子癇前期動(dòng)物模型的特點(diǎn)及其局限性

尹祾軒，司延如，曹占鑫，柳新祿，楊濰濰

(濰坊醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濰坊 261053)

子癇前期(preeclampsia，PE)是孕產(chǎn)婦和圍生兒發(fā)病和死亡的主要原因，影響著全世界5%～8%的孕產(chǎn)婦[1]。PE不僅影響后代健康狀況，還會(huì)導(dǎo)致孕婦生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)增加，包括高血壓、蛋白尿、糖尿病和新陳代謝紊亂[2]。關(guān)于PE的病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明[3]。目前認(rèn)為，PE的發(fā)病與內(nèi)皮功能障礙，免疫適應(yīng)性不平衡，過度炎癥，氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，血管生成不足和系統(tǒng)性血管收縮異常密切相關(guān)[4-5]。但現(xiàn)階段的醫(yī)學(xué)治療并不能滿足PE患者的需求，因此PE動(dòng)物模型對(duì)于確定病因、開發(fā)新的治療方法以及評(píng)估干預(yù)措施的安全性和有效性至關(guān)重要。

一個(gè)理想的PE動(dòng)物模型應(yīng)該表現(xiàn)出PE患者的癥狀，包括高血壓、蛋白尿、宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、內(nèi)皮功能障礙和血管生成/抗血管生成因子失衡，這些癥狀是由妊娠早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)不足導(dǎo)致，并在胎盤分娩后消失。目前，絕大多數(shù)PE動(dòng)物模型是在大鼠和小鼠上進(jìn)行，這些嚙齒類動(dòng)物與人類的胎盤類型相同，它們的胎盤表現(xiàn)出間質(zhì)和血管內(nèi)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲以及母體動(dòng)脈的重塑。現(xiàn)就PE動(dòng)物模型的特點(diǎn)及其局限性予以綜述，以強(qiáng)調(diào)針對(duì)科學(xué)問題采用適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型的重要性。

1 血管內(nèi)皮功能障礙模型

血管內(nèi)皮功能障礙是PE的典型特征，其中可溶性fms樣酪氨酸激酶1(soluble fms-like tyrosine kinase-1，sFlt-1)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)以及內(nèi)毒素引起的炎癥反應(yīng)在PE疾病中的作用得到廣泛關(guān)注。

1.1sFlt-1模型 近年來，各種PE模型在疾病病理生理機(jī)制探究中被應(yīng)用[6]，這使得研究人員能夠更好地了解PE的病理生理機(jī)制，其中在大鼠和小鼠中過表達(dá)sFlt-1是PE的重要模型。Maynard等[7]研究證明，給予大鼠尾靜脈輸入外源性sFlt-1，大鼠可產(chǎn)生PE表型，包括高血壓并伴有蛋白尿、腎小球內(nèi)皮增生，且PE妊娠大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PIGF)的拮抗劑sFlt-1上調(diào)。sFlt-1是VEGF受體fms樣酪氨酸激酶1的剪接變體，是VEGF和PIGF有效的拮抗劑，它缺乏跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，由胎盤等許多組織產(chǎn)生，但其生理作用尚不清楚[8]。PE胎盤中sFlt-1信使RNA(messenger RNA，mRNA)上調(diào)，這與循環(huán)中sFlt-1蛋白的增加有關(guān)，且其含量在分娩后48 h內(nèi)下降[9]。但值得注意的是，sFlt-1的全身性作用不需要存在胎盤，這表明sFlt-1對(duì)母體內(nèi)皮細(xì)胞具有直接作用。此外，也有研究提出可以通過胎盤特異性基因操作，如Kumasawa等[10]采用將表達(dá)人源性sFlt-1的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至小鼠囊胚，再移植到假孕母鼠體內(nèi)，通過在小鼠胎盤中特異性表達(dá)人源性fms樣酪氨酸激酶1，開發(fā)了PE獨(dú)特的動(dòng)物模型。該模型可以觀察到明顯的胎盤血管生成受損和子宮內(nèi)生長(zhǎng)受限。

然而，在某些PE患者體內(nèi)的sFlt-1表達(dá)并不增加，特別是遲發(fā)性PE患者。因此，在選擇PE動(dòng)物模型時(shí)需要根據(jù)研究目的來選擇合適的動(dòng)物模型。

1.2NOS抑制模型 PE發(fā)病與內(nèi)皮型NOS表達(dá)減少導(dǎo)致的一氧化氮(nitric oxide，NO)失活之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性，NO由血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，既可舒張?bào)w內(nèi)血管平滑肌，又可以有效增加血管有效彈性[11]，在血壓調(diào)節(jié)中起重要作用。因此，NO缺乏可導(dǎo)致平均動(dòng)脈壓升高以及血管升壓素的反應(yīng)敏感性增加[12]。N-硝基-L-精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)是NOS的非特異性抑制劑，有證據(jù)表明L-NAME可以作為大鼠PE綜合征的誘發(fā)劑[13]。

