuǎn)化,單位細胞總AD 產(chǎn)量達到401.4 mg/g-DCW,是緩沖液體系懸浮培養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化的12 倍,展示了工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

    猜你喜歡
    甾醇微球緩沖液
    高甾醇植物油研究現(xiàn)狀
    新型醋酸纖維素薄膜電泳緩沖液的研究
    懸浮聚合法制備窄尺寸分布聚甲基丙烯酸甲酯高分子微球
    卵磷脂/果膠鋅凝膠球在3種緩沖液中的釋放行為
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:12
    TiO2/PPy復(fù)合導(dǎo)電微球的制備
    可吸收止血微球在肝臟部分切除術(shù)中的應(yīng)用
    復(fù)凝法制備明膠微球
    河南科技(2014年22期)2014-02-27 14:18:07
    微波輔助植物甾醇油酸酯的酶促催化合成
    2種緩沖液對血清蛋白醋酸纖維膜電泳效果對比研究
    UPLC-MS/MS法測定多裂翅果菊中植物甾醇的含量
    欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品第一国产精品| 人人妻人人澡人人看| 黄色片一级片一级黄色片| 精品无人区乱码1区二区| 久久久国产成人精品二区 | 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美精品亚洲一区二区| 国产精品欧美亚洲77777| 欧美色视频一区免费| 久久中文字幕人妻熟女| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲精华国产精华精| 嫁个100分男人电影在线观看| 又大又爽又粗| 美女高潮到喷水免费观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 18禁美女被吸乳视频| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲男人天堂网一区| 高清视频免费观看一区二区| av有码第一页| 香蕉丝袜av| 亚洲精品自拍成人| 欧美日韩视频精品一区| av超薄肉色丝袜交足视频| 久热这里只有精品99| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产主播在线观看一区二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 久久午夜亚洲精品久久| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美日韩乱码在线| 欧美日韩成人在线一区二区| 91麻豆av在线| 看片在线看免费视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 丝袜在线中文字幕| 天天影视国产精品| 亚洲男人天堂网一区| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久99久视频精品免费| 国产片内射在线| 91老司机精品| 激情在线观看视频在线高清 | 久久亚洲真实| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲情色 制服丝袜| 高清欧美精品videossex| 国产高清视频在线播放一区| 美女午夜性视频免费| 高清视频免费观看一区二区| 在线永久观看黄色视频| 欧美最黄视频在线播放免费 | 超碰成人久久| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品国产一区二区久久| tocl精华| 操出白浆在线播放| 国产麻豆69| 狂野欧美激情性xxxx| 成人影院久久| 热re99久久国产66热| 国产精品一区二区精品视频观看| 日韩免费av在线播放| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲欧美激情在线| av有码第一页| 日本欧美视频一区| 韩国精品一区二区三区| 久久久久久人人人人人| 精品电影一区二区在线| 99久久人妻综合| 久久亚洲精品不卡| 99国产精品免费福利视频| 老司机影院毛片| 亚洲一区二区三区欧美精品| bbb黄色大片| 日韩欧美在线二视频 | 一区福利在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 国产黄色免费在线视频| 操美女的视频在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 99精品在免费线老司机午夜| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 色婷婷av一区二区三区视频| 桃红色精品国产亚洲av| 黄片大片在线免费观看| 91国产中文字幕| 国产单亲对白刺激| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美日韩亚洲高清精品| 另类亚洲欧美激情| 在线天堂中文资源库| 亚洲国产看品久久| 99久久人妻综合| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 日韩三级视频一区二区三区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久精品成人免费网站| 亚洲少妇的诱惑av| 久久亚洲精品不卡| 日韩视频一区二区在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲av第一区精品v没综合| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 看片在线看免费视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 激情在线观看视频在线高清 | 12—13女人毛片做爰片一| 国产激情欧美一区二区| 午夜成年电影在线免费观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产精品电影一区二区三区 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美av亚洲av综合av国产av| 免费少妇av软件| 国产高清激情床上av| 亚洲片人在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 夜夜爽天天搞| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 露出奶头的视频| 久久久国产精品麻豆| 成在线人永久免费视频| 99re6热这里在线精品视频| 久久中文字幕一级| 久99久视频精品免费| 久久午夜综合久久蜜桃| 不卡av一区二区三区| 亚洲 国产 在线| 国产91精品成人一区二区三区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 香蕉丝袜av| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 午夜免费鲁丝| av免费在线观看网站| av中文乱码字幕在线| 男女床上黄色一级片免费看| 免费看十八禁软件| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 又黄又粗又硬又大视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 咕卡用的链子| 精品国产乱子伦一区二区三区| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲av片天天在线观看| 色老头精品视频在线观看| ponron亚洲| 十八禁网站免费在线| 亚洲精华国产精华精| 91麻豆av在线| av不卡在线播放| 亚洲 国产 在线| 1024香蕉在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 露出奶头的视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 激情在线观看视频在线高清 | 久久久国产精品麻豆| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美日韩乱码在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 男人的好看免费观看在线视频 | 成人av一区二区三区在线看| 91成人精品电影| 久久中文看片网| 90打野战视频偷拍视频| 99re6热这里在线精品视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 免费看十八禁软件| 欧美一级毛片孕妇| 