轉(zhuǎn)錄組分析二馬牙和長(zhǎng)脖類型林下參表型差異

李舒欣, 張浩, 鄭厚勝,2, 鄭培和, 逄世峰, 許世泉*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所， 長(zhǎng)春 130112; 2吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院， 長(zhǎng)春 130118)

人參(PanaxginsengC.A. Mey.)被譽(yù)為“百草之王”，已有幾千年的藥用歷史，幾乎應(yīng)用于中醫(yī)各科臨床，現(xiàn)代藥理學(xué)也證明人參具有抗疲勞[1-3]、抗腫瘤[4-5]、降血糖[6-8]和提高免疫力[9-10]等諸多功效。由于人參生長(zhǎng)所需的生態(tài)環(huán)境遭到破壞，加之人們過(guò)度采挖，野生人參資源幾近枯竭，當(dāng)前來(lái)源主要為人工栽培(園參)和仿生栽培(林下參)2種途徑。與園參相比，林下參經(jīng)濟(jì)價(jià)值更高，不僅對(duì)生長(zhǎng)年限有要求，更注重五形六體[11]，其品質(zhì)也可與野生人參媲美。但林下參種植存在投資多、回報(bào)周期長(zhǎng)等問(wèn)題，因此林下種植人參的選種問(wèn)題極為重要。

由于人參馴化時(shí)間短，群體間遺傳多樣性高，野山參的形態(tài)特征也呈現(xiàn)多樣化。判斷林下參外觀品質(zhì)包括蘆(根莖)、艼(蘆上不定根)、體(主根)、紋(主根肩上的環(huán)紋)、須(支根上生長(zhǎng)較細(xì)的根)[12]，其中蘆頭包括雁脖蘆、二馬牙、堆花、縮脖蘆等，艼有棗核艼、毛毛艼、艼變等，體有靈體、疙瘩體、順體、過(guò)梁體、笨體、橫體等不同形態(tài)，紋講究細(xì)而深，須講究柔韌性，有彈性及珍珠點(diǎn)。我國(guó)栽培的人參在培養(yǎng)馴化過(guò)程中形成了馬牙型和長(zhǎng)脖型兩大系統(tǒng)七個(gè)品系[13]，馬牙系統(tǒng)包括大馬牙、二馬牙，長(zhǎng)脖系統(tǒng)包括長(zhǎng)脖、圓膀圓蘆、竹節(jié)蘆、線蘆、草廬。二馬牙和長(zhǎng)脖類型差異較大，蘆、艼、體、紋、須均存在差異[14]：二馬牙型林下參蘆較短粗壯，蘆碗大而明顯，主根較粗長(zhǎng)，多順體，產(chǎn)量較長(zhǎng)脖高；長(zhǎng)脖型林下參蘆細(xì)長(zhǎng)，蘆碗較小，體長(zhǎng)而順直，多順體，少笨體。馬小軍[15]利用RAPD和AFLP技術(shù)分析5種農(nóng)家品種，與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果有一致性，二馬牙與長(zhǎng)脖親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。雖然已有研究表明這2個(gè)類型人參皂苷含量存在一定差異，但是其化學(xué)成分和形態(tài)差異的分子機(jī)制尚不明確[16]。

高通量測(cè)序可以高效、快捷地獲得基因序列，覆蓋全部轉(zhuǎn)錄本，在挖掘功能基因中得到廣泛應(yīng)用[17]。目前采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)在人參皂苷生物合成[18-22]、抗病基因篩選[23-24]、連作障礙[25-26]等研究中取得豐碩成果，但關(guān)于不同類型人參種質(zhì)資源的轉(zhuǎn)錄組分析尚未見報(bào)道。本文通過(guò)比較二馬牙與長(zhǎng)脖的表型特征以及轉(zhuǎn)錄水平的差異，篩選調(diào)控林下參形態(tài)特征的差異基因，為林下參的品種選育以及揭示林下參表型差異的分子機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料選自同一林下環(huán)境13年生二馬牙(E)和長(zhǎng)脖(C)農(nóng)家品種，移栽至吉林省吉林市左家鎮(zhèn)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所許世泉研究員鑒定。試驗(yàn)地為闊葉林，北坡，坡度5°左右，土壤類型為黑色腐殖土。