Lu等[14]從小鼠妊娠的第13天開始，經(jīng)飲水給小鼠喂養(yǎng)60 mg/(kg·d)的L-NAME，持續(xù)給藥作用至妊娠的第20天，成功構(gòu)建小鼠PE NOS抑制模型，該模型小鼠出現(xiàn)動(dòng)脈壓升高，妊娠結(jié)束時(shí)存活的胎鼠數(shù)量減少以及胰島素抵抗明顯增加。同樣L-NAME在大鼠PE模型中使用也較為廣泛，Yallampalli和Garfield[15]對(duì)妊娠早期大鼠皮下注射L-NAME，對(duì)照大鼠注射相同劑量的硝酸甘油，結(jié)果表明，與對(duì)照大鼠相比，每天注射25 mg/(kg·d)和50 mg/(kg·d)的L-NAME大鼠收縮壓呈劑量依賴性增加，同時(shí)妊娠大鼠出現(xiàn)高血壓、胎鼠發(fā)育遲緩等表現(xiàn)，符合PE的臨床癥狀。此外，胎鼠出現(xiàn)了明顯的體重下降，其機(jī)制尚未清楚，可能與NO調(diào)節(jié)子宮胎盤血流量有關(guān)[16]。由此可見，對(duì)孕鼠注射L-NAME可誘導(dǎo)產(chǎn)生高血壓、蛋白尿、腎功能損傷、胎盤病理、肝功能損傷以及胎鼠發(fā)育受限、畸形、自然流產(chǎn)、死胎等，與人類PE表型極為相似[17]。雖然通過長(zhǎng)期抑制NOS誘發(fā)的PE動(dòng)物模型有很多可觀的臨床表現(xiàn)，但由于NO高度不穩(wěn)定，需通過測(cè)定NO的代謝產(chǎn)物硝酸鹽或亞硝酸鹽來判斷NO活性[18]，以評(píng)估臨床表征的準(zhǔn)確性。

1.3低劑量?jī)?nèi)毒素動(dòng)物模型 在Faas等[19]的研究中，基于內(nèi)毒素和PE引起的Shwartzman反應(yīng)有許多相似的病理生理現(xiàn)象，所以他們提出使用內(nèi)毒素誘導(dǎo)的妊娠大鼠構(gòu)建PE動(dòng)物模型。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種有毒成分，其與PE胎兒生長(zhǎng)受限密切相關(guān)。1994年，F(xiàn)aas等[19]在大鼠妊娠第14天經(jīng)頸靜脈插管1 h內(nèi)滴注LPS，劑量為1.0 μg/kg，其可導(dǎo)致妊娠大鼠胎盤炎癥，繼而出現(xiàn)胎兒流產(chǎn)和胎兒生長(zhǎng)受限癥狀，構(gòu)建了經(jīng)典的PE大鼠模型。Hu等[20]在SD大鼠妊娠第13天開始腹腔注射LPS，劑量為20 μg/kg，隨后在第14～18天劑量每天增加10 μg/kg，他們認(rèn)為該劑量是LPS誘導(dǎo)大鼠PE模型的最佳劑量，并通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定發(fā)現(xiàn)，孕鼠血清腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-6等炎癥因子水平升高，胎盤浸潤(rùn)增加，且出現(xiàn)高血壓、蛋白尿等PE典型癥狀，同時(shí)胎鼠有明顯的生長(zhǎng)受限與早產(chǎn)癥狀。雖然低劑量?jī)?nèi)毒素誘導(dǎo)的PE模型構(gòu)建操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，但腎病理改變的報(bào)道較少。

2 子宮胎盤灌注減少模型

目前，已有多個(gè)模型動(dòng)物闡明缺氧和缺氧再灌注損傷在PE病理生理中的作用[21]。子宮胎盤灌注減少(reduced uteroplacental perfusion，RUPP)在PE發(fā)病中起重要作用，因此，建立一種動(dòng)物模型來模擬PE發(fā)病中子宮動(dòng)脈的灌注壓力和血流量減少非常有必要。Crews等[22]選取妊娠中期(妊娠第14天)的SD大鼠，將銀夾(直徑為0.203 mm)分別放置在大鼠腹主動(dòng)脈與左、右側(cè)卵巢動(dòng)脈以減少流向子宮胎盤的血液。這種方法可使妊娠大鼠子宮灌注壓降低約40%，同時(shí)可引起大鼠高血壓、血管功能障礙、胎盤缺氧，約50%的胎兒丟失且存活胎兒體重減輕；此外體內(nèi)循環(huán)中腫瘤壞死因子-α和sFlt-1水平升高，且VEGF和PIGF水平下降，符合PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)。Fushima等[23]在美國(guó)癌癥研究所品系中成對(duì)繁殖小鼠1～2個(gè)月，并在第14.5天時(shí)采用異氟烷麻醉妊娠小鼠，結(jié)扎卵巢分支血管束和子宮血管束構(gòu)建RUPP小鼠模型。結(jié)果顯示，小鼠血清中的sFlt-1水平升高，出現(xiàn)妊娠期高血壓，蛋白尿排泄增多，胎鼠吸收和生長(zhǎng)受限。

