桔梗湯協(xié)同增強(qiáng)消癌平口服液抗肺癌作用研究

李國(guó)峰，張武崗，郭瑩帆，蔡錦洪，梁新麗*，陳海芳*

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌330006； 2.江西中醫(yī)藥大學(xué)現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330004）

消癌平口服液是由通關(guān)藤藥材精制提取而成的中藥單方制劑。研究表明，消癌平對(duì)食管癌［1］、胃癌［2］以及肺癌［3］等癌癥有抗癌活性。然而在臨床應(yīng)用中，消癌平常與一線化療藥物順鉑［4］、吉非替尼［5］、紫杉醇［6］等聯(lián)合應(yīng)用居多，單獨(dú)用于抗癌治療較少。其原因可能與其所含藥效成分甾體皂苷類，生物利用度低有關(guān)。將引經(jīng)藥與化療藥合用，即“引經(jīng)化療”［7］，擬通過提高治療藥物靶區(qū)的藥物濃度，進(jìn)而提升藥物化療效果，是當(dāng)前惡性腫瘤治療中的一條新途徑、新方法。研究證實(shí)，許多引經(jīng)藥物包括冰片、川芎等引經(jīng)藥物可促進(jìn)抗腫瘤藥物順鉑、甲氨蝶呤和替莫唑胺在病變區(qū)的分布［8?10］。那么，是否可通過配伍引經(jīng)藥促進(jìn)消癌平提升抗癌藥效則是本文的研究目的。

桔梗湯出自《金匱要略》，由桔梗、甘草二味藥組成，是治療肺癰的有效處方。同時(shí)，李時(shí)珍在《本草綱目》 中指出，桔梗為肺部引經(jīng)藥，與甘草同行，可做舟楫之劑［11］。前人研究桔梗湯中的成分桔梗配伍化療藥可起到引經(jīng)增效作用。李揚(yáng)等［12］發(fā)現(xiàn)桔?？稍黾禹樸K原位肺癌移植瘤裸鼠體內(nèi)的分布，提升順鉑抗癌作用。桔梗配伍乳移平可能通過調(diào)節(jié)CXCL12／CXCR4 生物學(xué)軸及癌基因HER?2 抑制乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展［13］。本研究基于lewis 肺癌荷瘤小鼠模型，考察消癌平口服液配伍桔梗湯前后對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量變化、小鼠外周血常規(guī)、小鼠血清中IL?2、IL?10 的含量以及腫瘤體積和抑瘤率的影響，以期闡明桔梗湯配伍消癌平的解毒增效作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）；壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)好器械廠，型號(hào)LDZX?30KBS）；低速離心機(jī)（上海飛鴿股份有限公司，型號(hào)800B）；超凈工作臺(tái)［日本Sanyo 公司，型號(hào)MCV?B161S?（T）］；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；顯微鏡（德國(guó)Leika 公司，型號(hào)DMI3000B）；小動(dòng)物血細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，型號(hào)BC?2800vet）；血球儀（瑞士Swelab公司，型號(hào)Autocounter 900＋）；3?18K 型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）。

1.2 藥物與試劑 消癌平口服液（湖北鳳凰白云山藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20060319）；桔梗飲片（安徽濟(jì)善堂中藥科技有限公司，批號(hào)20170518）；甘草飲片（江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司，批號(hào)20170427）。DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone 公司）；胎牛血清（FBS）（美國(guó)Gemine 公司）；青鏈霉素（北京索萊寶科技有限公司）；胰蛋白酶（美國(guó)Genview 公司，批號(hào)20170327）；小鼠IL?2 ELISA 試劑盒（批號(hào)A202H90532），小鼠IL?10 ELISA 試劑盒（批號(hào)A210904141）。

1.3 動(dòng)物 C57BL／6 小鼠，雄性，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2016?0002］。

1.4 細(xì)胞株 Lewis 肺癌細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)，編號(hào)36470TM。

