miR-146b在急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層組織中的表達(dá)水平研究

陳小玲 賴木勝

1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院深圳醫(yī)院,廣東省深圳市 518057； 2 深圳市福田區(qū)慢性病防治院

主動(dòng)脈夾層是一種常見的急性心臟大血管疾病，臨床發(fā)病率在0.03%，病情兇險(xiǎn)、病死率高[1]。該病是因主動(dòng)脈壁的中層強(qiáng)度顯著降低，在高速血流作用下，使主動(dòng)脈內(nèi)膜被撕裂并形成破口，此時(shí)血液流入破口，血管結(jié)構(gòu)被剝離，血腫不斷蔓延，并在內(nèi)膜、中外膜間隙形成一層假腔[2-3]。急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層發(fā)病急、進(jìn)展快，若未有效處理，其病死率超過80%[4]。當(dāng)前急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層影像學(xué)檢查較為容易，但其具體發(fā)病機(jī)制仍有諸多爭(zhēng)議，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷、編碼肌動(dòng)肌球蛋白特異性基因突變極有可能是疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。MicroRNAs(miRNAs)屬于非編碼小RNA，對(duì)大部分編碼蛋白質(zhì)mRNA轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)節(jié)，促使RNA沉默，多個(gè)報(bào)道表明miRAN參與了機(jī)體內(nèi)諸多生理及病理過程[5-7]。miR-146b在心臟內(nèi)有較高的含量，在心肌病變損害時(shí)升高明顯，而在主動(dòng)脈夾層病變組織內(nèi)的表達(dá)是否有不同仍需探討。因此本研究特建立急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層動(dòng)物模型，分析miR-146b的表達(dá)水平，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性SD大鼠15只，3周齡，單獨(dú)飼養(yǎng)，正常飲食、飲水，廣州中醫(yī)藥大學(xué)提供，飼養(yǎng)條件SPF級(jí)；體質(zhì)量54～68g，平均體質(zhì)量(60.05±1.14)g；按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求，專人對(duì)動(dòng)物進(jìn)行飼養(yǎng)，對(duì)其建立急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層動(dòng)物模型。

1.2 儀器設(shè)備 手術(shù)器械由上海金鐘醫(yī)療器械公司提供，JP2000-09心電監(jiān)護(hù)儀由科力威公司提供；Newport HT70型呼吸機(jī)由柯惠醫(yī)療公司提供，6-0 Prolene線由美國強(qiáng)生公司提供。

1.3 方法 實(shí)驗(yàn)大鼠于胸部正中做切口，心包懸吊，顯露升主動(dòng)脈，分離升動(dòng)脈壁中層間隙，形成假腔。切開內(nèi)層中膜、內(nèi)膜，連接主動(dòng)脈腔，人工滌綸血管縫合，于切口遠(yuǎn)端升主動(dòng)脈的中膜及內(nèi)膜進(jìn)行折疊，縫合到側(cè)壁，使血液進(jìn)入假腔。升主動(dòng)脈切口縫合，側(cè)壁鉗縫合后，加強(qiáng)縫合切口。制作夾層，并向遠(yuǎn)端發(fā)展，關(guān)閉切口，完成模型建立。建模后，觸診受鼠心跳，心跳持續(xù)超過72h，即為手術(shù)成功。模型建立完成后，符合《主動(dòng)脈疾病診斷和治療指南》[8]中急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層標(biāo)準(zhǔn)。所有實(shí)驗(yàn)大鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死，切除全部主動(dòng)脈，觀察夾層撕裂組織。采集外周血5ml，抗凝，室溫靜置60min，離心20min，3 000r/min，采集血清，置入無酶離心管，-80℃環(huán)境內(nèi)保存。術(shù)中切除主動(dòng)脈時(shí)，采集0.5cm×0.5cm×0.5cm主動(dòng)脈壁組織，以中性福爾馬林固定，-80℃環(huán)境內(nèi)保存。取血清250μl，轉(zhuǎn)移至新的無酶離心管內(nèi)，置入濃度為20nmol/L的cel-miR-39 10μl，混勻。美國Ambion公司生產(chǎn)的TRIzol試劑盒及配套試劑，按照說明書操作提取血清miRNA及主動(dòng)脈壁組織內(nèi)的miRNA，用Thermo-Fisher公司生產(chǎn)的核酸紫外線分析儀檢測(cè)RNA濃度。德國Eppendorf公司生產(chǎn)的PCR擴(kuò)增儀測(cè)定miR-146b的表達(dá)水平，反應(yīng)體系20μl，95℃變性10min，95℃ 5s，退火60℃ 50s，循環(huán)40個(gè)。比較不同風(fēng)險(xiǎn)程度急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層的血清、主動(dòng)脈夾層組織內(nèi)miR-146b的表達(dá)水平。

1.4 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) Stanford A型主動(dòng)脈夾層風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，按照主動(dòng)脈夾層嚴(yán)重程度臨床評(píng)分賦值表評(píng)價(jià)[9]，涉及突發(fā)性撕裂胸痛(有=5分，無=0分)、夾層累及度(0～3分)、重要臟器缺血程度(意識(shí)障礙=5分，腹痛、少尿=5分)，心功能分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)(Ⅲ級(jí)=3分，Ⅳ級(jí)=5分)，冠狀動(dòng)脈受累(0、3分)，主動(dòng)脈竇受累(0、2分)，主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全(2～4分)，心包或胸腔積液(3～5分)、夾層瘤體最大徑(3～5分)、休克(有=5分，無=0分)，高血壓(有=1分，無=0分)，左室舒張末徑(0、1分)，D-二聚體(0～1分)，雙上肢收縮壓差20mmHg(1mmHg=0.133kPa)以上或雙下肢收縮壓差10mmHg以上(有=4分，無=0分)，輕度：<20分；中度：20～30分；重度：>30分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。三組數(shù)據(jù)采用重復(fù)方差F檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層建立 急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層模型成功建立，肉眼見主動(dòng)脈形成夾層明顯，主動(dòng)脈中膜撕裂，見夾層撕裂內(nèi)膜片、真假腔形成。

