基于高效液相色譜和紅外光譜的生三七及其炮制品的鑒別

李雨昕 邢娜 張志宏 于天穎 馬恩耀 王雪 白浩東 曾元寧 王秋紅

中圖分類(lèi)號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）18-2194-09

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.18.04

摘 要 目的：鑒別生三七及其炮制品。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）建立指紋圖譜。以人參皂苷Rb1為參照，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》繪制15批生三七及其炮制品的HPLC指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，通過(guò)與對(duì)照品對(duì)比確定共有峰。采用SPSS 21.0、SIMCA 14.1軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析、主成分分析、正交偏最小二乘法分析，以變量重要性投影（VIP）值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選造成生三七及其炮制品質(zhì)量差異的標(biāo)志性成分。采用OMNIC 8.2.0軟件建立生三七及其炮制品的紅外（IR）指紋圖譜并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，采用雙指標(biāo)序列分析法對(duì)15批生三七及其炮制品的IR指紋圖譜吸收峰進(jìn)行分析。結(jié)果：15批生三七有16個(gè)共有峰，相似度為0.911～1.000;炮制品有25個(gè)共有峰，相似度為0.862～1.000;二者共有12個(gè)相同的共有峰，并指認(rèn)其中3個(gè)共有峰，分別為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1。聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，當(dāng)距離為10時(shí)，15批生三七可聚為兩類(lèi)，SW1～SW5聚為一類(lèi)，SH1～SH5、SQ1～SQ5聚為一類(lèi);15批炮制品ZW1～ZW5、ZH1～ZH5、ZQ1～ZQ5聚為一類(lèi)。當(dāng)距離為5時(shí)，15批生三七可聚為3類(lèi)，SW1～SW5聚為一類(lèi)，SH2～SH5、SQ2聚為一類(lèi)，SQ1、SQ3～SQ5、SH1聚為一類(lèi);15批炮制品可聚為兩類(lèi)，ZW1～ZW5聚為一類(lèi)，ZH1～ZH5、ZQ1～ZQ5聚為一類(lèi)。主成分分析結(jié)果顯示，前兩個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為80.104%。正交偏最小二乘法分析結(jié)果顯示，5個(gè)峰的VIP值大于1，分別為峰H、峰G、峰J、峰F（人參皂苷Rg1）、峰I。15批生三七及其炮制品IR指紋圖譜的相似度分別為0.889 7～1.000 0、0.972 8～1.000 0;共有峰率均為80%～100%，變異峰率分別為0～17.65%、0～18.75%。經(jīng)吸收峰波數(shù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，生三七在3 440、1 450 cm-1處，炮制品在1 530、575 cm-1處存在差異。結(jié)論：所建HPLC指紋圖譜和IR指紋圖譜的相似度均較好，能有效區(qū)分生三七及其炮制品。不同產(chǎn)地生三七及其炮制品的共有峰率高、變異率低，二者化學(xué)成分不同;峰H、峰G、峰J、人參皂苷Rg1、峰I為引起生三七及其炮制品質(zhì)量差異的標(biāo)志性成分。

關(guān)鍵詞 三七;炮制品;高效液相色譜法;紅外光譜;不同產(chǎn)地

Identification of Panax notoginseng and Its Processed Products Based on HPLC and IR Spectrum

