新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)進(jìn)展

魏劍浩 朱召芹

摘 要 新型冠狀病毒肺炎是當(dāng)今世界最受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，實驗室檢測是其疫情防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本文主要介紹現(xiàn)常用的新型冠狀病毒實驗室檢測方法，尤其是核酸、抗原/抗體等檢測方法，同時就已見報告的部分新型冠狀病毒實驗室檢測新技術(shù)作一簡要介紹。

關(guān)鍵詞 新型冠狀病毒 實驗室檢測 核酸檢測

中圖分類號：R512.99； R446 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2021）17-0006-05

Progress in laboratory techniques for COVID-19 detection

WEI Jianhao， ZHU Zhaoqin

（Department of Clinical Laboratory， Shanghai Public Health Clinical Center， Shanghai 201508， China）

ABSTRACT Coronavirus disease 2019 （COVID-19） has been the most concerned public health disaster in the world today and laboratory detection is one of the key links for epidemic prevention and control. This article mainly introduces the commonly used laboratory detection methods for the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 （SARS-CoV-2）， especially the ones such as nucleic acid， antigen/antibody test and so on， and outlines some new technologies for its detection that have been reported.

KEy WORDS SARS-CoV-2； laboratory detection； nucleic acid test

目前，由新型冠狀病毒，即嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2， SARS-CoV-2）感染引起的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019， COVID-19）疫情已導(dǎo)致全球逾1.6億人感染，340多萬人死亡?，F(xiàn)階段我國的疫情防控重點已從嚴(yán)防本土病例暴發(fā)轉(zhuǎn)為對境外輸入病例的篩查和控制，以及對進(jìn)口物品攜帶污染及密切接觸人群的監(jiān)測[1]。隨著防疫工作的穩(wěn)步推進(jìn)，各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾病防控部門已常態(tài)化開展SARS-CoV-2檢測工作。COVID-19是一種席卷全球的傳染病，不同的國家或地區(qū)都應(yīng)找到適合自身情況的實驗室檢測方法，這是當(dāng)前各國醫(yī)學(xué)實驗室的緊急要務(wù)。本文主要介紹目前醫(yī)學(xué)實驗室常用的SARS-CoV-2檢測方法及其技術(shù)特點，同時就已見報告的部分SARS-CoV-2實驗室檢測新技術(shù)作一簡要介紹。

1 SARS-CoV-2病原學(xué)

SARS-CoV-2是一種人畜共患病病毒，其屬于β冠狀病毒屬Sarbecovirus亞屬，為單股、正鏈RNA病毒，常為多形性包膜病毒，顆粒呈圓或橢圓形，直徑60 ～ 140 nm。SARS-CoV-2含有4種結(jié)構(gòu)蛋白，即刺突蛋白、核衣殼蛋白、膜蛋白和包膜蛋白。SARS-CoV-2通過刺突蛋白調(diào)節(jié)與受體結(jié)合和膜融合的過程，并通過刺突蛋白1B結(jié)構(gòu)域特異性地識別宿主細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin-converting enzyme 2， ACE2）。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的刺突蛋白對ACE2的親和力較嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus， SARS-CoV）高約10 ～ 20倍[2-3]，這可能是導(dǎo)致SARS-CoV-2在人群中傳播更廣的原因（表1）。

2 SARS-CoV-2的實驗室檢測

目前，國內(nèi)對SARS-CoV-2的實驗室檢測方法主要有肺部影像學(xué)檢查、病毒培養(yǎng)及檢測、病毒相關(guān)核酸檢測、病毒特異性抗原/抗體檢測等（表2）。

2.1 肺部影像學(xué)檢查

在COVID-19疫情暴發(fā)初期，影像學(xué)檢查是篩查和發(fā)現(xiàn)患者非典型肺部炎癥的基本依據(jù)[7-8]。但COVID-19的影像學(xué)表現(xiàn)并不一致，肺部CT檢查時常可見患者雙肺多葉磨玻璃樣混濁或肺部實變影，呈周圍或后部分布樣征象。由于存在這些影像學(xué)特征，一些回顧性研究認(rèn)為，肺部CT檢查篩查COVID-19的敏感性高（86% ～ 98%），但特異性較低[5]。但也有研究指出，發(fā)熱、胃腸道癥狀、感覺減退/喪失或精神神經(jīng)癥狀仍可能是COVID-19患者早期的唯一表現(xiàn)[9]。另外，肺部影像學(xué)檢查也不適用于SARS-CoV-2感染窗口期和無癥狀的感染者[7]。

