瀘州地區(qū)宮頸病變患者高危HPV感染基因型分析

成克銘 溫若愚 杜仲 溫先勇

(1.瀘州市人民醫(yī)院檢驗科,四川 瀘州 6460002;瀘州市江陽區(qū)婦幼保健院檢驗科,四川 瀘州 646000; 3.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科,四川 瀘州 646000)

高危人乳頭瘤病毒(High risk Human papillomavirus,HR-HPV)感染可引起人類黏膜上皮細胞的增生病變，導致包括宮頸癌在內的多種宮頸疾病的發(fā)生，持續(xù)感染是其發(fā)病的必要條件[1]，國內外資料報道多以16型、18型為主，且分布存在較大的地域差異[2-3]。而宮頸癌是癌癥中為數不多發(fā)病原因明確、可以預防的腫瘤病變之一，HPV疫苗研制和使用為宮頸癌的預防提供了一種有效的手段。所以，了解本地HR-HPV的型別與宮頸病變的關系、在人群分布特征對本病預防及治療尤為重要，目前，瀘州地區(qū)對HR-HPV感染患者基因型的研究資料不多，為了解本地區(qū)HR- HPV感染的基因分布特征、與宮頸病變的關系及指導HPV疫苗的使用,本研究通過對瀘州地區(qū)2778例宮頸病變患者高危HPV感染狀況的調查,旨在為宮頸疾病的防治提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年8月～2019年9月期間，在瀘州市人民醫(yī)院婦科就診并接受HPV基因分型檢測、年齡在17～76歲的患者共計2778例，其中臨床明確診斷患者1689例,包括炎癥患者1473例(急性宮頸炎271例、慢性宮頸炎1202例)、宮頸上皮內瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)患者124例[輕度上皮內瘤樣病變(CIN Ⅰ)58例、中度上皮內瘤樣病變(CIN Ⅱ)37例、重度上皮內瘤樣病變(CIN Ⅲ)29例)]、宮頸癌患者92例(鱗癌85例，腺癌7例)。根據臨床診斷將炎癥患者分為急性宮頸炎癥組和慢性宮頸炎癥組；根據宮頸病理學檢查結果，將宮頸上皮內瘤變患者分為輕度上皮內瘤樣病變(CIN Ⅰ)組、中度上皮內瘤樣病變(CIN Ⅱ)組、重度上皮內瘤樣病變(CIN Ⅲ)組；依據癌變細胞的來源，將宮頸癌患者分為宮頸鱗狀細胞癌(鱗癌)組和腺癌組。本研究患者均知情同意，并經瀘州市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核、批準。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與保存 采用專用宮頸脫落細胞采集器,去除宮頸多余分泌物后，將刷裝收集器在子宮頸處單向旋轉4～5周,取得分泌物樣本后盡快送檢,否則,于2～8℃條件下保存于7天內檢測。

1.2.2 HPV基因型檢測原理 分離提取宮頸細胞內的HPV-DNA，首先進行PCR擴增，然后以凱普醫(yī)用核酸分子快速雜交儀為平臺在已固定好核酸探針的低密度基因芯片膜上進行導流雜交，可一次性檢測21種HPV亞型。

1.2.3 HPV基因型檢測方法

1.2.3.1 HPV-DNA提取 取刷頭洗脫樣品1 mL于1.5 mL離心管中，14 000 rpm離心5 min，棄去上清液→加入100μL裂解液，金屬浴100℃裂解10 min→13 000rpm離心10 min，留上清液備用。

1.2.3.2 PCR擴增 標記反應管，在擴增試劑中加入的待測DNA模板1μL，于東勝ETC811型PCR擴增儀(國產)，按照以下條件進行擴增：20℃ 10 min；95℃ 9 min；95℃ 20 sec→55℃ 30 sec→72℃ 30 sec進行40次循環(huán)，72℃ 5 min，擴增試劑盒由凱普生物化學科技公司提供。

1.2.3.3 導流雜交 將已變性的各PCR擴增產物加入凱普HBHM-3000S型雜交儀的雜交孔內，然后進行導流雜交，詳細操作按照說明書由熟練技師嚴格進行；顯色后以膜條上出現(xiàn)清晰可見的藍紫色圓點為HPV結果陽性，并根據膜條 HPV分型分布圖，判斷 HPV陽性類型。全程設立陰、陽性對照。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計數資料以率(%)表示，兩組或多組間比較采用2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HPV基因型在患者中的分布 2778例患者共檢出651例HR-HPV陽性(感染率為23.43%)；高危型18種885項，陽性率31.86%(885/2778),由高到低前3位依次為：52型、16型、58型(見表1)。651例HPV陽性患者中，含單一HR-HPV436例(占66.97%，436/651)，以52型(22.03%，195/885)最為多見；多重感染(2-6重感染)共215例(占33.03%，215/651)，以52型-16型混合感染最為多見(15.35%，33/215)。

