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    抑制SLP-2對宮頸癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響*

    2021-09-28 03:03:42趙晶蕾韋廣月劉艷潔
    西部醫(yī)學(xué) 2021年9期
    關(guān)鍵詞:劃痕鱗癌腺癌

    趙晶蕾 韋廣月 劉艷潔

    (貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)系,貴州 貴陽 561000)

    宮頸癌是臨床上常見的婦科惡性腫瘤之一,我國每年新增病例高達(dá)13萬,其中大約5萬人死亡[1]。手術(shù)和放化療是治療宮頸癌的常用手段,特別是化療,有利于清除殘余微小病灶并防止癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。然而化療容易導(dǎo)致耐藥,且毒副作用較大。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,分子靶向治療已成為治療宮頸癌的熱點(diǎn)方向[2]。stomatin樣蛋白2(stomatin-like protein 2,SLP-2)是一種外周膜蛋白,屬于stomatin基因超家族成員,可以調(diào)節(jié)線粒體蛋白的穩(wěn)定性。本研究以人宮頸腺癌Hela細(xì)胞和鱗癌Siha細(xì)胞為研究對象,通過小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制SLP-2的表達(dá),以觀察抑制SLP-2對宮頸癌細(xì)胞侵襲及遷移的影響,為抑制SLP-2靶向治療宮頸癌的可能性提供理論依據(jù),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料 人宮頸腺癌Hela細(xì)胞和鱗癌Siha細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫,常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(上海生物工程有限公司)的DMEM-1640培養(yǎng)基(上海北諾生物科技有限公司)中,在37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。SLP-2siRNA和siRNA陰性對照均購于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000 Reagent購于上海瓦蘭生物科技有限公司??? SLP2、抗-actin、抗-Rac1、抗-基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、抗MMP-9和二抗均購于上海生物工程有限公司。BioCoatMatrigel invasion chamber試劑盒購于上海澤邁生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞侵襲及細(xì)胞培養(yǎng)板購于北京明陽科華生物科技有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 Hela細(xì)胞和Siha細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),條件為37℃、5%CO2。用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行傳代。將Hela細(xì)胞或Siha細(xì)胞分為siRNA陰性對照組(siRNA-CON)和SLP2-siRNA組。將T-24細(xì)胞接種至細(xì)胞培養(yǎng)板上,接種密度為1×109/L。當(dāng)細(xì)胞融合度超過60%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,操作步驟按Lipofectamine TM 2000 Reagent說明書進(jìn)行。

    1.2.2 Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞培養(yǎng)2d后加入蛋白裂解液,冰上裂解25 min后,15000 轉(zhuǎn)/min離心15min,將上清液轉(zhuǎn)移至EP管中。樣品中加入SDS緩沖液煮沸5min使蛋白變性。經(jīng)凝膠電泳(SDS-PAGE)后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉1h,孵育一抗,4℃過夜,棄去一抗,TBST洗膜3次,每次5min。室溫孵育二抗2h,棄去二抗,TBST洗膜3次,每次5min。ECL顯色,以actin作為內(nèi)參,計(jì)算目標(biāo)蛋白條帶與actin灰度比值。

    1.2.3 細(xì)胞侵襲能力檢測 按照BioCoatMatrigel invasion chamber試劑盒說明書嚴(yán)格操作,顯微鏡下取6個(gè)不同視野(×200倍)進(jìn)行計(jì)數(shù),重復(fù)3次,求取侵襲細(xì)胞的平均數(shù)。

    1.2.4 細(xì)胞遷移能力檢測 待轉(zhuǎn)染后細(xì)胞數(shù)超過70%生長融合時(shí),采用移液槍頭沿著培養(yǎng)板底端劃一字型劃痕,用PBS沖洗,換無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),在培養(yǎng)0、6、12、24、36小時(shí)在顯微鏡下測量劃痕寬度。細(xì)胞遷移率=(1-測量時(shí)劃痕寬度/初始劃痕寬度)×100%[8]。

    2 結(jié)果

    2.1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞SLP-2蛋白表達(dá)情況 Western blot檢測結(jié)果顯示,SLP2-siRNA組Hela細(xì)胞和Siha細(xì)胞中SLP-2蛋白水平均低于siRNA-CON組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

    圖1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞SLP-2蛋白表達(dá)情況(n=5)

    2.2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力比較 Transwell小室試驗(yàn)結(jié)果顯示,SLP2-siRNA組Hela細(xì)胞和Siha細(xì)胞侵襲能力低于siRNA-CON組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

    圖2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲能力情況(n=5)

    2.3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力比較 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示,SLP2-siRNA組Hela細(xì)胞和Siha細(xì)胞24h和36h遷移能力低于siRNA-CON組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

    圖3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移能力情況(n=5)

    2.4 轉(zhuǎn)染后Rac1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá) Western blot檢測結(jié)果顯示,SLP2-siRNA組Hela細(xì)胞和Siha細(xì)胞中Rac1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均低于siRNA-CON組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

    圖4 轉(zhuǎn)染后Rac1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)情況(n=5)