RUPP模型是迄今為止可重復(fù)性最高的PE嚙齒動(dòng)物模型[24]。但是在RUPP模型中，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞并不出現(xiàn)功能障礙，因此并不能用于對(duì)PE腎功能損害的研究。盡管動(dòng)物RUPP模型體現(xiàn)了許多PE的典型臨床特征，但仍存在一定的局限性，其中最重要的為RUPP模型不能用于研究PE的早期機(jī)制，尤其是PE相關(guān)的滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲，血管重塑以及這些因素引起的免疫反應(yīng)；此外，為RUPP模型結(jié)扎在一定程度上造成流向心臟、胃、腎臟、腸道等器官的血流量減少，影響了心排血量和血流動(dòng)力學(xué)[25]。

3 腎素-血管緊張素系統(tǒng)紊亂模型

在正常妊娠過程中，腎素-血管緊張素系統(tǒng)在蛻膜、胎盤形成和螺旋動(dòng)脈重構(gòu)中起重要作用。通過將表達(dá)人類血管緊張素雌性小鼠與表達(dá)人類腎素雄性小鼠交配可成功建立PE模型。胎盤中人源血管緊張素、人源腎素被分泌到母體循環(huán)，這會(huì)導(dǎo)致妊娠小鼠在妊娠晚期出現(xiàn)血壓暫時(shí)升高、蛋白尿、胎盤壞死、胎鼠體重降低[26]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)與血管緊張素Ⅱ1型受體自身抗體(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibodies，AT1-AAs)密切相關(guān)，AT1-AAs已被證明能夠特異性地刺激血管緊張素Ⅱ1型受體(一種公認(rèn)的高血壓介質(zhì))。血管緊張素受體與血管緊張素Ⅱ結(jié)合導(dǎo)致全身微動(dòng)脈收縮，動(dòng)脈血壓升高[27]。AT1-AAs在PE患者的血清中上調(diào)，且能夠激活與sFlt-1、內(nèi)皮素-1上調(diào)相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[28]。Siddiqui等[29]提取PE妊娠婦女800 μg總IgG或AT1-AAs，在小鼠妊娠第13天時(shí)經(jīng)框內(nèi)注射，結(jié)果顯示小鼠也出現(xiàn)腎小球、胎盤的異常表現(xiàn)。雖然此類造模操作較為復(fù)雜，但該類模型可為PE與自身免疫性疾病的研究提供有效的實(shí)驗(yàn)工具。

4 基因操控動(dòng)物模型

PE基因缺陷模型多采用基因打靶技術(shù)敲除單個(gè)基因，觀察該基因缺陷動(dòng)物孕期是否會(huì)出現(xiàn)PE樣臨床癥狀。該造模方法是以基因操控的方式，調(diào)節(jié)特定的蛋白表達(dá)，從而觀察某一特點(diǎn)基因在PE形成中的作用。

4.1兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-O-methyl transferase，COMT)模型 PE患者胎盤缺氧會(huì)破壞血管生成的平衡，涉及VEGF、PLGF和sFlt-1異常表達(dá)，最終導(dǎo)致PE樣臨床癥狀。但是，典型的PE癥狀不僅僅是高表達(dá)sFlt-1和低表達(dá)PLGF，低水平sFlt-1和高水平PLGF在患者中也可存在。

Parchem等[30]的研究表明，COMT缺陷(Comt-/-)小鼠在妊娠期間表現(xiàn)出PE樣表型。缺乏COMT的妊娠小鼠由于缺乏2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)而表現(xiàn)出高血壓、蛋白尿、腎小球病變等PE表型。同時(shí)，Kanasaki等[31]在Comt-/-PE模型中還發(fā)現(xiàn)孕鼠出現(xiàn)宮內(nèi)發(fā)育遲緩癥狀，且該模型中孕鼠子宮蛻膜中動(dòng)脈出現(xiàn)了血栓的情況，而胎盤中迷路層與海綿層中的滋養(yǎng)層細(xì)胞和巨滋養(yǎng)層細(xì)胞未見異常．也未見滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)情況。2-ME由COMT在胎盤中產(chǎn)生，它是雌二醇的天然代謝產(chǎn)物，在懷孕期間水平會(huì)升高，重度PE患者胎盤COMT活性受到抑制。2-ME可以改善Comt-/-妊娠小鼠的PE特征，無毒且可抑制胎盤缺氧，抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)和sFlt-1的表達(dá)。該模型具有許多PE樣臨床癥狀，為研究者探究PE發(fā)病與先天遺傳或內(nèi)分泌代謝異常間的關(guān)系提供了一定的研究方向。