樣品采集：第二年人參生長(zhǎng)至14年生開花后期，采集葉片(LD)、蘆頭(T)和蘆頭以下5 cm主根(G)用于RNA-seq，設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。再選擇三株長(zhǎng)勢(shì)一致的人參，組間隨機(jī)選取三株根部樣品，測(cè)量9種人參皂苷Rg1、Re、Rf、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的含量，45 ℃烘干，磨成粉，參照逄世峰等[31]方法測(cè)定人參皂苷含量。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.2.1文庫(kù)構(gòu)建及質(zhì)控 文庫(kù)構(gòu)建委托百邁客生物科技有限公司完成。用Trizol試劑盒(Invitrogen,USA)分別提取18個(gè)樣品的總RNA，用Nanodrop 2000 與 Agilent 2100 檢測(cè)總 RNA 質(zhì)量、純度和完整性。樣品檢測(cè)合格后構(gòu)建文庫(kù)：①用帶有OligodT的磁珠富集mRNA；②加入Fragmentation Buffer將mRNA隨機(jī)打斷；③以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)反轉(zhuǎn)錄第一條cDNA鏈，合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA；④純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇；⑤最后通過(guò)PCR富集得到cDNA文庫(kù)。

文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Qubit 2.0熒光計(jì)和 Agilent 2100檢測(cè)插入片段在基因上的分布以及插入片段長(zhǎng)度，評(píng)估m(xù)RNA片段化的隨機(jī)性、mRNA的降解情況、插入片段長(zhǎng)度的離散程度，使用QPCR方法準(zhǔn)確定量文庫(kù)的有效濃度(>2 nmol·L-1)，以保證文庫(kù)質(zhì)量。

1.2.2測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 庫(kù)檢合格后用Illumina Hiseq 2000平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

測(cè)序數(shù)據(jù)首先用q20質(zhì)控對(duì)原始Reads進(jìn)行過(guò)濾，去除接頭N比例大于10%以及質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整條Read50%以上的Reads，得到Clean Reads。然后將各樣品的Clean Reads用HISAT2軟件[27]與指定的參考基因組[28]進(jìn)行序列比對(duì)，利用String Tie[29]對(duì)比對(duì)上的reads進(jìn)行組裝得到Mapped Data。

1.2.3測(cè)序數(shù)據(jù)分析 使用BLAST軟件將Mapped Data在 NR、GO、KOG、KEGG 和 Swiss-Prot 等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋，用FPKM方法計(jì)算基因的表達(dá)量。利用百邁克云平臺(tái)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，設(shè)置錯(cuò)誤率FDR≤0.1、絕對(duì)值 log2FC≥2，將兩類型對(duì)應(yīng)部位進(jìn)行比較，篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed gene，DEGs)，對(duì)其進(jìn)行GO及KEGG等富集分析，深入挖掘關(guān)鍵通路數(shù)據(jù)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

篩選7個(gè)蘆頭部位代表性差異表達(dá)基因，用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)其表達(dá)量檢測(cè)。使用scaffold128323為內(nèi)參基因，根據(jù)差異表達(dá)基因核苷酸序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表1)。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TUREscript 1stStand cDNA SYNTHESIS Kit，Aidlab公司)得到cDNA，-80 ℃保存。使用熒光定量PCR儀(analytikjena-qTOWER2.2型，德國(guó))進(jìn)行熒光定量PCR(10 μL反應(yīng)體系：5 μL 2×SYBR?Green Supermix、正反引物各0.5 μL、1 μL cDNA模板、3 μL ddH2O；反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；熔解曲線60～95 ℃，升溫程序1 ℃，持續(xù)4 s)。按2-△△Ct相對(duì)定量法[30]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，設(shè)計(jì) 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 定量PCR引物信息Table 1 Primers used for qRT-PCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種類型林下參的形態(tài)特征分析

