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    紅曲霉液體發(fā)酵合成 γ-氨基丁酸的研究

    2021-09-27 00:30史紅征吳彥彥史曉靜鐘凱魏旭穎朱會霞
    中國食品 2021年17期
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)液靜置菌絲

    史紅征 吳彥彥 史曉靜 鐘凱 魏旭穎 朱會霞

    γ-氨基丁酸是一種天然的、食品級的、對人體具有多種功效的非蛋白質(zhì)氨基酸,由谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化脫羧而來。2009年,原衛(wèi)生部允許γ-氨基丁酸在食品生產(chǎn)加工中適量添加使用。食品工業(yè)中生產(chǎn)γ-氨基丁酸常用微生物發(fā)酵法,紅曲霉是其中最常用的微生物。本文通過研究發(fā)酵對紅曲霉γ-氨基丁酸生物合成的影響,為紅曲霉高產(chǎn)γ-氨基丁酸培養(yǎng)條件的優(yōu)化提供依據(jù)。

    一、菌種

    紅曲霉菌種保存于衡水學(xué)院發(fā)酵工程實驗室。

    二、實驗與方法

    1.紅曲霉的液體培養(yǎng)。將斜面紅曲霉菌株接種至液體豆芽汁培養(yǎng)基中,在30℃條件下培養(yǎng)5d,將菌絲球再次轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基后分成2組,一組在搖床上經(jīng)30℃、150r/min震蕩培養(yǎng);另一組經(jīng)30℃靜置培養(yǎng),每日觀察。

    2.γ-氨基丁酸的含量測定。按照劉夢云等《GABA產(chǎn)生菌的篩選以及檢測方法的比較研究》,測定γ-氨基丁酸的含量。

    3.培養(yǎng)基的優(yōu)化。前期實驗所用的是豆芽汁、葡萄糖和酵母膏的液體培養(yǎng)基,從成本考慮改為豆粕粉、大米粉和酵母膏的液體培養(yǎng)基,做正交試驗確定培養(yǎng)基。

    4.分析優(yōu)化后的培養(yǎng)基的最佳轉(zhuǎn)速。優(yōu)化的培養(yǎng)基中因為加入了豆粕粉和大米粉而變得粘稠,將優(yōu)化培養(yǎng)基接種紅曲霉菌種,然后分別在90r/min、120r/min、? ? ? ? ? ? ? 150r/min、180r/min、210r/min的轉(zhuǎn)速下,在搖床上經(jīng)30℃培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)基的變化,并測定γ-氨基丁酸的含量以確定最佳轉(zhuǎn)速。

    三、結(jié)果與分析

    1.紅曲霉靜置培養(yǎng)和搖床培養(yǎng)液體培養(yǎng)狀態(tài)的差異。(1)靜置培養(yǎng)的紅曲霉液體培養(yǎng)物因為沒有搖床的震蕩分散作用,形成的菌絲粘連為片狀且為白色。隨著培養(yǎng)時間的增加,紅曲霉菌絲逐漸增多且成團,菌絲團中間的顏色也變?yōu)榧t色,邊緣的菌絲仍為白色,培養(yǎng)液的顏色變化不明顯。(2)在搖床中培養(yǎng)的液體培養(yǎng)物由于震蕩、分散和回旋的作用,發(fā)酵液中供氧充足有利于菌絲的擴增,形成了大量的菌絲球。隨著培養(yǎng)時間的增加,菌絲球漸漸變大,其顏色由白色變?yōu)榧t色;培養(yǎng)液的顏色漸漸加深,最后變?yōu)樽霞t色,其主要是由紅曲色素的積累增加所導(dǎo)致。

    2.紅曲霉液體培養(yǎng)菌絲觀察。(1)觀察不同培養(yǎng)時間下?lián)u床菌絲的形態(tài),初期菌絲有橫膈、無色透亮;中期菌絲開始出現(xiàn)無規(guī)則的分支,菌絲之間網(wǎng)狀聯(lián)合、分布密集;培養(yǎng)后期菌絲體開始形成孢子并不斷生長,并有部分孢子萌發(fā)。(2)靜置狀態(tài)下培養(yǎng)的紅曲霉菌絲分支較少,且菌絲分布稀疏、密度較小,更易觀察。通常在梗頂端生出倒梨形或球形的分生孢子。