LI Yuxin1，XING Na1，ZHANG Zhihong2，YU Tianying3，MA Enyao3，WANG Xue1，BAI Haodong1，ZENG Yuanning2，WANG Qiuhong1，2（1. School of Pharmacy， Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine/Key Laboratory of Foundation and Application Research of Northern Traditional Chinese Medicine， Ministry of Education/Heilongjiang Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine and Natural Medicine Pharmacodynamic Material Bases， Harbin 150040， China; 2. School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 3. Guangzhou Caizhilin Pharmaceutical Co. Ltd.， Guangzhou 510145， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To identify Panax notoginseng and its processed products. METHODS： The fingerprint was established by HPLC. Using ginsenoside Rb1 as reference， HPLC fingerprints of 15 batches of P. notoginseng and its processed products were drawn and the similarity evaluation was conducted by using the Similarity Evaluation System for TCM Chromatographic Fingerprints （2012 edition）. The common peaks were confirmed by comparing with substance control. SPSS 21.0 and SIMCA 14.1 software were used to perform cluster analysis， principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis; taking the variable importance projection （VIP） value greater than 1 as the standard， the differential marker components causing the quality difference between P. notoginseng and its processed products were screened. IR fingerprints? of P. notoginseng and its processed products were established by OMNIC 8.2.0 software， and the spectral similarity was evaluated; double index? sequence analysis was used to analyze absorption peaks of IR fingerprints of 15 batches of P. notoginseng and its processed products. RESULTS： There were 16 common peaks in the fingerprints of 15 batches of P. notoginseng， and the similarities were 0.911-1.000; there were 25 common peaks in the fingerprints of processed products， and the similarities were 0.862-1.000. They had 12 identical common peaks， and three of them were identified as sanchinoside R1， ginsenoside Rg1 and ginsenoside Rb1. Results of cluster analysis showed that when the distance was 10， 15 batches of P. notoginseng could be clustered into two categories， SW1-SW5 into one category， SH1-SH5 and SQ1-SQ5 into one category， ZW1-ZW5， ZH1-ZH5 and ZQ1-ZQ5 of 15 batches of processed products could be clustered into one category. When the distance was 5， 15 batches of P. notoginseng could be clustered into three categories， SW1-SW5 into one category， SH2-SH5 and SQ2 into one category， SQ1， SQ3-SQ5 and SH1 into one category. Fifteen batches of processed products could be clustered into two categories， ZW1-ZW5 into one category， ZH1-ZH5 and ZQ1-ZQ5 into one category. The results of principal component analysis showed that the cumulative variance contribution rate of the first two principal components was 80.104%. The results of orthogonal partial least squares-discriminant analysis showed that the VIP values of the five peaks were greater than 1， which were peak H， peak G， peak J， peak F （ginsenoside Rg1） and peak I. The similarity of IR fingerprints of 15 batches of P. notoginseng and its processed products were 0.889 7-1.000 0 and 0.972 8-1.000 0; the common peak rates were 80%-100%， and the variation peak rates were 0-17.65% and 0-18.75%， respectively. By comparing the wave numbers of absorption peaks， it was found that there were differences between P. notoginseng at 3 440 and 1 450 cm-1 and processed products at 1 530 and 575 cm-1. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprint and IR fingerprint have good similarity， and could effectively distinguish P. notoginseng and its processed products. P. notoginseng and its processed products from different habitats have high common peak rate and low variation rate， and their chemical components are different; peak H， peak G， peak J， ginsenoside Rg1 and peak I are differential marker components causing the quality difference between P. notoginseng and processed products.

KEYWORDS? ?Panax notoginseng; Processed products; HPLC; IR spectrum; Different habitats

三七為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F. H. Chen的干燥根和根莖，主產(chǎn)于我國(guó)云南、廣西等地，具有散瘀止血、消腫定痛的功效，常用于治療咯血、吐血、衄血、便血、崩漏、外傷出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛等癥[1]。三七作為傳統(tǒng)名貴中藥，在中成藥處方中使用頻繁，亦是一種大眾青睞的保健食品[2]。三七有生品和熟品之分，生三七收錄于2020年版《中國(guó)藥典》（一部）[1];三七炮制方法有焙、炒、蒸、油炸、砂燙、發(fā)酵及微波等 [3-4]，其中蒸法和油炸法可見(jiàn)于個(gè)別地區(qū)炮制規(guī)范中，如蒸三七已被四川、安徽、廣西等地的炮制規(guī)范收錄[5]。

有研究表明，生三七功效偏于散瘀止血、消腫定痛;熟三七功效偏于補(bǔ)益，且其益氣補(bǔ)血活血作用優(yōu)于生三七[6-8]。除功效差異外，兩者的化學(xué)成分也有不同：生三七經(jīng)炮制后，所含的皂苷類(lèi)成分發(fā)生脫水或去糖，可產(chǎn)生新的皂苷類(lèi)成分;氨基酸類(lèi)、黃酮類(lèi)成分受熱含量減少，多糖類(lèi)成分含量則與炮制參數(shù)相關(guān)[3]。目前，有關(guān)生、熟三七的研究多為藥理作用差異分析，多從三七“生打熟補(bǔ)”特點(diǎn)入手，驗(yàn)證熟三七的補(bǔ)血補(bǔ)益作用[6，8-9]，或以皂苷類(lèi)成分為指標(biāo)優(yōu)選最優(yōu)炮制工藝[10-11]，而對(duì)熟三七的質(zhì)量評(píng)價(jià)較少?，F(xiàn)行2020年版《中國(guó)藥典》（一部）僅對(duì)生三七藥材的性狀、顯微鑒別、薄層鑒別以及水分、總灰分、酸不溶性灰分、醇溶性浸出物、指標(biāo)成分（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1）含量測(cè)定等進(jìn)行規(guī)范，但未對(duì)其炮制品作出規(guī)定[1]。雖然，有部分省份的炮制規(guī)范對(duì)熟三七的炮制方法進(jìn)行了描述，但未見(jiàn)具體的參數(shù)要求[12]，加之熟三七使用的日益增多，因此有必要對(duì)熟三七的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