2.1.1根部表型差異 兩種類型林下參的根部性狀如圖1所示：兩類型主根長(zhǎng)無(wú)顯著差異，二馬牙的蘆頭直徑及根質(zhì)量均極顯著高于長(zhǎng)脖，而蘆頭的長(zhǎng)度極顯著低于長(zhǎng)脖。因此，14年生同環(huán)境的二馬牙根部較長(zhǎng)脖更加粗壯，產(chǎn)量更高，較同年生長(zhǎng)脖短，長(zhǎng)脖的蘆頭細(xì)長(zhǎng)。觀察所有樣參發(fā)現(xiàn)，二馬牙的須根較長(zhǎng)脖更加發(fā)達(dá)。

注：**和*表示兩個(gè)品種間差異在P<0.01和P<0.05水平具有顯著性。Note：** and * indicate significant difference at P<0.01 and P<0.05 levels, respectively.圖1 兩種類型林下參根部性狀差異比較Fig.1 Comparison of root traits of two types of forest cultivated Panax ginseng

2.1.2地上部分差異 分析兩種類型林下參地上部分的農(nóng)藝性狀差異(圖2)發(fā)現(xiàn)，二馬牙的果柄直徑極顯著大于長(zhǎng)脖，莖高顯著大于長(zhǎng)脖，其余4項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著。說(shuō)明二馬牙較長(zhǎng)脖地上部分也更粗壯，利于光合產(chǎn)物的積累。

注：**和*表示兩個(gè)品種間差異在P<0.01和P<0.05水平具有顯著性。Note：** and * indicate significant difference at P<0.01 and P<0.05 levels, respectively.圖2 兩種類型林下參地上部分農(nóng)藝性狀比較Fig.2 Comparison of aerial portion traits between two types of forest cultivated Panax ginseng

2.2 兩種類型林下參人參皂苷含量差異

人參皂苷含量如圖3所示，二馬牙Rg1、Re、Ro、Rb1、Rc、Rb2、Rb3人參皂苷含量均高于長(zhǎng)脖，而Rf、Rd低于長(zhǎng)脖，總?cè)藚⒃碥蘸慷R牙高于長(zhǎng)脖，但兩種類型間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖3 兩種類型林下參人參皂苷含量Fig.3 Ginsenoside content between two types of forest cultivated Panax ginseng

2.3 兩種類型林下參基因表達(dá)水平

對(duì)18個(gè)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，共獲得123.70 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達(dá)到6.09 Gb，Q30堿基百分比在92.07%及以上，與指定的參考基因組比對(duì)，效率94.29%到95.37%不等?；诒葘?duì)結(jié)果，發(fā)掘新基因24 835個(gè)，其中22 087個(gè)得到功能注釋。差異基因表達(dá)量主成分分析(圖4)顯示，兩類型葉片聚合在一起，二馬牙的主根蘆頭聚合在一起，長(zhǎng)脖的主根蘆頭聚合在一起，而這兩種類型的主根蘆頭部分又有所重疊，說(shuō)明在根部與葉片基因表達(dá)不同，而兩個(gè)品種在基因表達(dá)中也存在差異。篩選兩類型差異表達(dá)基因(圖5)：葉片中有124個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因48個(gè)，下調(diào)基因76個(gè)；蘆頭中有604個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因283個(gè)，下調(diào)基因321個(gè)；主根中有89個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因31個(gè)，下調(diào)基因58個(gè)，兩種類型林下參差異表達(dá)基因主要存在于蘆頭中，這些信息對(duì)于分析兩品種根部形態(tài)差異提供必要線索。

高中物理中有如圖1所示的斜面模型，物體放在斜面上，斜面分為兩種情況，一是光滑斜面，二是粗糙斜面。物體在光滑斜面沿斜面加速下滑，斜面無(wú)摩擦力；而對(duì)于粗糙斜面，下滑的物體做受力分析，物體受重力mg、支持力FN、摩擦力f，由于支持力FN=mgcosθ，摩擦力f=μFN=μmgcosθ，而重力平行斜面向下的分力為mgsinθ，所以當(dāng)mgsinθ=μmgcosθ時(shí)，物體沿斜面勻速下滑，由此得sinθ=μcosθ，亦即μ=tanθ。其中μ為物體與斜面的摩擦系數(shù)，θ為斜面傾角。