2 方法

2.1 桔梗湯水提液的制備 準(zhǔn)確稱取桔梗、甘草飲片各30.0 g，加入10 倍體積的雙蒸水浸泡30 min 后加熱煮沸，開始用強(qiáng)火，沸騰后改用文火，保持微沸1 h，攪拌，趁熱過濾，藥渣再加蒸餾水同法煮沸后1 h，濾過。合并濾液，經(jīng)濃縮，最后用雙蒸水定容至250 mL 容量瓶中，密封，放置4 ℃冰箱保存，備用。

2.2 Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型的制備 取所培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lewis 肺癌細(xì)胞，PBS 清洗2 次后，加胰蛋白酶2 mL消化后終止，1 000 r／min 離心5 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用DMEM 高糖培養(yǎng)基配制成濃度為5×106／mL的單細(xì)胞懸液備用。每只C57BL／6 小鼠右前肢腋下皮下注射0.2 mL 細(xì)胞懸液構(gòu)建Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型。注射后的C57BL／6 小鼠繼續(xù)按正常情況飼養(yǎng)，每天觀察小鼠接種后的生活狀態(tài)及皮下出瘤情況。

2.3 分組及給藥 接種10 d 左右，注射部位可見皮下腫瘤，腫瘤外觀近似圓形或橢圓形，選取腫瘤直徑為2～3 mm的荷瘤小鼠隨機(jī)分6 組，每組10 只，分別為模型組（生理鹽水）、消癌平口服液組（7.8 mL／kg）、低劑量組（7.8 mL／kg 消癌平口服液＋1.3 g 生藥／kg 桔梗湯）、中劑量組（7.8 mL／kg 消癌平口服液＋2.6 g 生藥／kg 桔梗湯）、高劑量組（7.8 mL／kg 消癌平口服液＋5.2 g 生藥／kg 桔梗湯）、桔梗湯組（2.6 g 生藥／kg 桔梗湯）。連續(xù)給藥2 周。另設(shè)正常組：常規(guī)飼養(yǎng)。

2.4 小鼠生存狀態(tài)觀察 每天觀察給藥后小鼠的活動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)水飲食量，毛發(fā)色澤，有無(wú)死亡情況以及體質(zhì)量變化。

2.5 瘤體積和抑瘤率測(cè)定 在給藥干預(yù)期間，每隔一天用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠瘤徑，計(jì)算瘤體積。末次給藥24 h 后頸椎脫臼法處死小鼠，剝?nèi)×鼋M織稱重。有效率為藥物抑瘤率≥60%的小鼠數(shù)量占本組小鼠總數(shù)中的比例。瘤體積V（mm3）＝a×b2／2 （a為腫瘤長(zhǎng)徑，b為腫瘤短徑），抑瘤率＝ ［（模型組瘤重－給藥組瘤重）／模型組瘤重］ ×100%。

2.6 小鼠臟器指數(shù)測(cè)定 末次給藥24 h 后稱重，采血后，小鼠脫頸椎處死，解剖并取出小鼠心臟，肝臟，脾臟，肺臟和腎臟組織并稱重。臟器指數(shù)（mg／g）＝臟器質(zhì)量（mg）／處死當(dāng)日體質(zhì)量（g）×100。

2.7 小鼠外周血常規(guī)的檢測(cè) 小鼠在末次給藥24 h 后，對(duì)各組C57BL／6 小鼠進(jìn)行靜脈眼眶取血，每只取0.2 mL置于含EDTA?2 K 的1.5 mL 離心管中，混勻，采用全自動(dòng)血液分析儀對(duì)白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血小板（PLT）、血紅蛋白（HGB）進(jìn)行測(cè)定。

