miR-22在急性Stanford A型主動脈夾層患者中的表達

孫 龍，郝迎學(xué)

(中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)(第三軍醫(yī)大學(xué))第一附屬醫(yī)院，重慶 400038)

急性Stanford A型主動脈夾層是一種危險性極高的心臟大血管疾病，及時診治是挽救患者生命的關(guān)鍵[1].有研究[2]顯示：D-二聚體、腦型肌酸激酶等實驗室指標(biāo)在急性Stanford A型主動脈夾層快速診斷中具有一定的價值，但特異性和敏感度仍欠佳.探討急性Stanford A型主動脈夾層的發(fā)病機制對提升該類患者的臨床診治水平具有重要意義[3].近年來的研究[4]顯示：miRNA分子能夠調(diào)控血管炎癥反應(yīng)，在腦卒中、冠心病等心腦血管疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用.相關(guān)研究[5]顯示：miR-22靶向作用于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)，誘發(fā)異常的免疫炎癥反應(yīng)，加速心肌細胞衰老和心臟成纖維細胞失活，參與冠心病的發(fā)生與發(fā)展，但在主動脈夾層病變中作用的相關(guān)研究報道仍十分少見.本研究主要探討miR-22在急性Stanford A型主動脈夾層患者中的表達特點及可能的作用機制.

1 對象與方法

1.1 一般資料

選取2018年4月—2019年10月中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診入院的急性Stanford A型主動脈夾層患者26例為研究組，其中，男20例，女6例；年齡33～74歲，平均(56.28±8.59)歲.

入選標(biāo)準(zhǔn)：入院時急診CT檢查確診為急性Stanford A型主動脈夾層；患者家屬自愿參與本研究.

排除標(biāo)準(zhǔn)：存在認(rèn)知功能障礙；臨床資料不完整或標(biāo)本采集不達標(biāo).

另收集同期收治的瓣膜性心臟病患者26例為對照組，其中，男22例，女4例；年齡36～71歲，平均(55.60±9.15)歲.

入選標(biāo)準(zhǔn)：接受主動脈瓣膜置換術(shù)治療，患者家屬自愿參與本研究.

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并胸膜主動脈夾層、大動脈炎、馬凡綜合征等主動脈病變的患者.

兩組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性.本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批號：LGI2018-013).

1.2 主要試劑與儀器

Trizol試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白測定試劑盒(廣州國奧生物技術(shù)有限公司)；兔抗人NLRP3單克隆抗體、鼠抗人含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1單克隆抗體、鼠抗人Caspase-3單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP(北京博蕾德科技有限公司)；PTC-200 PCR擴增儀(Bio-Rad公司，美國)；DU800紫外分光光度計(Beckman公司，美國)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國).

1.3 方 法

1.3.1 標(biāo)本采集與處理

采集兩組患者空腹外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝處理，室溫下放置30 min，2 000 r/min離心30 min，將上層血清分裝到離心管中，編號后置于-80 ℃保存.術(shù)中采集邊長約0.5 cm的主動脈壁組織標(biāo)本，10%甲醛溶液固定后存放于EP管中，編號后置于-80 ℃保存.

1.3.2 RT-PCR檢測

取血清和主動脈壁組織標(biāo)本，使用Trizol試劑盒抽提總RNA，測定濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.miR-22、NLRP3、Caspase-1、Caspase-3及內(nèi)參GAPDH引物設(shè)計由廣州伯信生物科技公司完成.miR-22引物序列：上游5′-TGGGTACCTTAAG TCAAGAGTG-3′；下游5′-AGGTGCTGTGGTC AACT CAGTT-3′.NLRP3引物序列：上游5′-GGTCGACC TCACACATGGGTCC-3′；下游5′-GGATGTGTTACG GACACCA-3′.Caspase-1引物序列：上游5′-CTGAC TGATGGAGTACTTCT-3′；下游5′-CCTCGACGTTCC TCCAACAT-3′.Caspase-3引物序列：上游5′-CTCA TGTAGTGGTCGTCGTAG-3′；下游5′-CCGTCATTA GGCGGTC GGAA-3′.GAPDH引物序列：上游5′-A GTCTCGTTACGTAGGACGTGGTG-3′；下游5′-GCG GTATGA GTCGTGGTCGTAG-3′.反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，共30個循環(huán)，延伸72 ℃ 2 min.行2%瓊脂糖凝膠電泳，以GAPDH為內(nèi)參，計算相對表達量.

1.3.3 Western blot檢測

RIPA裂解動脈壁組織提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度.取蛋白樣品50 μg行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，滴加兔抗人NLRP3單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人Caspase-1單克隆抗體(1∶200稀釋)、鼠抗人Caspase-3單克隆抗體(1∶200稀釋)，4 ℃過夜，滴加羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP(1∶2 000稀釋)，室溫靜置1 h，ECL顯色，暗室中顯影，使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)讀取各目標(biāo)條帶的灰度值.

1.3.4 血清炎癥因子水平檢測

取血清標(biāo)本，使用Elisa試劑盒檢測血清白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10、IL-18、核因子κB(NF-κB)、基質(zhì)金屬蛋白酶16(MMP-16)濃度，操作按說明書進行.應(yīng)用紫外分光光度計讀取吸光度值，用說明書提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算濃度.