注：CG—長(zhǎng)脖根部；CLD—長(zhǎng)脖葉片；CT—長(zhǎng)脖根莖；EG—二馬牙根部；ELD—二馬牙葉片；ET— 二馬牙根莖。Note: CG—Changbo root；CLD—Changbo leaf；CT—Changbo rhizome;EG—Ermaya root；ELD—Ermaya leaf；ET—Ermaya rhizome. 圖4 兩類型林下參葉片、蘆頭及主根主成分分析Fig.4 PCA of two types of forest cultivated Panax ginseng

圖5 兩種類型林下參的差異表達(dá)基因Fig.5 Genes significantly differentially expressed in two types of forest cultivated Panax ginseng

2.4 兩種類型林下參差異表達(dá)基因的GO分析及KEGG富集分析

2.4.1葉片差異表達(dá)基因GO分析及KEGG富集分析 對(duì)葉片篩選的124個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能的分類統(tǒng)計(jì)(圖6)，包括生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組成(cellular component)及細(xì)胞功能(molecular function)三類：按基因參與的生物過(guò)程可分為22類，其中，新陳代謝過(guò)程(metabolic process)、細(xì)胞過(guò)程(cellular process)基因總數(shù)最多，單生物過(guò)程(single-organism process)、生物調(diào)節(jié)(biological regulation)次之，發(fā)展過(guò)程(developmental process)、信號(hào)傳遞(signaling)、多生物過(guò)程(multi-organism process)的基因最少；按基因在細(xì)胞內(nèi)的組成可以分為15類，其中，細(xì)胞(cell)和細(xì)胞部分(cell part)這兩類基因數(shù)量所占比例最大，膜(membrane)及細(xì)胞器(organelle)次之，膜封閉腔(membrane-enclosed lumen)最少；按基因在細(xì)胞中的功能可分為15類，其中催化劑活性(catalytic activity)及結(jié)合(binding)最多，轉(zhuǎn)運(yùn)體活性(transporter activity)次之，結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity)、信號(hào)傳導(dǎo)活性(signal transducer activity)、分子傳導(dǎo)活性(molecular transducer activity)最少。說(shuō)明兩種類型林下參葉片在許多生理生化過(guò)程中表達(dá)量均不相同。

通過(guò)對(duì)兩種類型林下參葉片中差異表達(dá)的基因進(jìn)行KEGG富集(圖6)，將124個(gè)差異基因富集到了16個(gè)代謝通路中，包括植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(plant hormone signal transduction)以及一些糖類、脂類、蛋白和次生產(chǎn)物的代謝，其中有兩個(gè)代謝通路富集達(dá)到了顯著水平(P<0.05)，氨基糖和核苷酸糖(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、蛋白酶體(proteasome)、激素信號(hào)及糖類等代謝的差異表達(dá)為后續(xù)分析兩品種蘆頭膨大差異提供了重要信息。

圖6 兩種類型林下參葉片中差異表達(dá)基因的GO分類及KEGG富集的前16個(gè)通路Fig.6 GO categories and top 16 enriched KEGG pathways in leaf of two two types of forest cultivated Panax ginseng

2.4.2蘆頭差異表達(dá)基因GO分析及KEGG富集分析 對(duì)蘆頭篩選的604個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能的分類統(tǒng)計(jì)(圖7)發(fā)現(xiàn)，蘆頭參與生物過(guò)程的基因分為20類: 新陳代謝過(guò)程、單生物過(guò)程最多，細(xì)胞過(guò)程次之，多細(xì)胞生物過(guò)程(multicellular organismal process)、多生物過(guò)程、增長(zhǎng)(growth)最少；按基因在細(xì)胞內(nèi)的組成可以分為15類，膜最多，細(xì)胞(cell)、細(xì)胞部分、膜部分(membrane part)次之，超分子絡(luò)合物(supramolecular complex)、病毒(virion)、病毒部分(virion part)、胞外區(qū)(extracellular region part)最少；按基因在細(xì)胞中的功能可分為15類，催化劑活性最多，結(jié)合次之，信號(hào)傳導(dǎo)活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(nucleic acid binding transcription factor activity)、電子載體活性(electron carrier activity)、分子傳導(dǎo)活性、轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity), 蛋白結(jié)合(protein binding)、養(yǎng)分貯液囊活性(nutrient reservoir activity)最少。說(shuō)明兩種類型林下參蘆頭在許多生理生化過(guò)程中表達(dá)量均不相同。