2.8 小鼠血清中細(xì)胞免疫因子IL?2 和IL?10 的測(cè)定 血標(biāo)本凝集30 min，以1 000×g離心10 min 后吸取血清，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒步驟和方法進(jìn)行操作。使用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)，測(cè)定在450 nm 最大吸收波長(zhǎng)和570 nm 或630 nm參考波長(zhǎng)下得OD。繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，計(jì)算出白細(xì)胞介素2（IL?2）、白細(xì)胞介素10（IL?10）水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)分析 采用Graphpad Prism 5.0 軟件作圖并統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以（），多組間比較采用單因素方差分析（One?way ANOVE），P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠的生活狀態(tài) 對(duì)C57BL／6 小鼠觀察發(fā)現(xiàn)，接種后第1 周，各組小鼠活動(dòng)正常，無(wú)明顯變化，精神尚可，毛色無(wú)明顯變化。第2 周，空白組小鼠活躍，精神尚可，毛色正常，飲水、進(jìn)食量正常；模型組小鼠活動(dòng)明顯減弱，精神不振，飲水，進(jìn)食量明顯減少，毛色無(wú)光澤；消癌平組小鼠毛質(zhì)較粗糙，精神一般，飲水、進(jìn)食量減少，毛色無(wú)光澤；聯(lián)合給藥組活動(dòng)減弱，精神一般，飲水、進(jìn)食量減少，毛色無(wú)光澤。

3.2 桔梗湯聯(lián)用前后對(duì)小鼠體重的影響 由于小鼠飼養(yǎng)后期腫瘤增長(zhǎng)快速，其瘤子的變化超過體質(zhì)量變化，因此，為了更準(zhǔn)確衡量藥物干預(yù)對(duì)體質(zhì)量的影響，在連續(xù)給藥干預(yù)兩周后頸椎脫臼法處死小鼠，去除腫瘤組織后，對(duì)干預(yù)前后的小鼠稱定質(zhì)量，與正常組比較，模型組荷瘤小鼠體質(zhì)量下降（P＜0.01），消癌平治療后體質(zhì)量上升（P＜0.05），聯(lián)合桔梗湯后，聯(lián)合用藥組均上升（P＜0.05，P＜0.01），見圖1。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化（n＝10）

3.3 小鼠腫瘤體積及抑制率 本實(shí)驗(yàn)以治療藥物的抑瘤率＞60%為標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為藥物有效，本實(shí)驗(yàn)消癌平組抑瘤率大于60%的比例為18%，低劑量聯(lián)合組和中劑量聯(lián)合組抑瘤率大于60%的比例達(dá)到27%，而高劑量聯(lián)合組抑瘤率大于60%的比例可達(dá)到45%，見表1。連續(xù)給藥14 d 后，與模型組比較，消癌平組瘤體積并沒有減??；而與桔梗湯聯(lián)用后，小鼠瘤體積減少，與消癌平組或模型組相比較，高劑量組瘤體積均減?。≒＜0.05），見圖2，治療結(jié)束后剝離瘤組織，見圖3。該結(jié)果表明，隨著桔梗湯劑量的提高，桔梗湯可明顯提升消癌平藥物抗肺癌作用。

表1 各種藥物的抑瘤情況（n＝10）

圖2 各組小鼠腫瘤體積變化（n＝10）

圖3 各組小鼠腫瘤實(shí)物圖

3.4 桔梗湯聯(lián)用消癌平后對(duì)臟器指數(shù)的影響 由圖4 可以看出，荷瘤小鼠藥物前后的心、肝、肺及腎的臟器指數(shù)變化不大。然而對(duì)于臟器脾，研究發(fā)現(xiàn)，相比正常組，模型組荷瘤小鼠脾有一定程度肥大，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。經(jīng)消癌平治療，與正常組比較脾肥大（P＜0.01），經(jīng)桔梗湯配伍后，低劑量組和中劑量組肥大趨勢(shì)下降，但差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而高劑量桔梗湯與消癌平合用后，肥大現(xiàn)象下降趨勢(shì)明顯，與正常組比較無(wú)差異（P＞0.05）。

