禽流感病毒血凝與血凝抑制試驗(yàn)影響因素

蔣庭松 王紅梅 劉黔峰

摘要：血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)是監(jiān)測(cè)病毒感染的重要手段，可鑒定禽流感病毒的分離株，檢測(cè)禽血清中抗體或免疫抗體情況，是免疫效果評(píng)估及疫情監(jiān)測(cè)的重要科學(xué)方法。該文就血凝和血凝抑制試驗(yàn)操作過程中的材料準(zhǔn)備、操作注意事項(xiàng)及試驗(yàn)結(jié)果判斷等幾方面進(jìn)行闡述，以期避免試驗(yàn)中的類似問題，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：血凝與血凝抑制試驗(yàn);耗材;試驗(yàn)操作;結(jié)果判定

中圖分類號(hào)：S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2021.24.010

Analysis of Matters Needing Attention on Hemagglutination and Hemagglutination Inhibition Test of Avian Influenza Virus JIANG Tingsong，WANG Hongmei，LIU Qianfeng

（Animal Disease Prevention and Control Center of Guanyang County，Guilin Guangxi 541600，China）

Abstract：The hemagglutination （HA）and hemagglutination inhibition （HI）test is currently an important means of monitoring viral infections. This test can be used to identify isolates of avian influenza virus and detect antibodies or immunity in avian serum infected with avian influenza virus. Antibody status is an important scientific method for evaluating immune effects and epidemic detection. This article elaborates on the preparation of materials，precautions for the test operation，and the judgment of test results during the operation of the blood coagulation inhibition test，in order to help readers avoid similar problems in future tests，which will affect the test. The accuracy of the results.

Keywords ：blood coagulation and blood coagulation inhibition test，consumables used，test operation，result judgment

0引言

血凝（HA）是指有些病毒的血凝素使一些動(dòng)物的紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集。而血凝抑制（HI）則是抗體特異性地附著在HA分子的抗原位點(diǎn)上，干擾HA與紅細(xì)胞受體的結(jié)合，抑制HA凝集紅細(xì)胞的能力。這兩種方法應(yīng)用在病毒鑒定、抗原變異、抗體效價(jià)監(jiān)測(cè)以及病毒性疾病的診斷等方面，也是新城疫免疫效果以及禽流感疫情的主要監(jiān)測(cè)手段，操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)速度快，靈敏度較高，可批量化監(jiān)測(cè)。但操作過程中很容易受其他因素的影響，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，為保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，應(yīng)避免各種因素的影響。

1影響因素

血凝和血凝抑制試驗(yàn)影響因素主要有以下幾個(gè)方面：紅細(xì)胞、抗原配制、稀釋液（PBS）、試驗(yàn)溫度、試驗(yàn)耗材、加樣操作、稀釋操作、反應(yīng)時(shí)間、非特異凝集素等。

1.1紅細(xì)胞

紅細(xì)胞懸液濃度是影響試驗(yàn)準(zhǔn)確性的重要因素之一，不同個(gè)體對(duì)抗原敏感性不同。為避免雞只紅細(xì)胞發(fā)生自凝，在配制1%紅細(xì)胞懸液時(shí)，要求至少使用3只SPF（Specific Pathogen Free，無特定病原）級(jí)或無禽流感和新城疫抗體的健康成年公雞。

制備紅細(xì)胞懸液時(shí)，采集抗凝血液與阿氏液等體積混合，使用PBS緩沖液，以2 000r/min離心5～10 min，重復(fù)3次。一定要保證沖洗干凈血液中的白細(xì)胞，否則會(huì)增加非特異性反應(yīng)，影響試驗(yàn)結(jié)果。洗滌后按照1份紅細(xì)胞和99份緩沖液的比例配制成懸液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。但是配制好?%紅細(xì)胞懸液不能長(zhǎng)期保存，超過3 d后，需另行配制。若配置好的紅細(xì)胞懸液出現(xiàn)溶血，一定要重新配置，不能繼續(xù)使用[1]。