圖7 兩種類型林下參蘆頭中差異表達(dá)基因的GO分類圖及KEGG富集的前20個(gè)通路Fig.7 GO categories and top 20 enriched KEGG pathways in rhizoma of two two types of forest cultivated Panax ginseng

在604個(gè)差異基因中，用160個(gè)差異基因共富集出70個(gè)代謝通路(圖7)，其中有26個(gè)代謝通路富集達(dá)到顯著水平(P<0.05)，17個(gè)代謝通路富集達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。首先富集到的是苯乙醇苷生物合成通路(phenylpropanoid biosynthesis)，有38個(gè)差異基因，占所有差異表達(dá)基因的23.75%，說(shuō)明兩種類型林下參蘆頭的苯乙醇苷含量有所不同；淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化(pentose and glucuronate interconversions)、糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)、半乳糖代謝(galactose metabolism)中差異基因均顯著，說(shuō)明兩種林下參的蘆頭在干物質(zhì)的積累和能量代謝中有所不同；在組氨酸代謝(histidine metabolism)、脂肪酸降解(fatty acid degradation)、賴氨酸降解(lysine degradation)等通路中差異基因均達(dá)到顯著水平，說(shuō)明兩種類型林下參的蘆頭在氨基酸的代謝方面有所不同；光合作用-天線蛋白質(zhì)(photosynthesis-antenna proteins)通路中基因差異顯著，說(shuō)明兩類型林下參光合速率也有所不同；類黃酮生物合成(flavonoid biosynthesis)、倍半萜類化合物和三萜類化合物的生物合成(sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis)、異喹啉生物堿生物合成(isoquinoline alkaloid biosynthesis)等在兩類型林下參中也可能存在差異，這些信息對(duì)于分析人參生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝產(chǎn)物以及逆境脅迫等提供線索，其中苯乙醇苷生物合成的差異表達(dá)為蘆頭膨大差異研究機(jī)制提供了重要信息。

2.4.3主根差異表達(dá)基因GO分析及KEGG富集分析 對(duì)主根篩選的89個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能的分類統(tǒng)計(jì)(圖8)，主根參與生物過(guò)程的基因中分為20類：新陳代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、單生物過(guò)程最多，定位類(localization)次之，刺激響應(yīng)(response to stimulus)、多細(xì)胞生物過(guò)程、增長(zhǎng)最少；按基因在細(xì)胞內(nèi)的組成可以分為15類，細(xì)胞、細(xì)胞部分、膜最多，細(xì)胞器、膜部分次之，膜封閉腔(membrane-enclosed lumen)最少；按基因在細(xì)胞中的功能可分為15類，催化劑活性最高，結(jié)合次之，核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性最少。說(shuō)明兩種類型林下參主根在許多生理生化過(guò)程中表達(dá)量均不相同。

圖8 兩種類型林下參主根中差異表達(dá)基因的GO分類及KEGG富集的前17個(gè)通路Fig.8 GO categories and top 17 enriched KEGG pathways in root of two two types of forest cultivated Panax ginseng

89個(gè)差異基因共富集到17個(gè)代謝通路，包括糖、脂肪、氨基酸以及一些次生代謝產(chǎn)物等通路(圖8)，說(shuō)明兩種類型林下參主根生命活動(dòng)也有許多差異，其中有1個(gè)代謝通路富集達(dá)到顯著水平(P<0.05)，為檸檬酸循環(huán)(citrate cycle/TCA cycle)，其是三大營(yíng)養(yǎng)素(糖類、脂類、氨基酸)的最終代謝通路，又是糖類、脂類、氨基酸代謝聯(lián)系的樞紐，還有許多中間產(chǎn)物參與其他生命活動(dòng)，說(shuō)明兩品種林下參主根存在差異。