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者臨床資料

研究組患者突發(fā)性撕裂樣胸痛、心功能分級Ⅲ～Ⅳ級、冠狀動脈受累、重度主動脈瓣關(guān)閉不全的患者比例明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).見表1.

表1 兩組患者臨床資料Tab.1 Clinical data of patients in the two groups

2.2 兩組患者外周血血清及主動脈組織中miR-22表達水平

研究組患者外周血血清中miR-22表達水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；研究組患者主動脈壁組織中miR-22表達水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).見表2.

表2 兩組患者外周血血清及主動脈組織中miR-22表達水平

2.3 兩組患者主動脈組織中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的mRNA和蛋白表達水平

研究組患者主動脈組織中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的mRNA表達水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；研究組患者主動脈組織中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的蛋白表達水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).見圖1，表3.

1～3對照組；4～6研究組.圖1 主動脈組織中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3 蛋白表達的Western blot電泳Fig.1 Western blot electrophoresis of NLRP3，Caspase-1 and Caspase-3 protein expression in aortic tissue

2.4 兩組患者外周血血清炎癥因子水平

研究組患者外周血IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、NF-κB、MMP-16水平均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).見表4.

表3 兩組患者主動脈組織中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的mRNA和蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of NLRP3，Caspase-1，Caspase-3 mRNA and protein in aortic tissue of two groups

3 討 論

急性Stanford A型主動脈夾層具有很高的致死率，早期及時診斷和治療是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵.D-二聚體、腦型肌酸激酶、肌球蛋白等臨床常用的主動脈夾層診斷指標(biāo)具有一定的價值，但缺乏敏感度和特異性[6].探討急性Stanford A型主動脈夾層的發(fā)病機制對疾病的早期診斷與治療具有重要意義.近年來的研究[7-8]顯示：miR-22靶向調(diào)控NLRP3基因參與大鼠主動脈夾層的發(fā)生與發(fā)展，其中，炎癥因子異常表達和細胞凋亡發(fā)揮重要作用.在此基礎(chǔ)上，本研究采用RT-PCR和Western blot檢測miR-22及其可能的靶向調(diào)控基因在急性Stanford A型主動脈夾層患者中的表達情況，并探討相關(guān)作用.本研究結(jié)果顯示：研究組患者外周血血清及主動脈組織中miR-22表達水平明顯高于對照組，提示miR-22在急性Stanford A型主動脈夾層患者中存在高表達，與上述基礎(chǔ)研究中的結(jié)論一致.進一步的研究發(fā)現(xiàn)：研究組患者主動脈組織中NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的mRNA和蛋白表達水平均明顯高于對照組，可推測miR-22高表達能夠靶向作用于NLRP3，并升高NLRP3的表達水平，另外，NLRP3炎癥小體激活能夠誘發(fā)Caspase-1、Caspase-3活化，進而上調(diào)Caspase-1、Caspase-3表達水平.

多項研究[9-10]結(jié)果顯示：NF-κB是一種可與免疫球蛋白基因κB序列特異性結(jié)合的蛋白，NF-κB過度激活參與自身免疫性炎癥和動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展，主動脈夾層可能與NF-κB介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān).MMPs是鋅離子依賴性蛋白水解酶家族，能夠調(diào)節(jié)機體的炎癥反應(yīng)和降解細胞外基質(zhì)，與多個炎癥信號通路和細胞凋亡有關(guān)，與夾層動脈瘤的發(fā)生密切相關(guān)[11-13].研究[14-15]發(fā)現(xiàn)：MMP-16能夠通過在胞外特異性活化MMP-2，引發(fā)MMP-2與TIMP-2之間的平衡失調(diào)，動脈細胞外基質(zhì)降解，膠原彈性纖維含量下降，促進主動脈中層的退行性病變，是主動脈夾層發(fā)生與發(fā)展的病理基礎(chǔ)之一.白細胞介素是多種細胞分泌的炎性因子，在信號傳遞、激活和調(diào)節(jié)免疫細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞活化增殖中均發(fā)揮重要作用[16-17].相關(guān)研究[18-21]顯示：活化的NLRP3小體能夠促進Caspase-1活化，進而誘發(fā)IL-1β、IL-10、IL-18的成熟與分泌；主動脈夾層形成時，血管內(nèi)皮細胞能夠激活Caspase-1、巨噬細胞分泌炎癥因子.本研究結(jié)果顯示：研究組患者外周血IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、NF-κB、MMP-16水平均明顯高于對照組，提示急性Stanford A型主動脈夾層患者存在炎癥因子高表達，可能與病情的發(fā)生與發(fā)展有關(guān).

綜上所述，急性Stanford A型主動脈夾層是一種多因素共同參與的疾病，miR-22是易感基因，能夠通過上調(diào)NLRP3、Caspase-1、Caspase-3的表達，激活免疫炎癥反應(yīng)，誘發(fā)IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18、NF-κB、MMP-16的大量分泌，最終導(dǎo)致主動脈夾層強度降低和結(jié)構(gòu)弱化，增加了急性Stanford A型主動脈夾層的發(fā)生風(fēng)險.