表1 HR-HPV各亞型分布

2.2 HR-HPV基因型在宮頸病變患者中的分布 急性宮頸炎癥組和慢性宮頸炎癥組其HR-HPV感染率比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表2)。其HR-HPV感染率，CIN Ⅰ組(31.03%)上皮內瘤變>炎癥患者,經2檢驗分析，三組之間差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表5。

表2 不同類型宮頸炎癥患者HR-HPV感染率比較

表3 不同類型宮頸上皮瘤樣病變患者HR-HPV 感染率比較

表4 不同類型宮頸癌患者的HR-HPV陽性率比

表5 不同宮頸病變分級患者的HR-HPV感染率比較

2.3 不同宮頸病變患者HR-HPV感染前三位基因型統(tǒng)計 統(tǒng)計炎癥患者、上皮內瘤變患者、宮頸癌患者HR-HPV感染的基因型，感染率居前三位的基因型均為52型、16型和58型，見表6。

表6 不同宮頸病變患者HR-HPV感染優(yōu)勢基因型統(tǒng)計[n(×10-2)]

3 討論

文獻報道，HR- HPV引起炎癥、上皮增生繼而導致瘤樣病變或腫瘤的發(fā)生[4]，但導致病變的HR-HPV種類存在很大的地域性差異，與疾病的關系仍處于不斷的探索之中。國外報道誘發(fā)多種良惡性增生性疾病的HR- HPV達100余種，常見型別為HPV16型、HPV18型[5-7]，其中HPV16 是最普遍的宮頸HPV 病毒感染的癌基因類型，它作為單一因素或是負荷因素在宮頸病變的發(fā)病機制中所起作用較HPV18 更強[8]。52型、58型HR- HPV在國內多地感染常處于中、低水平，檢出率一般在0.33%～2.39%和0%～1.86%之間[9-10]，所以，其致病作用并未得到足夠的重視，但近年來其流行有逐漸增強的趨勢。本實驗結果顯示，瀘州地區(qū)52型、58型就診患者檢出率分別達到6.89%和3.11%，與常見16型(感染率5.11%)一道，并分別以21.86%、15.87%和9.87%構成比占據了HR- HPV感染率的前三位，與國內外多地報道存在較大差異[11-13]，也與云南地區(qū)(16型、58型、33型)[14]、貴州地區(qū)(16型、33型、58型)[15]及重慶地區(qū)(高危16型、58型、52型)[16]等周邊地區(qū)在型別和感染率等方面存在明顯差異，僅與海南、河北地區(qū)等少數報道一致[17]。

對宮頸病變患者的分型中發(fā)現(xiàn)，急性炎癥組感染率高于慢性炎癥組；上皮內瘤變組HR- HPV感染率隨上皮內瘤變程度逐漸增高,但只有CIN Ⅰ患者與CIN Ⅲ患者之間差異有統(tǒng)計學意義；宮頸癌中鱗癌組感染率顯著高于腺癌組；炎癥、上皮細胞瘤樣病變、宮頸癌三組患者隨病病理分級的升高，HR- HPV感染率也明顯上升，證實了HR- HPV感染與宮頸病變程度具有高度的相關性[18-19]。對宮頸病變患者進一步分析表明，52型、58型與常見型16型一道，占據了炎癥患者組、上皮內瘤變患者組、宮頸癌患者組HR- HPV感染率的前三位，與本地區(qū)既往資料比較[20-21]，52型、58型已經超越18型、33型，成為本地區(qū)HR- HPV感染的優(yōu)勢基因型，也是導致本地區(qū)女性宮頸病變的主要原因，研究其分布和感染規(guī)律，可為HPV疫苗的使用和宮頸病變疾病的防治提供依據。

4 結論

瀘州地區(qū)宮頸病變患者HR- HPV感染以52型、16型、58型為主，也是導致該地區(qū)女性宮頸炎癥、上皮內瘤樣病變及宮頸癌等宮頸病變的主要基因型別，該研究結果對本地區(qū)HR- HPV患者診治及HPV疫苗的使用具有一定指導意義。