高效液相色譜（HPLC）作為物質(zhì)特有性分析的一種方法，能夠?qū)λ幉某煞诌M(jìn)行定性、定量分析，借助化學(xué)信息反映中藥質(zhì)量[13]。與采用成分含量多少來(lái)評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的方法相比，中藥指紋圖譜技術(shù)結(jié)合聚類(lèi)分析、主成分分析、正交偏最小二乘法分析等化學(xué)模式識(shí)別能更加客觀地反映藥材質(zhì)量[14]。紅外（IR）光譜又稱分子指紋光譜，能夠提供較為豐富的分子結(jié)構(gòu)特征性信息[15]。近年來(lái)，IR光譜在中藥材鑒別領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，可用于鑒別藥材真?zhèn)?、產(chǎn)地及不同藥用部位，有助于保障中藥使用的安全性[16]。雙指標(biāo)分析法提高了樣品信息的獨(dú)立性、特征性;變異率與共有峰率作為兩個(gè)相互獨(dú)立的鑒別指標(biāo)表示樣品兩兩比較的相似性和差異性，可構(gòu)成二維指標(biāo)空間，較單指標(biāo)的鑒別方法，具有更強(qiáng)的鑒別能力，可利用藥材本身所含有的信息進(jìn)行鑒別，并可通過(guò)建立多維且獨(dú)立的鑒別指標(biāo)空間而將藥材共性與差異進(jìn)行量化[17]。基于此，本研究建立了不同產(chǎn)地生、熟三七的HPLC指紋圖譜及IR指紋圖譜，同時(shí)結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別進(jìn)行分析，旨在為生、熟三七的辨別和產(chǎn)地的區(qū)分提供參考，亦為探討三七作用機(jī)理及炮制機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用儀器主要有Waters e2695型HPLC儀[沃特世科技（上海）有限公司]，UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、FTIR-8400S型IR光譜儀（日本Shimadzu公司），SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司），GZX-9140MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），GZX-9140MBE型電子天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]，Milli-Q Advantage A10型超純水臺(tái)式純水系統(tǒng)（德國(guó)Millipore公司）等。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)RFS-R01211810029，純度98.58%）、人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)RFS-R01511812013，純度99.16%）、三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)RFS-S0021181-

1027，純度98.52%）均購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司;溴化鉀（KBr，光譜純，批號(hào)C11570025）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;甲醇（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）為質(zhì)譜純，乙腈[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]為色譜純，水為超純水。

15批生三七藥材為廣州采芝林藥業(yè)有限公司提供的凈制藥材，分別產(chǎn)自云南曲靖、文山、紅河等3個(gè)地區(qū)（每產(chǎn)地各5批），經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥資源系劉基柱教授鑒定均為五加科植物三七P. notoginseng（Burk.）F. H. Chen的干燥根和根莖。取三七藥材，按其質(zhì)量的40%加水浸潤(rùn)24 h至無(wú)白心;蒸鍋加熱至有蒸汽冒出，放入已潤(rùn)制的生三七藥材，蒸制3 h后取出，趁熱將其切成厚約2～3 mm的薄片，于50 ℃烘干，即得15批炮制品（依次編號(hào)ZQ1～ZQ5、ZW1～ZW5、ZH1～ZH5），具體來(lái)源信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 以Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，10%A;5～25 min，10%A→46%A;25～30 min，46%A→100%A;30～50 min，100%A）;流速為1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm;柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1對(duì)照品各5 mg，分別置于5 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，混勻，制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的單一對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取生三七或其炮制品粉末（過(guò)四號(hào)篩）3.75 g，置于25 mL量瓶中，加入70%甲醇25 mL，渦旋后超聲（功率600 W，頻率40 kHz）提取30 min，于25 ℃下以13 000 r/min離心10 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得，備用。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)ZH1），按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以人參皂苷Rb1為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，12個(gè)相同共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.04%～0.81%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.78%～2.59%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一炮制品樣品（編號(hào)ZH1），共6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以人參皂苷Rb1為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，12個(gè)相同共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.02%～0.42%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為1.48%～2.48%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)ZH1），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、16、18、24 h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以人參皂苷Rb1為參照，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，12個(gè)相同共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.03%～0.48%（n=8），相對(duì)峰面積的RSD為0.92%～2.56%（n=8），表明上述溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 HPLC指紋圖譜的建立 取15批生三七及其炮制品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將所得色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，隨機(jī)選擇以SW3為生三七的參照、ZW3為炮制品的參照，采用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1，經(jīng)多點(diǎn)校正，得到15批生三七及其炮制品的疊加指紋圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜。結(jié)果顯示，15批生三七有16個(gè)共有峰，15批炮制品有25個(gè)共有峰;經(jīng)對(duì)比，生三七與炮制品中共有12個(gè)共有峰相同，即生三七圖譜中的1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、13、16號(hào)峰（共有峰依次編號(hào)為峰A～峰L）分別與炮制品圖譜中的1、2、4、5、7、10、11、12、22、23、24、25號(hào)峰（共有峰依次編號(hào)為峰A～峰L）對(duì)應(yīng)，詳見(jiàn)圖1、圖2。