国产精品一区二区在线不卡| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品久久久久久精品古装| 久久天堂一区二区三区四区| 1024视频免费在线观看| 成人三级做爰电影| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品久久久久久,| 岛国毛片在线播放| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 久久久久国产一级毛片高清牌| 大片电影免费在线观看免费| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美最黄视频在线播放免费 | 两个人看的免费小视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产极品粉嫩免费观看在线| 一级毛片女人18水好多| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 国产成人av教育| 国产片内射在线| 国产在视频线精品| 国产一区二区三区视频了| 亚洲男人天堂网一区| 在线观看日韩欧美| 午夜91福利影院| 日本五十路高清| 性色av乱码一区二区三区2| 精品久久蜜臀av无| 午夜两性在线视频| 视频区欧美日本亚洲| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美成狂野欧美在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 三上悠亚av全集在线观看| videosex国产| 亚洲免费av在线视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 91麻豆av在线| 水蜜桃什么品种好| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 一级,二级,三级黄色视频| 在线av久久热| 搡老乐熟女国产| 国产免费男女视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 天天操日日干夜夜撸| 精品久久久久久电影网| 高清在线国产一区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 一级黄色大片毛片| 欧美在线黄色| а√天堂www在线а√下载 | 不卡一级毛片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 身体一侧抽搐| 一夜夜www| 亚洲在线自拍视频| 一a级毛片在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 51午夜福利影视在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 午夜老司机福利片| 亚洲精品国产区一区二| 一级片免费观看大全| 91九色精品人成在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久久久久久国产电影| 成人手机av| 不卡av一区二区三区| av有码第一页| 看免费av毛片| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 人妻久久中文字幕网| 精品电影一区二区在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品国产亚洲在线| 最新的欧美精品一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 90打野战视频偷拍视频| 真人做人爱边吃奶动态| 99在线人妻在线中文字幕 | 在线天堂中文资源库| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美日韩视频精品一区| 欧美成人午夜精品| 视频在线观看一区二区三区| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲av第一区精品v没综合| 看黄色毛片网站| 在线免费观看的www视频| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲伊人色综图| 免费观看a级毛片全部| 欧美精品亚洲一区二区| 精品福利永久在线观看| 国产精品久久久久成人av| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品一区二区在线观看99| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久亚洲精品不卡| av网站在线播放免费| 老熟女久久久| 精品一区二区三区四区五区乱码| 少妇粗大呻吟视频| 国产色视频综合| 欧美不卡视频在线免费观看 | 成人国语在线视频| 婷婷精品国产亚洲av在线 | 精品亚洲成国产av| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产深夜福利视频在线观看| 午夜老司机福利片| 99久久人妻综合| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品久久视频播放| 手机成人av网站| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久青草综合色| 日韩欧美三级三区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品第一国产精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 夫妻午夜视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲欧美色中文字幕在线| x7x7x7水蜜桃| 男人舔女人的私密视频| 久99久视频精品免费| 国产亚洲av高清不卡| 电影成人av| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美人与性动交α欧美软件| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲在线自拍视频| 高清视频免费观看一区二区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一进一出好大好爽视频| 精品第一国产精品| 日韩欧美三级三区| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美黑人欧美精品刺激| 精品久久久久久久久久免费视频 | 91精品三级在线观看| 欧美大码av| av在线播放免费不卡| 十分钟在线观看高清视频www| 日本五十路高清| bbb黄色大片| 精品电影一区二区在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 老熟女久久久| 亚洲一区高清亚洲精品| videos熟女内射| 99久久精品国产亚洲精品| www.自偷自拍.com| 国产区一区二久久| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲免费av在线视频| 男女午夜视频在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| tube8黄色片| 亚洲免费av在线视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲精品乱久久久久久| 国产不卡一卡二| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲片人在线观看| www.熟女人妻精品国产| 黄片小视频在线播放| 两个人看的免费小视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 在线观看www视频免费| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 成年版毛片免费区| av网站免费在线观看视频| 国产精品国产高清国产av | 妹子高潮喷水视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久久久久免费高清国产稀缺| 免费看十八禁软件| 国产精品久久久久久精品古装| 国产精华一区二区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 热99re8久久精品国产| 亚洲伊人色综图| 精品久久久久久电影网| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 首页视频小说图片口味搜索| av欧美777| 国产成人啪精品午夜网站| 国产淫语在线视频| www.