    3.γ-氨基丁酸含量的測定。(1)隨著紅曲霉培養(yǎng)時間的增加,搖床培養(yǎng)液和靜置培養(yǎng)液中的γ-氨基丁酸生成量均逐漸增多,在培養(yǎng)至第5天時均達到最大值(搖床培養(yǎng)液和靜置培養(yǎng)液中分別是113.9mg/L和93.5mg/L),并且搖床培養(yǎng)液中的γ-氨基酸含量高于靜置培養(yǎng)液。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)培養(yǎng),搖床培養(yǎng)液和靜置培養(yǎng)液中的γ-氨基丁酸含量反而下降。(2)每天將紅曲霉搖床培養(yǎng)基和靜置培養(yǎng)基過濾后獲得菌絲,測定菌絲中的γ-氨基丁酸含量,其也隨培養(yǎng)天數(shù)的增長而增加。但菌絲中γ-氨基丁酸含量達到最大值的時間與培養(yǎng)液有差異,在第6天時γ-氨基丁酸達到最大值(搖床培養(yǎng)菌絲和靜置培養(yǎng)菌絲中分別是101.3mg/L和94.6mg/L)。

    搖床培養(yǎng)液和菌絲中的γ-氨基丁酸含量均分別高于靜置培養(yǎng)液和菌絲中的含量,原因在于紅曲霉是極好氧微生物,搖床培養(yǎng)比靜置培養(yǎng)能提供更多氧,有利于基質(zhì)轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸。因此,紅曲霉合成γ-氨基丁酸的最佳方式是搖床培養(yǎng),在此條件下最佳發(fā)酵天數(shù)是5d。綜上可知,搖床培養(yǎng)液中的γ-氨基丁酸含量高于搖床菌絲。搖床培養(yǎng)液中的γ-氨基丁酸含量高,并且能快速地應(yīng)用工業(yè)方法提取,而從菌絲中提取γ-氨基丁酸的工藝復(fù)雜、消耗較大,在工業(yè)生產(chǎn)中并不實用。

    4.優(yōu)化液體培養(yǎng)基。對R值(表1)進行分析發(fā)現(xiàn),豆粕粉的影響最大,大米粉的影響較小,而酵母膏對γ-氨基丁酸的產(chǎn)量基本沒有影響。分析K值,確定三種原料的最佳比例是A2B2C1,即每1L培養(yǎng)基中加入豆粕粉20g、大米粉40g、酵母膏5g。然而,A2B2C1組合并未在正交實驗中出現(xiàn),因此需進行驗證實驗。驗證實驗證實,A2B2C1組合的γ-氨基丁酸含量為240.31mg/L,高于正交實驗中最高量233.41mg/L,說明正交實驗得到的最優(yōu)組合的確為γ-氨基丁酸含量最高的培養(yǎng)基配比。

    5.搖床轉(zhuǎn)速對紅曲霉合成γ-氨基丁酸的影響。90r/min培養(yǎng)物中基本沒有泡沫,γ-氨基丁酸含量為182.7mg/L;120r/min和150r/min培養(yǎng)物中的泡沫很少,γ-氨基丁酸含量分別為216.3mg/L和260.1mg/L;180r/min培養(yǎng)物中,γ-氨基丁酸含量為為268.7mg/L,但產(chǎn)生的泡沫很多,有染菌的危險,而且γ-氨基丁酸產(chǎn)量與150r/min產(chǎn)量相差不多;210r/min培養(yǎng)物中的γ-氨基丁酸含量為223.6mg/L,但產(chǎn)生太多的泡沫,損失較大。因此,150r/min進行搖床培養(yǎng)是生產(chǎn)γ-氨基丁酸的最佳轉(zhuǎn)速條件。

    四、結(jié)論

    本文分析了培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基組成、搖床轉(zhuǎn)速等因素對紅曲霉中γ-氨基丁酸合成的影響,實驗結(jié)果將為紅曲霉合成γ-氨基丁酸的進一步研究提供理論依據(jù)。

    基金項目:國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目,項目編號:202010101008。

    作者簡介:史紅征(2000-),女,河北保定人,在讀本科,研究方向為食品質(zhì)量與安全。

    *通信作者:朱會霞(1977-),女,河北景縣人,教授,博士研究生,研究方向為發(fā)酵工程、中藥發(fā)酵。

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