2.2 病毒培養(yǎng)及檢測

病毒培養(yǎng)及檢測是病原學(xué)鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，也是目前最貼近科霍原則（Kochs postulates）的COVID-19實驗室診斷方法，所獲病毒株還是檢測試劑、疫苗研發(fā)和抗病毒藥物篩選等研究的重要基礎(chǔ)。特別是在當(dāng)前英國、巴西、印度等國出現(xiàn)SARS-CoV-2變異株后，我們亟需對這些突變株的傳播能力、致病力和免疫逃逸能力等作進(jìn)一步的研究。鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物等臨床樣本均可通過接種人呼吸道上皮細(xì)胞、猴腎細(xì)胞Vero-E6和人肝癌細(xì)胞Huh-7細(xì)胞系等進(jìn)行分離培養(yǎng)，應(yīng)選取經(jīng)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）法和/或下一代測序技術(shù)（nextgeneration sequencing， NGS）檢測為病毒核酸陽性且病毒載量較高的樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)。受感染細(xì)胞多從細(xì)胞邊緣開始出現(xiàn)病變或首先變成不規(guī)則形態(tài)，然后細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多，最后細(xì)胞圓縮、脫落，而健康的對照細(xì)胞形態(tài)保持良好。此時可收集培養(yǎng)細(xì)胞，并分離出病毒培養(yǎng)株。SARS-CoV-2的培養(yǎng)必須在具備生物安全三級及以上資質(zhì)的實驗室內(nèi)進(jìn)行，不得在臨床常規(guī)生物安全二級的實驗室中進(jìn)行，且需有先進(jìn)的實驗設(shè)施和專業(yè)的技術(shù)人員，成本高，操作時感染風(fēng)險大，故不推薦用作為COVID-19的常規(guī)診斷方法。

2.3 SARS-CoV-2核酸檢測

根據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會等發(fā)布的新版COVID-19診療方案，病毒核酸檢測陽性仍是發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2攜帶者（SARS-CoV-2核酸陽性，但無明顯的臨床和影像學(xué)表現(xiàn)且血清特異性SARS-CoV-2抗體陰性者）和確診SARS-CoV-2感染的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)。SARS-CoV-2檢測的靶基因主要包括病毒核酸中開放讀碼框1ab、核衣殼蛋白、包膜蛋白和刺突蛋白的編碼基因。國內(nèi)迄今批準(zhǔn)的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒均是以上述基因中的1個或多個位點作為靶標(biāo)來進(jìn)行檢測的。有專家建議，可同時檢測2個及以上的靶標(biāo)，以保證結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性[2]。國內(nèi)市場上針對上述靶標(biāo)設(shè)計的核酸擴(kuò)增檢測試劑盒多達(dá)數(shù)十種，檢測方法主要有實時熒光PCR（realtime PCR， RT-PCR）法、恒溫擴(kuò)增法、雙擴(kuò)增法、聚類規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）/CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR associated proteins， Cas）檢測法，以及基于NGS的核酸檢測方法等。

2.3.1 RT-PCR法

RT-PCR法是目前國內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的SARS-CoV-2核酸檢測方法，其能在1次反應(yīng)中對樣本中的多個靶標(biāo)進(jìn)行檢測，這些靶標(biāo)既可是同一病原體的不同靶標(biāo)，也可是不同病原體的同一特征性靶標(biāo)。但在對COVID-19患者的臨床檢測中須注意，單次咽拭子采樣核酸檢測的陽性率并不高，約為30% ～ 50%[1]，故陰性結(jié)果不能排除SARS-CoV-2感染，需進(jìn)一步排除樣本采集、運輸和實驗室操作等各環(huán)節(jié)中可能存在的問題，對疑似感染患者應(yīng)重復(fù)多次采樣檢測來避免檢測結(jié)果假陰性可能。