4.2胎盤腺苷脫氨酶缺乏模型 胎盤在妊娠中起著多種作用，不僅支持胎兒在子宮中的生長(zhǎng)，還可以向胎兒輸送氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并清除母體內(nèi)胎兒排泄的廢物[32]，是一種在妊娠期間將母體和胎兒連接起來新形成的器官。此外，胎盤還是一種可以合成、分泌各種激素、神經(jīng)遞質(zhì)以及血管活性分子的內(nèi)分泌器官。腺苷是體內(nèi)的關(guān)鍵信號(hào)分子，是機(jī)體缺氧時(shí)局部產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性物質(zhì)。但是，某些疾病狀態(tài)與腺苷的長(zhǎng)期增加相關(guān)，因此產(chǎn)生持久性腺苷信號(hào)是有害的[33]。以往有文獻(xiàn)報(bào)道，孕婦的腺苷水平升高[34]。為了探究過量胎盤腺苷的病理后果，Iriyama等[35]設(shè)計(jì)了兩種獨(dú)立的PE動(dòng)物模型，一種是僅在胎盤中腺苷水平升高的基因工程妊娠小鼠，另一種是病源性自身抗體誘導(dǎo)的PE動(dòng)物模型。他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中將雄性Ada-/-/fLi-Tg+與雌性Ada+ /-/fLi-Tg+交配，構(gòu)建了僅在胎盤中腺苷水平升高的基因工程妊娠小鼠——胎盤腺苷脫氨酶缺乏小鼠，結(jié)果顯示，與胎盤腺苷脫氨酶陽性小鼠相比，在胚胎的第12.5天，胎盤腺苷脫氨酶缺乏小鼠胎盤中的腺苷水平顯著升高，且在第18.5天繼續(xù)升高；同時(shí)，腺苷脫氨酶缺乏小鼠平均收縮壓于胚胎的第15.5天開始升高，一直持續(xù)至產(chǎn)后第5天；尿蛋白于胚胎的第18.5天升高，一直持續(xù)至產(chǎn)后第7天。除上述表現(xiàn)外，該模型小鼠也出現(xiàn)了sFlt-1基因水平升高、母體出現(xiàn)腎臟病理改變以及胎盤重量顯著降低與胎兒生長(zhǎng)受限等PE典型癥狀。

該類型模型的建立為進(jìn)一步探究腺苷及其相關(guān)因素在PE發(fā)病、發(fā)展中的作用提供新的研究方向。

5 小 結(jié)

隨著科研人員對(duì)PE發(fā)生和發(fā)展機(jī)制認(rèn)識(shí)的提高，至今人們才完全認(rèn)識(shí)這種疾病的異質(zhì)性，對(duì)PE疾病的新認(rèn)識(shí)表明PE的特征可能是由于不同原因引起，由此科研人員嘗試構(gòu)建各種類型的PE動(dòng)物模型，這些動(dòng)物模型為PE的探究和某些致病因素提供了許多理論支持。應(yīng)當(dāng)指出的是，許多干預(yù)措施可以導(dǎo)致動(dòng)物引起妊娠期高血壓、蛋白尿等PE樣臨床癥狀。雖然PE的動(dòng)物模型多種多樣，但也各有其優(yōu)缺點(diǎn)，且它們的重復(fù)性和特性也不相同。同時(shí)，PE動(dòng)物模型由于其發(fā)病機(jī)制不同而存在自身的局限性，PE是多種因素共同作用產(chǎn)生的緩慢而復(fù)雜的過程，動(dòng)物的胎盤形態(tài)、生理特性與人類本質(zhì)上不同，所以無論哪一種模型均很難完全再現(xiàn)人類的病理過程。因此，研究人員必須了解每種動(dòng)物模型的特點(diǎn)及局限性，以確保在探究疾病的同時(shí)能夠選擇最佳模型來解決適當(dāng)?shù)目茖W(xué)研究問題。在目前的情況下，根據(jù)研究的需要，可以在必要時(shí)采取多種建模方法以期更接近人類PE動(dòng)物模型，從而為探索PE的發(fā)病機(jī)制以及預(yù)防和治療提供新思路。