2.5 兩種類型林下參關(guān)鍵通路基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

在KEGG通路中，篩選4條關(guān)鍵通路(圖9)。在同源重組代謝通路中，二馬牙3個(gè)部位Rad54基因均表現(xiàn)為下調(diào)，該基因在DNA損傷的修復(fù)及染色質(zhì)重塑交換反應(yīng)中有重要作用[32]；在淀粉和蔗糖代謝代謝通路中，二馬牙大部分基因(β-淀粉酶、果糖激酶、海藻糖6-磷酸合酶/磷酸酶、磷酸化酶、葡萄糖磷酸變位酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶、1,4-α-葡聚糖分支酶、海藻糖6-磷酸合酶/磷酸酶)表現(xiàn)為下調(diào)，蘆頭中2個(gè)基因(β-果糖呋喃糖苷酶、α-海藻糖酶)表現(xiàn)為上調(diào)，1個(gè)基因(β-葡糖苷酶)表現(xiàn)為既有上調(diào)又有下調(diào)，最終可能表現(xiàn)為葉片與主根中的淀粉等物質(zhì)積累，蘆頭中葡萄糖合成增加。

在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，二馬牙葉片乙烯(ethylene)信號(hào)通路中ETR以及EBF1/2上調(diào)，可能會(huì)促進(jìn)果實(shí)成熟及植株的衰老，蘆頭植物生長(zhǎng)素(auxin)信號(hào)通路中響應(yīng)因子AUX1和AUX/IAA下調(diào)，脫落酸(abscisic acid)代謝通路中蛋白磷酸酶2C(PP2C)下調(diào)，茉莉酸(jasmonic acid)代謝通路中MYC2下調(diào)，激素的差異響應(yīng)可能會(huì)造成兩類型林下參生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)不同。

2.6 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證分析

在蘆頭中篩選出7個(gè)差異表達(dá)基因：AUX/IAA(生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白，auxin-responsive protein)、AUX1(生長(zhǎng)素輸入載體，auxin influx carrier)、PP2C(蛋白磷酸酶，2C protein phosphatase 2C)、MYC2-1(MYC2轉(zhuǎn)錄因子，MYC2 transcription factor )、MYC2-2(雙螺旋DNA家族結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子，MYC2 basic helix-loop-helix DNA-binding family protein transcription factor )、CCR(肉桂烯醛基-CoA還原酶，cinnamoyl-CoA reductase)、LUP4(β-淀粉合酶，beta-amyrin synthase)，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)它們的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證。差異基因的表達(dá)結(jié)果均與RNA-seq結(jié)果一致(圖9)，兩品種間無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果可信度較高。qRT-PCR的結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了兩類型林下參根部形態(tài)學(xué)差異的分子機(jī)制，在植物激素代謝通路中，二馬牙蘆頭的AUX1、AUX/IAA、PP2C以及MYC2表現(xiàn)為下調(diào)，激素信號(hào)基因的表達(dá)差異為兩類型林下參表型差異提供了重要信息，木質(zhì)素的合成關(guān)鍵酶CCR基因表現(xiàn)為上調(diào)，可能導(dǎo)致木質(zhì)素合成增加。

圖9 關(guān)鍵 DEG 序列的定量 PCR 檢測(cè)Fig.9 Real-Time PCR verification for some important DEGs

3 討論

根系形態(tài)直接影響植物對(duì)水分及養(yǎng)分的吸收及運(yùn)輸[33-34]，從而影響產(chǎn)量及有效物質(zhì)的積累。比較兩種類型林下參一些農(nóng)藝性狀指標(biāo)及人參皂苷含量可以發(fā)現(xiàn)，同年生二馬牙的蘆頭較長(zhǎng)脖短，但粗壯，根部及地上部分也更粗壯，須根更發(fā)達(dá)，與前人研究結(jié)果一致[14]，而兩類型人參皂苷含量無(wú)顯著差異，這與前人研究?jī)深愋腿藚⒃碥蘸坑胁町惤Y(jié)果不同，可能與測(cè)量人參皂苷樣品量較少、林下環(huán)境復(fù)雜等因素有關(guān)。