2.3.2 恒溫擴(kuò)增法

與傳統(tǒng)PCR法經(jīng)一系列重復(fù)的變溫過程和30 ～ 40個循環(huán)完成檢測不同，恒溫擴(kuò)增法的擴(kuò)增反應(yīng)多于60 ～ 65 ℃下進(jìn)行，在特異性引物和酶的作用下1 h左右時間內(nèi)即可大量擴(kuò)增目標(biāo)基因，然后通過肉眼或使用熒光染料（如SYBR綠等）進(jìn)行簡單的光度測量就能觀察到結(jié)果了。恒溫擴(kuò)增法被認(rèn)為是一種具有高敏感性、高特異性、高效益成本比、高效率和快速的DNA擴(kuò)增技術(shù)，有研究判斷該方法的靈敏度較傳統(tǒng)PCR法高10倍左右[6]。恒溫擴(kuò)增法還有擴(kuò)增步驟相對簡便的特點，這使其率先成為SARS-CoV-2即時檢測所用核酸擴(kuò)增技術(shù)[10]。我國學(xué)者創(chuàng)新性地將恒溫擴(kuò)增技術(shù)與微流控芯片技術(shù)結(jié)合起來，設(shè)計出適配于智能手機(jī)攝像功能的檢測模塊，希望能夠構(gòu)建一種患者自行采樣檢測—智能手機(jī)上傳檢測結(jié)果—云端分析—反饋結(jié)果的SARS-CoV-2檢測新模式，目前正處于科研階段[11]。但恒溫擴(kuò)增法也有缺點和不足，如對引物集的設(shè)計要求較高，需有熟練的操作人員和良好的實驗室規(guī)范來防止污染，需要專門的實驗室（區(qū)域）來進(jìn)行檢測等。

2.3.3 CRISPR/Cas檢測法

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌的免疫系統(tǒng)，用于對抗外來DNA和RNA的入侵。細(xì)菌通過CRISPR RNA和Cas識別目標(biāo)DNA和RNA，并將入侵的外來核酸裂解。研究顯示，利用CRISPR和Cas，主要是Cas12a和Cas13，可用于檢測樣本中的特異性核酸[12]。Cas12a和Cas13能分別與引導(dǎo)RNA序列指定的RNA或DNA靶標(biāo)結(jié)合，然后無差別地剪切含熒光信號的DNA/RNA探針而產(chǎn)生擴(kuò)增信號[13]。可利用Cas12a或Cas13結(jié)合SARS-CoV-2的特定靶標(biāo)，通過裂解報告分子來檢測有無病毒。已有研究利用基于CRISPR/Cas13的特異性高靈敏度酶促解鎖技術(shù)完成SARS-CoV-2的檢測，成功篩檢出10 ～ 100 copies/μL的樣本[10]。目前，更多的研究者正在研究將多種擴(kuò)增技術(shù)與CRISPR/Cas技術(shù)結(jié)合起來，以使CRISPR/Cas檢測法發(fā)展成為SARS-CoV-2 RNA的下一代快速檢測工具[5， 11]。

2.3.4 NGS

在COVID-19疫情初期，NGS即成功幫助我們迅速從患者的樣本中鑒定出SARS-CoV-2的基因組序列，找到此次疫情的“元兇”[14]。根據(jù)WHO和我國聯(lián)合發(fā)布的報告，僅2019年12月底—2020年2月中旬，我國就分離出104株SARS-CoV-2病毒株，并運用Illumina測序和Oxford納米孔測序技術(shù)對它們進(jìn)行了測序[15]。Illumina測序是一種使用固相橋放大的序列合成方法，而Oxford納米孔測序則涉及將DNA分子通過蛋白質(zhì)孔移位，是經(jīng)測量移位前后的電壓變化來確定DNA序列的。2020年6月，美國FDA同意可緊急使用Illumina公司基于NGS的COVID-19診斷方法[6]，這是NGS首次被批準(zhǔn)用于疾病診斷?；蚪M測序?qū)τ谠O(shè)計PCR法和其他核酸檢測的引物和探針序列非常重要。但在國內(nèi)，NGS目前尚主要用于科研探索，尚無大規(guī)模臨床應(yīng)用的實例。

2.4 SARS-CoV-2特異性抗原/抗體檢測

SARS-CoV-2的免疫檢測是SARS-CoV-2實驗室檢測的重要組成，并被認(rèn)為是SARS-CoV-2核酸檢測的重要補充[3， 16]。國內(nèi)現(xiàn)有的SARS-CoV-2抗原/抗體檢測方法均為定性檢測方法，還無法對抗原/抗體進(jìn)行定量檢測。