2.1.8 HPLC指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》對(duì)15批生三七及其炮制品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，15批生三七及其炮制品與對(duì)應(yīng)對(duì)照指紋圖譜的相似度分別為0.911～1.000，0.862～1.000，表明不同產(chǎn)地生三七及其炮制品中含有的化學(xué)成分種類(lèi)相似，藥材質(zhì)量穩(wěn)定，詳見(jiàn)表2。

2.1.9 共有峰的指認(rèn) 因人參皂苷Rb1峰形較好、含量較高，且為2020年版《中國(guó)藥典》（一部）三七藥材含量測(cè)定的指標(biāo)成分，故以人參皂苷Rb1為參照峰。通過(guò)與對(duì)照品HPLC圖（取“2.1.2”項(xiàng)下各單一對(duì)照品溶液適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到圖3）對(duì)比，指認(rèn)生三七指紋圖譜中的3、4、6號(hào)峰和炮制品指紋圖譜中的4、5、10號(hào)峰分別均為三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1。

2.2 聚類(lèi)分析

以生三七及其炮制品中12個(gè)相同共有峰的峰面積為變量，采用瓦爾德法以平方歐氏距離為區(qū)間[18]，使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)距離為10時(shí)，15批生三七可聚為兩類(lèi)，SW1～SW5聚為一類(lèi)，SH1～SH5、SQ1～SQ5聚為一類(lèi);15批炮制品ZW1～ZW5、ZH1～ZH5、ZQ1～ZQ5聚為一類(lèi)。當(dāng)距離為5時(shí)，15批生三七可聚為3類(lèi)，SW1～SW5聚為一類(lèi)，SH2～SH5、SQ2聚為一類(lèi)，SQ1、SQ3～SQ5、SH1聚為一類(lèi);15批炮制品可聚為兩類(lèi)，ZW1～ZW5聚為一類(lèi)，ZH1～ZH5、ZQ1～ZQ5聚為一類(lèi)。

2.3 主成分分析

采用SIMCA 14.1軟件，以生三七及其炮制品中12個(gè)相同共有峰的峰面積為變量進(jìn)行主成分分析[19]，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，生三七SW1～SW5位于圖的左側(cè)，SH2～SH5、SQ2位于圖的右下方，SQ1、SQ3～SQ5、SH1位于圖的左下側(cè);炮制品ZW1～ZW5位于圖的正上方，ZH1～ZH5、ZQ1～Q5位于圖的右側(cè)，與聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致。

以主成分特征值和貢獻(xiàn)率為依據(jù)，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行主成分因子分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，前兩個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為80.104%，表明前兩個(gè)主成分能夠客觀地反映樣品的質(zhì)量。