1.2抗原配制

1.2.14單位抗原配制

配制濃度必須準(zhǔn)確，抗原濃度高，抗體效價(jià)偏低;抗原濃度低，抗體效價(jià)偏高。配制4單位抗原時(shí)，配制人員需檢查血凝價(jià)是否準(zhǔn)確，然后進(jìn)行系列稀釋，使最終稀釋度為1：2、1：3、1：4、1：5、1：6和1：7。每一稀釋度取0.025 mL，加入PBS 0.025 mL，再加入1%雞紅細(xì)胞懸液0.025 mL，混勻。將血凝反應(yīng)板在室溫（約20 ℃）靜置40 min或4 ℃下靜置60 min。如果配制的抗原液為4單位，則1：4稀釋度為凝集終點(diǎn);如果高于4單位，1：5或1：6可能為終點(diǎn);如果低于4單位，1 ：2或1 ：3可能為終點(diǎn)。

1.2.24單位抗原標(biāo)定

在微量反應(yīng)板的第2～6孔均加入25 μL PBS或生理鹽水，吸取25 μL配制好的4單位抗原加入第1和第2孔。從第2孔倍比稀釋至第5孔，第5孔吸取25 μL棄之，第6孔加入稀釋液作為對(duì)照。每孔再加入25μL PBS或生理鹽水，然后再加入25 μL 1%雞紅細(xì)胞懸液。振蕩混勻，在室溫（20～25 ℃）下靜置20～30 min，觀察結(jié)果。對(duì)照孔紅細(xì)胞將呈明顯的小圓點(diǎn)沉到孔底。分裝標(biāo)定好的4單位抗原在離心管中，并做好標(biāo)記，避免抗原反復(fù)解凍，影響效價(jià)。

1.3稀釋液

試驗(yàn)應(yīng)選用合適的稀釋液種類，一般選擇PBS緩沖液或生理鹽水。另外，在進(jìn)行血凝試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)及洗滌紅血球時(shí)均需采用同一種稀釋液。稀釋液pH值也會(huì)對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生影響，如pH值為7.0時(shí)，紅細(xì)胞沉降最充分，圖形最清晰，HI效價(jià)也最高;當(dāng)pH值在5.8以下時(shí)，紅細(xì)胞容易產(chǎn)生自凝現(xiàn)象;pH值在7.8以上時(shí)，凝集圖形易解脫，也會(huì)造成試驗(yàn)誤差。因此，試驗(yàn)時(shí)建議稀釋液pH為7.0～7.2[2]。

1.4溫度

血凝和血凝抑制試驗(yàn)對(duì)溫度的要求較高，一般在20～25 ℃的室溫下靜置30～40 min即可，溫度過高或者過低均會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。從4～37 ℃，隨著溫度上升，HA與HI滴度會(huì)逐漸提高。但在37 ℃時(shí)，凝集的紅細(xì)胞易解脫，使得紅細(xì)胞的沉降速度過快，影響試驗(yàn)準(zhǔn)確性;4 ℃以下時(shí)，紅細(xì)胞易產(chǎn)生自凝，并且試驗(yàn)反應(yīng)的速度很慢。因此，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意保持合適的溫度。

1.5試驗(yàn)耗材

1.5.1微量反應(yīng)板

微量反應(yīng)板有90°V型板和110°V型板。90°V型板的角度比110°V型板的角度小，紅細(xì)胞沉降速度快，形成的凝集圖像清晰、判定結(jié)果相對(duì)容易。因此，血凝和血凝抑制試驗(yàn)時(shí)建議使用90°V型板。

1.5.2移液器

試驗(yàn)時(shí)移液器量程越精確，檢測(cè)結(jié)果就越準(zhǔn)確。HA與HI試驗(yàn)中加樣體積為25 μL，因此，與20～200 μL量程移液器相比，選擇10～100 μL量程移液器的檢測(cè)精確度更高。