熟女人妻精品国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 最近最新中文字幕大全电影3 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产区一区二久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 老司机亚洲免费影院| 99精品欧美一区二区三区四区| 色综合欧美亚洲国产小说| 99国产极品粉嫩在线观看| 日韩大码丰满熟妇| 看片在线看免费视频| 午夜福利,免费看| 777米奇影视久久| 亚洲精品在线观看二区| 国产色视频综合| 咕卡用的链子| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 中文字幕最新亚洲高清| 精品亚洲成国产av| 精品国产一区二区久久| 婷婷成人精品国产| 男女下面插进去视频免费观看| 两个人看的免费小视频| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲欧美一区二区三区久久| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久久久国产一级毛片高清牌| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美成狂野欧美在线观看| 午夜激情av网站| 黄色视频,在线免费观看| 精品第一国产精品| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 美女国产高潮福利片在线看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产高清激情床上av| 精品欧美一区二区三区在线| 村上凉子中文字幕在线| 大码成人一级视频| 啦啦啦免费观看视频1| 在线播放国产精品三级| 久久影院123| 另类亚洲欧美激情| 精品国产乱子伦一区二区三区| 天堂√8在线中文| 一区二区三区国产精品乱码| 老司机影院毛片| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产av精品麻豆| 国产成人av激情在线播放| 他把我摸到了高潮在线观看| 人人澡人人妻人| 一二三四社区在线视频社区8| 淫妇啪啪啪对白视频| 另类亚洲欧美激情| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| www.精华液| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 九色亚洲精品在线播放| videosex国产| 国产男女内射视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 搡老岳熟女国产| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久久精品区二区三区| 中亚洲国语对白在线视频| 一本综合久久免费| 亚洲人成77777在线视频| 91麻豆av在线| 亚洲精品乱久久久久久| 国产高清视频在线播放一区| 交换朋友夫妻互换小说| 黄色怎么调成土黄色| 热99久久久久精品小说推荐| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品国产亚洲在线| 日韩大码丰满熟妇| www日本在线高清视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产精品久久电影中文字幕 | 国产精品久久电影中文字幕 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| a级片在线免费高清观看视频| 国产成人av激情在线播放| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 在线播放国产精品三级| 国产精品久久电影中文字幕 | 久久香蕉精品热| 亚洲av电影在线进入| 亚洲avbb在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久精品成人免费网站| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 欧美激情 高清一区二区三区| av网站在线播放免费| 精品亚洲成a人片在线观看| 日本wwww免费看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 大香蕉久久成人网| 女同久久另类99精品国产91| 男女免费视频国产| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 麻豆国产av国片精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品久久电影中文字幕 | 老司机亚洲免费影院| 在线观看免费视频网站a站| 国产精品久久电影中文字幕 | 国产伦人伦偷精品视频| 一本大道久久a久久精品| 天天添夜夜摸| 在线观看舔阴道视频| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美国产精品一级二级三级| 精品一区二区三卡| 性少妇av在线| 亚洲专区中文字幕在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 成人黄色视频免费在线看| 精品国产亚洲在线| 日韩大码丰满熟妇| 国产精品99久久99久久久不卡| 男女下面插进去视频免费观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲精品av麻豆狂野| videosex国产| 91九色精品人成在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 99热只有精品国产| 中文字幕最新亚洲高清| 1024香蕉在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 18禁国产床啪视频网站| 91大片在线观看| 日本欧美视频一区| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久香蕉精品热| av超薄肉色丝袜交足视频| 成年人午夜在线观看视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 天天操日日干夜夜撸| 又黄又粗又硬又大视频| cao死你这个sao货| 久热爱精品视频在线9| 这个男人来自地球电影免费观看| 超碰成人久久| 99国产精品一区二区蜜桃av | 99国产综合亚洲精品| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲av熟女| 精品久久久精品久久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲av片天天在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 大陆偷拍与自拍| 日韩免费高清中文字幕av| 免费观看人在逋| 亚洲国产精品合色在线| 国产精品 国内视频| 亚洲专区国产一区二区| 欧美在线一区亚洲| 中文字幕精品免费在线观看视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 黄色毛片三级朝国网站| 国产午夜精品久久久久久| 国精品久久久久久国模美| 日本黄色日本黄色录像| av国产精品久久久久影院| 欧美激情 高清一区二区三区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 日本精品一区二区三区蜜桃| xxx96com| 欧美日本中文国产一区发布| 脱女人内裤的视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 成人亚洲精品一区在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 免费高清在线观看日韩| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产成人啪精品午夜网站| 国产xxxxx性猛交| 成人国语在线视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品久久电影中文字幕 | 日韩欧美免费精品| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 中文字幕av电影在线播放| videosex国产| 高清欧美精品videossex| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美日韩成人在线一区二区| 飞空精品影院首页| 国产区一区二久久| 成年动漫av网址| 久久影院123| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲中文字幕日韩| 久久香蕉激情| 国产精品国产av在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久香蕉激情| 亚洲精品一二三| 色老头精品视频在线观看|