根據(jù)表3中特征值，采用SPSS 21.0軟件繪制主成分分析碎石圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，前兩個(gè)成分較陡，后面十個(gè)成分較平緩，表示前兩個(gè)成分足以代表原來(lái)變量。在特征向量中，變量前對(duì)應(yīng)系數(shù)即為該變量主成分載荷。主成分載荷的絕對(duì)值越大，表示主成分的變量代表性越大[20]。通過(guò)SPSS 21.0軟件得到兩個(gè)主成分F1、F2對(duì)應(yīng)的特征向量分別為F1=0.116 4×峰A+0.292 9×? 峰B+0.293 3×峰C+0.341 4×峰D+0.298 8×峰E+0.336 2×峰F+0.336 2×峰G+0.301 1×峰H+0.342 5×峰I+0.277 6×峰J+0.248 1×峰K+0.189 2×峰L;F2=-0.057 8×峰A+0.257 3×峰B+0.266 3×峰C+0.201 5×峰D-0.155 9×峰E-0.238 7×峰F-0.231 0×峰G-0.329 2×峰H-0.089 2×峰I-0.321 5×峰J+0.441 5×峰K+0.519 2×峰L。主成分1、2對(duì)多個(gè)載荷較大的變量（峰B～峰L）具有代表性[20]，表明生三七及其炮制品質(zhì)量差異為多種成分共同作用的結(jié)果，并初步推斷峰B～峰L所對(duì)應(yīng)的11種成分（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及8種未知成分）為影響生三七及其炮制品質(zhì)量的成分。

2.4 正交偏最小二乘法分析

以生三七及其炮制品中12個(gè)相同共有峰的峰面積為變量，采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法分析，結(jié)果見(jiàn)圖7、圖8（圖8中代表變量的點(diǎn)距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表示變量對(duì)模型的影響權(quán)重越大[21]）。由圖7、圖8可知，模型累積解釋能力參數(shù)R 2X（cum）為0.845，R 2Y（cum）為0.972，模型預(yù)測(cè)度Q 2（cum）為0.943，均大于0.8，表示擬合的預(yù)測(cè)模型穩(wěn)定、可靠[22]。生三七位于圖的左側(cè)，炮制品位于右側(cè)，二者能夠明顯分開(kāi)。

當(dāng)變量重要性投影（VIP）值大于1，表示變量對(duì)于整體的貢獻(xiàn)較大[23]。采用SIMCA 14.1軟件中“VIP predictive”插件得到VIP值，選取VIP值大于1的化合物，共得到貢獻(xiàn)相對(duì)較大的5個(gè)峰，分別為峰H、峰G、峰J、峰F（人參皂苷Rg1）、峰I，詳見(jiàn)圖9。

2.5 IR指紋圖譜的建立

2.5.1 供試品的制備及測(cè)定 將15批生三七及其炮制品于60 ℃下烘干，粉碎，過(guò)九號(hào)篩，取粉末2 mg，置于瑪瑙研缽中，加入KBr粉末200 mg，充分研磨后壓制成薄片，即為供試樣品片。同法制備KBr空白片，置于IR光譜儀中進(jìn)行背景掃描，再放置生三七及其炮制品供試樣品片進(jìn)行掃描。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取炮制品樣品粉末（編號(hào)ZH1），按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備供試樣品片并連續(xù)測(cè)定5次，將所測(cè)得的圖譜導(dǎo)入OMNIC 8.2.0軟件進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，IR圖譜的相似度為0.995 6～0.998 6（n=5），表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取炮制品樣品粉末（編號(hào)ZH1），按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備供試樣品片，分別于室溫下放置0、10、20、30、40、50 min時(shí)按“2.5.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，將所測(cè)得的圖譜導(dǎo)入OMNIC 8.2.0軟件進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，IR圖譜的相似度為0.988 4～0.998 7（n=6），表明樣品在室溫下放置50 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取炮制品樣品粉末（編號(hào)ZH1），共6份，按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備供試樣品片并測(cè)定，將所測(cè)得的圖譜導(dǎo)入OMNIC 8.2.0軟件進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，IR圖譜的相似度為0.992 8～0.999 5（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 IR指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià) 采用OMNIC 8.2.0軟件對(duì)15批生三七及其炮制品的IR圖譜進(jìn)行基線矯正、平滑，建立指紋圖譜，生三七以SW3為參照，得相似度分別為0.978 8、0.991 9、0.987 0、0.970 6、0.973 6、0.937 8、0.997 2、1.000 0、0.990 6、0.995 4、0.907 0、0.889 7、0.954 0、0.936 8、0.966 8;炮制品以ZW3參照，得相似度分別為0.972 8、0.988 5、0.994 5、0.992 9、0.974 7、0.994 3、0.998 1、1.000 0、0.993 7、0.991 2、0.990 0、0.984 0、0.986 6、0.988 8、0.983 9。IR指紋圖譜見(jiàn)圖10。