2.2 疾病不同風(fēng)險(xiǎn)程度血清、主動(dòng)脈夾層組織內(nèi)miR-146b的表達(dá)水平比較 中度、重度風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物模型血清、主動(dòng)脈夾層組織內(nèi)miR-146b的表達(dá)水平高于輕度風(fēng)險(xiǎn)，重度風(fēng)險(xiǎn)高于中度風(fēng)險(xiǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 疾病不同風(fēng)險(xiǎn)程度血清、主動(dòng)脈夾層組織內(nèi)miR-146b的表達(dá)水平比較(2-△△Ct)

2.3 相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示，急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層大鼠外周血、主動(dòng)脈夾層組織內(nèi)miR-146b的表達(dá)水平與疾病風(fēng)險(xiǎn)程度呈正相關(guān)性(r=0.861，0.894，P<0.05)。

3 討論

主動(dòng)脈夾層起病危急，是臨床較為常見的心臟大血管疾病。若病變累及升主動(dòng)脈，其破裂風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，病情危重、致死率極高，搶救成功率明顯降低。一般根據(jù)夾層是否累及升主動(dòng)脈，將其分為Stanford A型與B型主動(dòng)脈夾層，前者起病突然、進(jìn)展快速，及早診斷、明確發(fā)病機(jī)制，是降低疾病病死率的關(guān)鍵[10]。目前對(duì)急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)仍未明確，其中miRNAs是否與疾病的形成相關(guān)，受到臨床重視。miRNAs是一類單鏈非編碼小分子RNA，長19～23個(gè)堿基，通過結(jié)合mRNA3’非編碼區(qū)，調(diào)整與基因表達(dá)相關(guān)的單核苷酸序列[11]。miR-146b是處于基因間的miRNA，保守性高，通過配對(duì)靶mRNA不完全堿基，對(duì)靶基因翻譯過程的抑制，影響疾病病理變化過程。通常心臟內(nèi)有較高水平的miR-146b，陳其敬等[12]表明急性ST段抬高型心肌梗死患者血漿內(nèi)miR-146b表達(dá)水平升高，可作為本病診斷及治療的新靶點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[13]表明體內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-146能增加膿毒癥小鼠臟器組織miR-146b水平，抑制炎性因子釋放，減輕臟器損傷。而miR-146表達(dá)在急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層中的意義卻缺乏相關(guān)報(bào)道。侯維納等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-146b表達(dá)升高與心肌損傷相關(guān)，測(cè)定其水平變化，有助于判斷病毒性心肌炎的病情及預(yù)后。本組研究中，急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層大鼠模型成功建立，肉眼見主動(dòng)脈形成夾層明顯，主動(dòng)脈中膜撕裂，中度、重度風(fēng)險(xiǎn)大鼠血清、主動(dòng)脈夾層組織內(nèi)miR-146b的表達(dá)水平均高于輕度風(fēng)險(xiǎn)，重度風(fēng)險(xiǎn)高于中度風(fēng)險(xiǎn)(P<0.05)。相關(guān)性分析，急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層動(dòng)物外周血、主動(dòng)脈夾層組織內(nèi)miR-146b的表達(dá)水平與疾病風(fēng)險(xiǎn)程度呈正相關(guān)性。結(jié)果表明病情越嚴(yán)重，血清及夾層組織內(nèi)的miR-146b表達(dá)水平越高，有望成為疾病風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)。但關(guān)于miR-146b在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制尚未明確，可能是miR-146b通過NFKB1、MMP16、TRAF6等靶基因，作用于疾病發(fā)生。其中NFKB1是一種特異性核蛋白，該蛋白過度激活，或促使動(dòng)脈粥樣硬化、免疫性炎癥反應(yīng)等血管疾病的發(fā)生，參與了炎癥機(jī)制、免疫應(yīng)答等多種病理變化過程，而炎癥反應(yīng)可能是主動(dòng)脈夾層發(fā)生的重

要原因[15]。MMP16通過活化細(xì)胞外特異性MMP2，使MMP1與TIMP-1之間的平衡性被破壞，導(dǎo)致主動(dòng)脈壁組織內(nèi)膠原彈性纖維被降解，中層囊性壞死，以此形成Stanford A型主動(dòng)脈夾層。

綜上所述，動(dòng)物模型的建立可為主動(dòng)脈夾層治療、預(yù)后判斷提供穩(wěn)定可靠的研究模型。急性Stanford A型主動(dòng)脈夾層動(dòng)物大鼠的外周血以及主動(dòng)脈壁組織內(nèi)miR-146b表達(dá)水平呈顯著增加趨勢(shì)，與主動(dòng)脈夾層風(fēng)險(xiǎn)、病情程度呈正相關(guān)性，病情越嚴(yán)重，miR-146b表達(dá)水平越高，有望成為疾病診斷、預(yù)后評(píng)估的新型分子標(biāo)志物。