兩種類型林下參在糖類積累與代謝、激素作用以及木質(zhì)素的合成中存在差異基因的表達(dá)，這可能是兩類型林下參參形存在差異的主要原因。β-淀粉酶基因參與淀粉降解，與土豆塊根發(fā)育有關(guān)[35]，并且為人參皂苷中合成齊墩果烷型人參皂苷的關(guān)鍵酶[36]，二馬牙與長(zhǎng)脖相比，與糖類合成與代謝相關(guān)的酶在植株的表達(dá)中體現(xiàn)在葉片與主根中儲(chǔ)存淀粉，蘆頭合成葡萄糖，可能作用途徑為：主根與葉片中的淀粉運(yùn)輸?shù)教J頭中轉(zhuǎn)換為葡萄糖為蘆頭膨大提供能量，因此，二馬牙蘆頭更加粗壯。

激素在許多植物根部生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用，如馬鈴薯[37]、地黃[38]塊根的形成。生長(zhǎng)素在主根伸長(zhǎng)及側(cè)根發(fā)育中有重要調(diào)節(jié)作用[39-40]，二馬牙的蘆頭在植物生長(zhǎng)素信號(hào)通路中響應(yīng)因子AUX1和AUX/IAA下調(diào)，而AUX/LAXs蛋白家族是目前已知的最主要的生長(zhǎng)素輸入載體[41]。Yang 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，AUX1主要在根尖表皮細(xì)胞、中柱細(xì)胞、側(cè)根根冠及原生韌皮部細(xì)胞中表達(dá)，參與生長(zhǎng)素由根中向頂式和向基式的運(yùn)輸。何靜等[43]研究發(fā)現(xiàn)，AUX1定位豐度的減少可以導(dǎo)致生長(zhǎng)素在根尖頂部的積累，根部生長(zhǎng)素濃度梯度的改變，會(huì)引起根生長(zhǎng)的抑制及側(cè)根的提前發(fā)生。二馬牙的植物生長(zhǎng)素表達(dá)少于長(zhǎng)脖，可能造成蘆頭伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到抑制，而側(cè)根生長(zhǎng)提前，導(dǎo)致蘆頭短、須根多。

二馬牙在木質(zhì)素的生物合成通路中諸多基因表現(xiàn)為上調(diào)。人參根為肉質(zhì)直根，肉質(zhì)根膨大是由于薄壁細(xì)胞分裂、形成層細(xì)胞增生及次生組織發(fā)育共同作用的結(jié)果。隨著次生細(xì)胞壁的薄壁細(xì)胞不斷分裂，需要韌皮部和木質(zhì)部不斷擴(kuò)大，導(dǎo)致木質(zhì)部的木質(zhì)化程度逐漸增加[44-46]，蘆頭的膨大可能與其木質(zhì)化程度有關(guān)，二馬牙的木質(zhì)化程度強(qiáng)是其蘆頭膨大較大的結(jié)果也是其繼續(xù)膨大的條件。

轉(zhuǎn)錄組結(jié)果還顯示，兩品種在抗逆方面可能存在差異，乙烯響應(yīng)因子EFR1/2受多種防御因素誘導(dǎo)，可能與植物的木質(zhì)化程度有關(guān)[47]，脫落酸代謝通路在植物抗逆響應(yīng)中有很大的作用[48]；茉莉酸代謝通路中MYC2在調(diào)控植物體積累萜類物質(zhì)等次生代謝產(chǎn)物和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)中具有重要的作用[49]，二馬牙林下參在這些基因的表達(dá)量與長(zhǎng)脖均不相同，兩品種的抗逆性差異還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

根據(jù)兩種類型林下參的葉片、蘆頭及主根轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果可以初步推測(cè)出兩類型林下參蘆頭形態(tài)差異的分子機(jī)制：糖類的合成與代謝不同，為二馬牙蘆頭與根部的生長(zhǎng)提供能量，木質(zhì)素的合成使得蘆頭木質(zhì)化與膨大，生長(zhǎng)素的作用使得蘆頭短粗，須根發(fā)達(dá)。通過(guò)對(duì)人參中形態(tài)差異較大的兩種類型林下參差異表達(dá)基因的分析發(fā)現(xiàn)，其差異基因表達(dá)主要注釋到淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及苯乙醇苷生物合成通路中。為人參形態(tài)建成研究、分子育種、種質(zhì)資源篩選以及優(yōu)良品種選育提供參考。