2.5.6 雙指標(biāo)序列分析 本研究分別對(duì)15批生三七及其炮制品的IR指紋圖譜進(jìn)行雙指標(biāo)序列分析。共有峰率（P）=（Ng/Nd）×100%;指紋圖譜a的變異峰率（Pva）=（Na/Ng）×100%;指紋圖譜b的變異峰率（Pvb）=（Nb/Ng）×100%[24];Nd=Ng+Na+Nb。式中，Nd表示兩個(gè)IR指紋圖譜中的獨(dú)立峰總數(shù)，獨(dú)立峰指IR指紋圖譜中不同的吸收峰;Ng表示兩個(gè)IR指紋圖譜中都出現(xiàn)的吸收峰的個(gè)數(shù)，Na表示指紋圖譜a中相對(duì)于其共有峰的非共有峰數(shù)（稱為a的變異峰數(shù)），Nb表示指紋圖譜b中相對(duì)于其共有峰的非共有峰數(shù)（稱為b的變異峰數(shù)）;Pv指在該IR指紋圖譜中變異峰數(shù)與其共有峰數(shù)的比值[25]。具體結(jié)果見(jiàn)表4。

以SQ2 ∶ SH2（90.00，5.56，5.56）為例，其序列數(shù)據(jù)表示以SQ2為參照，SQ2與SH2之間的共有峰率為90%，SQ2與SH2的變異峰率均為5.56%，表明SQ2與SH2之間共有峰率大、變異率小。由表4可知，15批生三七及其炮制品經(jīng)兩兩比對(duì)均有105組結(jié)果，生三七共有峰率為80%～100%，相似度較高;其中69組共有峰率大于90%，27組共有峰率為85%～90%，9組共有峰率小于85%。炮制品共有峰率為80%～100%，相似度較高;其中71組共有峰率大于90%，34組共有峰率為85%～90%。這表明生三七及其炮制品的IR指紋圖譜相似度較高、變異率低。

2.5.7 IR指紋圖譜數(shù)據(jù)分析 由生三七及其炮制品的IR指紋圖譜可以看出，不同產(chǎn)地生三七及其炮制品各自的相似度較高。生三七在3 440、3 300、2 930、2 310、? ? ?2 150、1 660、1 450、1 425、1 370、1 245、1 155、1 020、855、760、700、530 cm-1處有16個(gè)共有峰;炮制品在? 3 350、2 928、2 360、2 150、1 650、1 530、1 425、1 375、1 245、1 155、1 025、855、760、700、575、525 cm-1處有16個(gè)共有峰（具體波數(shù)數(shù)據(jù)表略）。生三七與炮制品的共有峰波數(shù)相似，僅個(gè)別峰不同，生三七體現(xiàn)在3 440、? ? ?1 450 cm-1處，炮制品體現(xiàn)在1 530、575 cm-1處。此外，生三七在3 000～3 700 cm-1處有多個(gè)中等強(qiáng)度的尖峰，而炮制品在此區(qū)間為一大寬峰，且炮制品的圖譜更具統(tǒng)一性，較為規(guī)整。筆者推測(cè)，生三七經(jīng)蒸制后，所含化學(xué)成分發(fā)生轉(zhuǎn)化，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的成分發(fā)生降解，官能團(tuán)種類(lèi)減少[26]。

3 討論

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[27]和2020年版《中國(guó)藥典》（一部）[1]，建立了生三七及其炮制品的HPLC指紋圖譜。通過(guò)HPLC指紋圖譜及相似度評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，15批生三七相似度為0.911～1.000，共16個(gè)共有峰;15批炮制品相似度為0.862～1.000，共25個(gè)共有峰。經(jīng)對(duì)比，生三七與炮制品中共有12個(gè)共有峰相同;經(jīng)與對(duì)照品對(duì)比，共指認(rèn)了其中3個(gè)共有峰，分別為三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1。此外，炮制品色譜圖中的色譜峰較生三七明顯增多，表明生三七經(jīng)炮制后產(chǎn)生了新的成分。但本研究并未對(duì)炮制后的新增成分進(jìn)行確定，后續(xù)有待采用液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)進(jìn)一步辨別。

聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，當(dāng)距離為10時(shí)，15批生三七可聚為兩類(lèi)，SW1～SW5聚為一類(lèi)，SH1～SH5、SQ1～SQ5聚為一類(lèi);15批炮制品ZW1～ZW5、ZH1～ZH5、ZQ1～ZQ5聚為一類(lèi)。當(dāng)距離為5時(shí)，15批生三七可聚為三類(lèi)，SW1～SW5聚為一類(lèi)，SH2～SH5、SQ2聚為一類(lèi)，SQ1、SQ3～SQ5、SH1聚為一類(lèi);15批炮制品可聚為兩類(lèi)，ZW1～ZW5聚為一類(lèi)，ZH1～ZH5、ZQ1～ZQ5聚為一類(lèi)。這提示云南紅河及曲靖產(chǎn)生三七有交叉現(xiàn)象，對(duì)于此現(xiàn)象，筆者通過(guò)查閱云南省地圖發(fā)現(xiàn)，曲靖、文山、紅河三地呈“品”字型分布，兩兩接壤，由此推測(cè)可能由于紅河與曲靖的地理環(huán)境相近，使得三七質(zhì)量較為相似，亦或是藥材采購(gòu)過(guò)程中，個(gè)別批次收集出現(xiàn)差錯(cuò)。

主成分分析結(jié)果顯示，前兩個(gè)主成分能代表共有峰80.104%的信息，主成分分析圖與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。正交偏最小二乘法分析結(jié)果顯示，峰H、峰G、峰J、峰F（人參皂苷Rg1）、峰I的VIP值均大于1。雖然，本研究未指認(rèn)出除對(duì)照品外的其余未知成分，但指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別可區(qū)分不同產(chǎn)地生三七及其炮制品，并初步推斷三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和其他8種未知成分為影響生三七及其炮制品質(zhì)量的成分[18]，后續(xù)可結(jié)合含量測(cè)定及未知成分指認(rèn)等實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行鑒定;篩選出峰H、峰G、峰J、人參皂苷Rg1、峰I為引起其質(zhì)量差異的標(biāo)志性成分，表明生三七及其炮制品所含成分的含量特征差異較大[28]。

IR光譜在定性鑒別研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能夠提供豐富的分子結(jié)構(gòu)信息，具有良好的專屬性、重現(xiàn)性，可綜合反映不同產(chǎn)地三七化學(xué)成分的復(fù)雜性和多樣性[29]。IR圖譜將三七不同成分中同類(lèi)官能團(tuán)以疊加峰的形式展示，能夠從不同角度對(duì)三七質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)[14]。本建立了15批生三七及其炮制品的IR指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)和雙指標(biāo)序列分析。結(jié)果顯示，經(jīng)峰位對(duì)比發(fā)現(xiàn)，生三七在3 440、1 450 cm-1處，炮制品在1 530、575 cm-1處存在差異，生三七及其炮制品吸收峰不同，表明經(jīng)炮制后三七的化學(xué)成分發(fā)生變化，可以此對(duì)二者進(jìn)行鑒別。雙指標(biāo)序列法可通過(guò)量化關(guān)系比對(duì)出親緣關(guān)系相近的樣本[30]。本研究結(jié)果顯示，15批生三七的共有峰率為80%～100%，相似度較高;炮制品的共有峰率為80%～100%，相似度較高。這表明云南3個(gè)不同產(chǎn)地的三七化學(xué)種類(lèi)相似，與聚類(lèi)分析結(jié)果一致，但雙指標(biāo)序列法雖然較精確，但計(jì)算較為繁雜，不適用于大樣本量比對(duì)[31]。

本研究采用HPLC指紋圖譜及IR指紋圖譜對(duì)生三七及其炮制品進(jìn)行了鑒別，所得結(jié)果均能夠有效區(qū)分不同產(chǎn)地生三七及其炮制品。本研究的不足之處為僅收集了云南3個(gè)產(chǎn)地共15批生三七及其炮制品，樣本量較小且為同一省份產(chǎn)藥材;雖然通過(guò)HPLC指紋圖譜及化學(xué)模式識(shí)別能明顯鑒別生三七及其炮制品，但I(xiàn)R光譜在產(chǎn)地鑒別上有所欠缺，今后有待收集更多省份地區(qū)的三七藥材樣品進(jìn)行鑒別，以確認(rèn)IR光譜在產(chǎn)地鑒別上的價(jià)值。

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（收稿日期：2021-04-16 修回日期：2021-07-29）

（編輯：陳 宏）