    3 討論

    近年來,越來越多的研究證實(shí),SLP-2與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),與腫瘤細(xì)胞的增殖分化、凋亡和侵襲有關(guān)[3]。Zhang等[4]發(fā)現(xiàn),SLP-2過表達(dá)可以上調(diào)膠原和鈣結(jié)合EGF域1(collagen and calcium binding EGF domains 1,CCBE1)促進(jìn)直腸癌淋巴管形成,以促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。陳小忠等發(fā)現(xiàn),下調(diào)SLP-2可以抑制人腦膠質(zhì)細(xì)胞的增殖,并誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生,而這一過程可能與抑制Noth信號通路有關(guān)[5]。另外既往也有報(bào)道稱,SLP-2與肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲有關(guān)[6]。SLP-2在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中有何意義,既往報(bào)道較少。Hu等[7]發(fā)現(xiàn)SLP-2可以通過MEK/ERK通路和線粒體細(xì)胞凋亡抑制順鉑誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡。

    SLP-2是stomatin家族成員之一,它可以將stomatin或其它整合蛋白與周圍組織細(xì)胞骨架聯(lián)合,參與離子通道傳導(dǎo)和脂質(zhì)調(diào)控,通過影響細(xì)胞粘附功能而成為癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的重要因素[9-11]。SLP-2在心臟、肝臟和腎臟等多組織中表達(dá),既往研究證實(shí)非小細(xì)胞肺癌[9]、肝癌[6]、卵巢癌[12]和食管癌等組織中[13]。SLP-2的高表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程有關(guān)[14]。在臨床研究中,Sun等[12]發(fā)現(xiàn)SLP-2表達(dá)水平升高與宮頸癌肌層浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤等有關(guān)。既往關(guān)于SLP-2對宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移能力影響的報(bào)道較少,本研究以人宮頸腺癌Hela細(xì)胞和鱗癌Siha細(xì)胞為研究對象,通過siRNA抑制SLP-2,結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞侵襲及遷移明顯受到抑制。這提示SLP-2可能參與了宮頸癌的遷移和侵襲。

    線粒體蛋白組學(xué)研究顯示,SLP-2是線粒體蛋白,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體的生物學(xué)功能[15]。在腫瘤學(xué)研究中,SLP-2可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖分化和粘附等。馮倩等采用siRNA技術(shù)下調(diào)SLP-2表達(dá),發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)蛻膜化標(biāo)志物胰島素生長因子結(jié)合蛋白-1(insulin like growth factor binding protein 1,IGFBP-1)和催乳素(prolactin,PRL)的蛋白表達(dá)明顯增加,蛻膜化行為明顯受到抑制,另外細(xì)胞增殖標(biāo)志分子CCND-3蛋白表達(dá)下降,提示細(xì)胞增殖能力下降。結(jié)果說明SLP可以影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖及分化[16]。Hu等[7]發(fā)現(xiàn),SLP-2可以通過激活MEK/ERK信號通路抑制宮頸癌細(xì)胞線粒體凋亡途徑。在臨床研究中,有報(bào)道稱SLP-2與宮頸癌腫瘤分期和腫瘤大小有關(guān)[17-19]。以上研究提示,SLP-2在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20]。本研究分別采用Transwell小室試驗(yàn)和細(xì)胞劃痕試驗(yàn)對癌細(xì)胞侵襲和遷移能力進(jìn)行評價(jià),發(fā)現(xiàn)抑制SLP-2表達(dá)后,宮頸腺癌Hela細(xì)胞和鱗癌Siha細(xì)胞遷移和侵襲能力均下降。Rac1、MMP-2、MMP-9均與細(xì)胞侵襲能力有關(guān)[21-23],發(fā)現(xiàn)這3個(gè)分子在SLP-2抑制后表達(dá)水平均明顯下降,這進(jìn)一步證實(shí)SLP-2與宮頸癌細(xì)胞侵襲能力有關(guān)。因此,我們推測,宮頸癌細(xì)胞中SLP-2的表達(dá),可能通過促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)Rac1、MMP-2、MMP-9等因子的表達(dá),從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲。但SLP-2是否會通過影響宮頸癌細(xì)胞線粒體功能,進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移,目前尚未進(jìn)行探討。張佳露等[24]采用siRNA技術(shù)抑制宮頸癌細(xì)胞SLP-2的表達(dá),發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化受到抑制,間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子vimentin蛋白表達(dá)明顯下降,與之一致的是癌細(xì)胞侵襲能力明顯下降。本研究結(jié)論與之類似。

    本研究的局限性為:①本研究雖然發(fā)現(xiàn)SLP-2與宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān),但是未探討具體機(jī)制。②SLP-2是線粒體蛋白,可以調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體的生物學(xué)功能,本研究并未探討宮頸癌細(xì)胞線粒體功能的變化。③本研究為體外研究,SLP-2與宮頸癌生物學(xué)行為的關(guān)系不能明確,需要未來進(jìn)行組織學(xué)研究。

    4 結(jié)論

    本研究結(jié)果提示,干擾SLP-2表達(dá)后人宮頸腺癌Hela細(xì)胞和鱗癌Siha細(xì)胞侵襲能力和遷移能力明顯下降,提示SLP-2在宮頸癌進(jìn)展中有著重要作用,可能是潛在的轉(zhuǎn)移預(yù)測標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。但還需要進(jìn)一步地對SLP-2的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

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