圖4 各組小鼠臟器指數(shù)變化（n＝10）

3.5 桔梗湯聯(lián)用消癌平后對(duì)血常規(guī)的影響 由圖5 可以看出，與正常組比較，荷瘤組小鼠WBC 上升（P＜0.05），其原因可能是荷瘤小鼠免疫力下降，感染所致產(chǎn)生炎癥。另外，與正常組小鼠比較，荷瘤組小鼠RBC 和HGB 均下降（P＜0.05，P＜0.01），消癌平組和配伍組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組比較，模型組小鼠PLT 有下降趨勢(shì)，但是差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但經(jīng)消癌平治療后，PLT 下降（P＜0.05）。而當(dāng)消癌平與桔梗湯聯(lián)用后，與消癌平組比較，低、中、高劑量組PLT 水平上升（P＜0.05）。

圖5 各組小鼠血常規(guī)變化（n＝10）

3.6 桔梗湯聯(lián)用消癌平后對(duì)細(xì)胞因子IL?2、IL?10 的影響 由圖6 可以看出，與正常組比較，模型組IL?10 水平升高（P＜0.05），而且經(jīng)消癌平治療后，與正常組比較，消癌平組IL?10 水平升高（P＜0.01），與模型組比較有升高趨勢(shì)。而桔梗湯與消癌平配伍合用后，與模型組比較，中、高劑量組IL?10 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。與消癌平組比較，不同劑量聯(lián)用組IL?10 水平均降低（P＜0.01）。另外桔梗湯單獨(dú)使用小鼠的IL?10 水平與模型組比較降低（P＜0.05），較消癌平組也降低（P＜0.01），結(jié)果進(jìn)一步表明，配伍組降低IL?10 水平可能主要與桔梗湯有關(guān)。另外，對(duì)于Il?2 水平來說，與正常組比較，荷瘤組相對(duì)較低，但均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，桔梗湯和消癌平合用后IL?2 水平與消癌平或模型組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6 各組小鼠IL?10、IL?2 水平變化（n＝10）

4 討論

肺癌是目前全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，當(dāng)前對(duì)癌癥患者最主要的治療手段仍以手術(shù)為主，術(shù)后康復(fù)仍需以化療及藥物治療。然而，患者術(shù)后耐受性較低，對(duì)癌癥的治療，化療藥物的治療效果卻并不盡人意，多藥耐藥（MDR）嚴(yán)重，除對(duì)病變部位作用外，還損害正常組織和免疫功能，預(yù)后較差，生活質(zhì)量指數(shù)下降嚴(yán)重，究其原因主要為藥物在體內(nèi)分布廣泛，靶向性差有關(guān)。因此，在保證其療效情況下，提升治療藥物的靶向性并盡可能減少不良反應(yīng)是當(dāng)前臨床研究中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。中藥的引經(jīng)作用與現(xiàn)代制藥理論的靶向作用十分類似，可通過抑制P?糖蛋白促進(jìn)藥物吸收［14?15］。因此，引經(jīng)化療是當(dāng)前在癌癥治療過程中提出的有效治療模式，根據(jù)腫瘤所在部位，服用相應(yīng)的引經(jīng)藥配合治療來增加療效等［7］。如鼻咽腫瘤用辛夷、白芷、蒼耳子引經(jīng)，腦腫瘤則僵蠶、全蝎以引藥入腦，肺癌用桔梗、白果，乳腺癌用瓜蔞、山慈菇，胃癌用半枝蓮、白術(shù)［16］。桔梗湯不僅為舟楫之劑，亦為治肺癰之方，因此，本文推測(cè)桔梗湯有引導(dǎo)增強(qiáng)消癌平抗癌藥物的抗癌作用。