SARS-CoV-2的特異性抗原檢測相對困難，主要的免疫檢測抗原靶標(biāo)是病毒的核衣殼蛋白和刺突蛋白，通常僅在患者急性感染期或血液中病毒載量較高時檢測才可得到陽性結(jié)果，故尚不能單獨用于COVID-19患者的診斷和鑒別[10]。國內(nèi)迄今批準(zhǔn)的SARS-CoV-2抗原檢測試劑為數(shù)不多。

現(xiàn)有的大多數(shù)SARS-CoV-2免疫檢測試劑都為針對患者血液或體液中的特異性抗體的檢測試劑，它們一般以病毒的核衣殼蛋白和刺突蛋白作為捕獲抗原，檢測的是樣本中對應(yīng)的免疫球蛋白M和免疫球蛋白G。國內(nèi)已批準(zhǔn)的SARS-CoV-2抗體檢測方法主要有化學(xué)發(fā)光法、膠體金法、熒光免疫層析法、橫向流動免疫分析（lateral flow immunoassay， LFIA）法和酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）法?；瘜W(xué)發(fā)光法具有線性范圍寬、通量高、自動化程度高、操作易于標(biāo)準(zhǔn)化等特點，但其依賴于特定的化學(xué)發(fā)光檢測儀，成本較高，臨床應(yīng)用受到一定的限制；膠體金法、熒光免疫層析法和LFIA法操作簡便、快捷，對檢測人員和場所的要求不高，適用于基層醫(yī)療單位和現(xiàn)場篩查，但靈敏度較低；ELISA法同樣較核酸檢測操作簡便、快捷，但其需使用特異性和高親和力的第二抗體（有時需使用昂貴的重組抗體），使之在即時檢測中的應(yīng)用受到限制。有研究顯示，ELISA法檢測SARS-CoV-2核衣殼蛋白免疫球蛋白G的敏感性顯著高于檢測其刺突蛋白免疫球蛋白G的敏感性[6]，但檢測免疫球蛋白G和免疫球蛋白M的敏感性是否也存在差異則還未見相關(guān)報告。分析SARS-CoV-2抗體檢測相關(guān)研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，單獨檢測免疫球蛋白M或免疫球蛋白G的特異性較好，而同時檢測免疫球蛋白M和免疫球蛋白G或聯(lián)合檢測總抗體（免疫球蛋白M、免疫球蛋白G和免疫球蛋白A）可提高檢出率[17-18]，但應(yīng)注意此時易受類風(fēng)濕因子、抗核抗體、嚴(yán)重黃疸等因素的影響而出現(xiàn)假陽性結(jié)果[2]。

需指出的是，抗體檢測可用于核酸檢測陰性的疑似感染患者的補充檢測或聯(lián)合核酸檢測用于疑似感染患者的診斷，但不能替代核酸檢測單獨用作為SARS-CoV-2感染與否的依據(jù)，亦不適用于一般人群的篩查[4]。隨著SARS-CoV-2疫苗接種人群的逐漸擴(kuò)大，詳細(xì)詢問患者的疫苗接種史和免疫相關(guān)基礎(chǔ)疾病對理解其抗體水平的變化及抗體檢測結(jié)果至關(guān)重要。此外，無論是抗原還是抗體檢測，臨床上多使用患者的血清樣本進(jìn)行檢測。但有研究表明，對血清樣本熱滅活會影響SARS-CoV-2抗體檢測的結(jié)果，尤其對免疫球蛋白M檢測結(jié)果的影響更大[19]。因此，在采用ELISA法等免疫分析法檢測SARS-CoV-2抗體時，患者的血清樣本最好不經(jīng)熱滅活等預(yù)處理。不過，此時患者的血清樣本仍有感染能力，實驗室人員應(yīng)注意操作的規(guī)范性和安全性。膠體金法和LFIA法等免疫檢測法還易受環(huán)境因素如溫度、濕度等的影響，故須對檢測環(huán)境進(jìn)行控制。

2.5 其他實驗室檢測技術(shù)