1.6加樣、稀釋操作

倍比稀釋時(shí)，每孔的吹吸次數(shù)應(yīng)該一致，至少反復(fù)吹吸6次，以使其充分均勻混合，還應(yīng)注意盡量避免產(chǎn)生泡沫。加抗原及紅細(xì)胞時(shí)，不要讓吸頭碰到反應(yīng)板，以免產(chǎn)生污染，影響試驗(yàn)準(zhǔn)確度。加樣、稀釋時(shí)，應(yīng)高度集中注意，以免漏加、重復(fù)加樣等。

1.7反應(yīng)時(shí)間

血凝與血凝抑制試驗(yàn)應(yīng)在規(guī)定時(shí)間內(nèi)發(fā)生反應(yīng)。若反應(yīng)時(shí)間過短，細(xì)胞凝集不完全;反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，則容易出現(xiàn)洗脫。反應(yīng)時(shí)間超出正常時(shí)間10 min，會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞裂解，試驗(yàn)結(jié)果無說明意義[1]。

1.8非特異凝集素

有些禽類（如鴨、鵝等水禽及鴿）血清可能對(duì)雞紅細(xì)胞產(chǎn)生非特異性凝集，可先用待檢血清做HA試驗(yàn)。如待檢血清出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集，則說明存在非特異凝集因子，宜用雞紅細(xì)胞吸附待檢血清，具體方法為：每0.5 mL待檢血清中加入0.025 mL 50%雞紅細(xì)胞，輕搖后至少靜置30 min。離心2～5 min，收集上清液進(jìn)行HI試驗(yàn)?；蛘哂门c待檢血清同一宿主的1%紅細(xì)胞懸液進(jìn)行HA和HI試驗(yàn)。

2結(jié)果判定

除試驗(yàn)材料與操作技術(shù)等會(huì)對(duì)血凝和血凝抑制試驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生影響外，實(shí)驗(yàn)員對(duì)結(jié)果的判定也會(huì)影響準(zhǔn)確性。正常試驗(yàn)結(jié)果為病毒所在的對(duì)照孔發(fā)生完全凝集，而稀釋液對(duì)照孔無凝集，因此每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)立對(duì)照組[3]。對(duì)照結(jié)果正確的情況下，實(shí)驗(yàn)員可以傾斜反應(yīng)板，從背面觀察紅細(xì)胞的凝集情況，需控制觀察時(shí)間，當(dāng)陽(yáng)性血清反應(yīng)后就迅速觀察。當(dāng)出現(xiàn)整板無紅細(xì)胞凝集或者整板紅細(xì)胞凝集時(shí)，則無法進(jìn)行結(jié)果判斷，這時(shí)需查找原因，重新開展試驗(yàn)。

3結(jié)束語

血凝和血凝抑制試驗(yàn)是檢測(cè)禽流感等傳染性疾病非常有價(jià)值的方法，試驗(yàn)方便、快捷且檢測(cè)成本較低，一直被廣泛應(yīng)用，但其準(zhǔn)確性卻容易受到多種因素的影響。在試驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)員必須注重每個(gè)細(xì)節(jié)，從試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備到操作過程都應(yīng)該嚴(yán)格按照相關(guān)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，保證各試驗(yàn)環(huán)節(jié)的操作質(zhì)量，有效降低操作誤差。此外，在結(jié)果判定時(shí)也應(yīng)按照專業(yè)方法準(zhǔn)確判斷，為禽流感等傳染性疾病的預(yù)防和控制提供可靠參考。

參考文獻(xiàn)

[1]杜秋陽(yáng)，高沙沙，趙協(xié)，等.影響血凝和血凝抑制試驗(yàn)的因素及分析[J].河南畜牧獸醫(yī)（綜合版），2019，40（8）：39-40.

[2]王寧.淺談血凝和血凝抑制試驗(yàn)操作要點(diǎn)[J].中國(guó)畜禽種業(yè)，2020，16（3）：53.

[3]魯衛(wèi)紅.禽流感血凝和血凝抑制試驗(yàn)操作[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2020（17）：123.