機(jī)體的免疫狀態(tài)跟腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。脾是跟免疫密切相關(guān)的臟器，在許多研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤經(jīng)化療后存在脾肥大問題［17?18］。而本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Lewis 肺癌荷瘤組小鼠普遍存在脾臟肥大現(xiàn)象，在模型組中荷瘤小鼠脾肥大趨勢(shì)，且經(jīng)消癌平治療后肥大現(xiàn)象加劇，但是與桔梗湯聯(lián)合后脾肥大現(xiàn)象減輕。另外，輔助性T 細(xì)胞（Helper T cells，Th）對(duì)機(jī)體的特異性和非特異性免疫均具有重要調(diào)節(jié)作用，其分泌的細(xì)胞因子是抗腫瘤、促腫瘤的各環(huán)節(jié)的重要“信使”。Th 細(xì)胞主要分為Th1、Th2 兩種細(xì)胞，其中Th1 細(xì)胞參與細(xì)胞免疫，其分泌IL?2、IFN?γ 介導(dǎo)細(xì)胞免疫，主要發(fā)揮免疫防御作用；Th2 細(xì)胞分泌的IL?4、IL?10 介導(dǎo)體液免疫，在多種細(xì)胞組織中具有免疫刺激功效及免疫抑制作用，其中IL?10 通常在癌患者中呈高表達(dá)［19?20］。正常情況下，Th1 ／Th2 細(xì)胞因子處于動(dòng)態(tài)平衡，共同調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。因此，在癌癥治療過程中，維持Th1／Th2 細(xì)胞因子比例增加有利于腫瘤患者的恢復(fù)。而中藥在腫瘤治療通過維持Th1／Th2 平衡發(fā)揮著免疫調(diào)控作用［21?22］。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，荷瘤小鼠IL?2 水平有下降趨勢(shì)，但I(xiàn)L?2 水平整體上與正常組比較無(wú)明顯差異，而IL?10 的水平卻顯著升高。桔梗湯有提升IL?2 的作用趨勢(shì)，但是與荷瘤組比較，IL?2 水平差異不大；而桔梗湯與消癌平聯(lián)用后，IL?10 水平卻顯著降低，這表明桔梗湯可能通過抑制IL?10 水平維持Th1 和Th2 的平衡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，減少轉(zhuǎn)移。

腫瘤相關(guān)性貧血（cancer related anemia，CRA）為惡性腫瘤常見并發(fā)癥，約有30%～90% 的患者會(huì)出現(xiàn)貧血，且與腫瘤惡性程度、類型及治療方案有密切關(guān)系［23?24］。CRA 的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，可能與腫瘤組織浸潤(rùn)或者放化療藥物毒副作用造成的骨髓損傷、骨髓抑制相關(guān)。由腫瘤或其治療引起的貧血可致血液的攜氧能力降低，進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤缺氧，從而進(jìn)一步促使腫瘤通過克隆選擇和基因組改變?cè)黾訍盒赃M(jìn)展和攻擊性［25］。因此，糾正CRA 和PLT 減少，提升患者的生活質(zhì)量是當(dāng)前腫瘤臨床工作的重要工作。中西醫(yī)合用已經(jīng)證實(shí)可以緩解藥物化療所帶來的副作用，提升病人的幸福指數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中，與正常組比較，荷瘤組小鼠整個(gè)造血功能和免疫功能發(fā)生了變化，有紅細(xì)胞生成不足、血紅蛋白偏低以及血小板降低等營(yíng)養(yǎng)不良現(xiàn)象。這種現(xiàn)象提示可能與腫瘤細(xì)胞侵犯骨髓有關(guān)，從而正常的造血組織被替代，導(dǎo)致紅細(xì)胞生成不足、血紅蛋白偏低以及血小板生成減少等現(xiàn)象。另外本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，化療藥物消癌平可進(jìn)一步加劇PLT 的下降，而桔梗湯的聯(lián)合，盡管對(duì)RBC、HGB 水平僅有提升趨勢(shì)，但是卻顯著提升了PLT 的水平，改善了消癌平化療后產(chǎn)生的血小板減少的癥狀，表明桔梗湯可能協(xié)同消癌平提升免疫力作用進(jìn)而增強(qiáng)消癌平的抗肺癌作用。然而，桔梗湯是否也通過引經(jīng)提升消癌平藥效成分的血藥濃度進(jìn)而增強(qiáng)抗肺癌作用仍需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。