對SARS-CoV-2感染，除上述實驗室檢測方法外，新的實驗室檢測技術(shù)也不斷涌現(xiàn)，其中生物傳感器病毒檢測平臺（biosensing platforms for detecting viruses， BPFDV）就是這些新技術(shù)的代表之一。生物傳感器通常由功能受體、傳感器和信號探測器/分析儀組成，其可感知目標(biāo)分子并直接向終端用戶發(fā)送光或電信號等反饋信息。隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，功能性材料和結(jié)構(gòu)強(qiáng)化技術(shù)的進(jìn)步降低了關(guān)鍵器件的信噪比和采樣響應(yīng)時間，使得基于生物傳感器的診斷技術(shù)取得了較大進(jìn)步。BPFDV被認(rèn)為是未來緩解PCR法檢測壓力的有效替代解決方案之一[6， 19]。我國Shan等[20]致力于研究SARSCoV-2感染后釋放的揮發(fā)性有機(jī)化合物，以金納米顆粒作為傳感器陣列檢測呼出氣中的疾病特異性生物標(biāo)志物，研發(fā)的裝置能通過揮發(fā)性有機(jī)化合物與金納米顆粒表面發(fā)生連接反應(yīng)所引起的電阻信號的變化來完成檢測。不過，這種呼出氣分析儀雖具有快速篩查COVID-19的潛力，但易受環(huán)境濕度和背景疾病等因素的影響，檢測的敏感性和準(zhǔn)確性均離臨床應(yīng)用的要求有不小的距離[6]。

此外，作為世界人口數(shù)量第一的大國，我國的國情決定了各級醫(yī)學(xué)實驗室需要具備大規(guī)模檢測SARSCoV-2的能力。但在一些發(fā)達(dá)國家，如美國和一些歐洲國家，人口數(shù)量較少或人口密度較低，故更關(guān)注那些便于攜帶并能快速進(jìn)行COVID-19篩查的便攜式即時檢測設(shè)備。這是國外SARS-CoV-2即時檢測產(chǎn)品發(fā)展迅速的主要原因，相關(guān)產(chǎn)品包括GenMark DX公司的ePlex系統(tǒng)、Cepheid公司的Xpert Xpress SARS-CoV-2檢測系統(tǒng)、Abbott公司的ID NOW檢測系統(tǒng)、Bosch Healthcare Solutions公司的Vivalytic VRI平臺和BioFire Defense公司的FilmArray系統(tǒng)等。Zhen等[21]的研究顯示，Xpert Xpress SARS-CoV-2檢測系統(tǒng)的陽性符合率為98.3%，檢測下限為100 copies/mL；ID NOW檢測系統(tǒng)的陽性符合率為87.7%，檢測下限為20 000 copies/mL；ePlex系統(tǒng)的陽性符合率為91.4%，檢測下限為1 000 copies/mL。在檢測所需時間方面，ID NOW檢測系統(tǒng)僅需17 min，大大少于Xpert Xpress SARS-CoV-2檢測系統(tǒng)的46 min和ePlex系統(tǒng)的約1.5 h。

3 結(jié)語

COVID-19的大流行突出了實驗室診斷在傳染病防控方面的關(guān)鍵作用，也對我國各級醫(yī)學(xué)實驗室的能力建設(shè)提出了更高要求。我國目前的SARS-CoV-2檢測主要在各級定點醫(yī)學(xué)實驗室進(jìn)行。因此，樣本運送和結(jié)果報告反饋仍需耗費一定的時間。此外，大量樣本的檢測給實驗室人員帶來了過重的工作壓力，并可能提高交叉污染發(fā)生的風(fēng)險。針對現(xiàn)有檢測體系的不足，我們應(yīng)盡快研發(fā)出高通量、多靶標(biāo)、快速、自動化的檢測系統(tǒng)，在保證精度和準(zhǔn)確性的同時，減少對實驗室條件的依賴，推行分散篩查，提高檢測效率，降低患者外出就診傳播疾病的風(fēng)險。

目前，雖已有中、美、俄、英等國研發(fā)的十余種SARS-CoV-2疫苗獲準(zhǔn)緊急使用，但在世界范圍內(nèi)疫苗的分配和接種情況并不均衡。部分國家和地區(qū)的COVID-19疫情仍然十分嚴(yán)峻，特別是在部分國家和地區(qū)檢出的SARS-CoV-2新突變株，它們具有更強(qiáng)的傳染性、致病性和免疫逃逸能力，這給實驗室檢測工作敲響了警鐘。醫(yī)學(xué)實驗室應(yīng)做好進(jìn)一步提高檢測能力的準(zhǔn)備，以應(yīng)對疫情變化帶來的新挑戰(zhàn)。

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