毛竹內(nèi)生拮抗細(xì)菌篩選及其16S rDNA鑒定

摘 要：通過平板對(duì)峙法、濾紙片法、牛津杯法對(duì)6種食用菌病原菌的拮抗效果進(jìn)行了初篩和復(fù)篩，并觀察了細(xì)菌菌落表征性狀;進(jìn)行了16S rDNA序列分析。結(jié)果表明，初步篩選出了JL-B16、JL-A07、JL-B05、JL-B11、CT-B19、CT-B01、CT-B04-1、CT-A16等8株具有初步拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌;復(fù)篩出4株具有較好拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌，菌株編號(hào)分別是JL-B05、JL-B16、CT-A16、JL-A07;4株內(nèi)生拮抗細(xì)菌菌株分屬于2屬3種，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）和短桿菌屬（Brevibacterium）。該研究為內(nèi)生拮抗細(xì)菌開發(fā)、防病微生物菌劑的制備及應(yīng)用提供了資源。

關(guān)鍵詞：毛竹;內(nèi)生拮抗細(xì)菌;食用菌病原菌;篩選

中圖分類號(hào) S763 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2021）17-0034-05

Screening of Endophytic Antagonistic Bacteria in Phyllostachys edulis and Identification of 16S rDNA

YUAN Zongsheng

（Institute of Oceanography， Minjiang University， Fuzhou 350108， China）

Abstract： 82 endophytic strains of Phyllostachys edulis were screened and re-screened by plate-contrast， paper-filtered and oxford cup method. Through the preliminary screening of six edible fungus pathogens by plate-contrast method， 8 strains of JL-B16， JL-A07， JL-B05， JL-B11， CT-B19， CT-B01， CT-B04-1， CT-A16 were screened out. In addition， eight strains of endophytic bacteria were screened by the treatment methods of paper-filtered method and Oxford cup method. 4 strains of endophytic bacteria with good antagonistic effect on 6 kinds of edible fungus pathogens were selected. The strain numbers were JL-B05， JL-B16， CT-A16， JL-A07， The 4 strains of endophytic antagonistic bacteria were classified as Bacillus and Brevibacterium respectively. This study provides a basis for the development of endogenous antagonistic bacteria and provides resources for the preparation and application of antimicrobial agents.

Key words： Phyllostachys edulis; Endophytic Antagonistic Bacteria; Pathogens of Edible Fungi; Screening

植物內(nèi)生細(xì)菌指其生活史的一定階段或全部階段均生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部， 并且與植物建立了和諧聯(lián)合關(guān)系的細(xì)菌[1]。植物內(nèi)生細(xì)菌因其生態(tài)學(xué)優(yōu)勢(shì)，能在植物體內(nèi)長(zhǎng)期定殖、傳導(dǎo)，且不易受環(huán)境條件的影響，內(nèi)生細(xì)菌通過自身產(chǎn)生代謝產(chǎn)物或借助信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生重要影響，促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)宿主植物抗性抵抗疾病以及不良環(huán)境及提高植物修復(fù)能力，是非常難得的天然生物資源[2-7]，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有良好的研究和開發(fā)潛力。例如，Microbacterium具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用[8]，Bacillus具有良好的生防潛力[9]，Sphingomonas對(duì)植物有自我修復(fù)功能[10]等。內(nèi)生菌對(duì)植物病害的防病機(jī)理主要是通過4個(gè)方面：一是產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)，在低濃度下可以對(duì)微生物產(chǎn)生影響[11];二是產(chǎn)生水解酶，可降解某些致病因子[12];三是產(chǎn)生生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[13]，內(nèi)生菌也可以產(chǎn)生植物生物激素類物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng);四是內(nèi)生菌與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使病原菌得不到必要的營(yíng)養(yǎng)供給而死亡以及增強(qiáng)宿主植物的抵抗力以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等途徑抑制病原菌的生長(zhǎng)[14]。因此，對(duì)具有防病等功能內(nèi)生細(xì)菌資源的研究具有重大意義。

本研究選取從福建省3個(gè)毛竹中心產(chǎn)區(qū)[15] I度毛竹的根、鞭、桿、葉部組織分離的82株可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌[16-17]，研究?jī)?nèi)生細(xì)菌對(duì)主要食用菌病害的拮抗作用，并篩選出具有較強(qiáng)拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌菌株，為拮抗內(nèi)生細(xì)菌資源的合理開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1.1.1 內(nèi)生細(xì)菌 82株毛竹內(nèi)生細(xì)菌，分別從福建省武夷山（武夷山市星村鎮(zhèn)）、將樂（將樂縣龍棲山自然保護(hù)區(qū)）、長(zhǎng)?。ㄩL(zhǎng)汀縣四都鎮(zhèn)）3個(gè)毛竹中心產(chǎn)區(qū)的I度毛竹根、鞭、桿和葉等組織中分離取得，并保存于福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心。

1.1.2 食用菌病原菌 （1）油疤病菌（Scytalidium lignicola）;（2）蛛網(wǎng)病菌（Cladobotryum semicirculare）;（3）粘菌病菌（Comatrichapulchell（C.Bab）Rost sp.）;（4）綠色木霉（Trichoderma pleuroticola）;（5）青霉（Penicillium cyclopium）;（6）黃色霉菌（Disporotrichum dimorphosporum）。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑 內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，Nacl 5g，瓊脂18g，水1000mL，pH7.0～7.2;12l℃滅菌30min（液體培養(yǎng)基不加瓊脂）。病原菌培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，瓊脂15～20g，蒸餾水1000mL，pH自然;12l℃滅菌30min。瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂粉20g，蒸餾水1000mL，pH自然;12l℃滅菌30min。

內(nèi)生細(xì)菌DNA提取、16S rDNA片段擴(kuò)增所用的引物、Marker、dNTPs、Buffer、溶菌酶等試劑為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的初篩 選取已分離純化的內(nèi)生細(xì)菌，通過平板對(duì)峙法對(duì)6種食用菌病原菌（油疤病菌、蛛網(wǎng)病菌、粘菌病菌、綠色木霉、青霉、黃色霉菌）進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，篩選具有較好拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌。

平板對(duì)峙法：將溶化好的PDA培養(yǎng)基冷卻到55℃左右，倒平板，平板冷凝后，在平板中央接入病原菌瓊脂塊，在距中央2.0～2.5cm處接入內(nèi)生細(xì)菌菌株，以單獨(dú)接種病原菌瓊脂塊為對(duì)照，然后將平板置于培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，觀察有無(wú)抑菌圈并判定拮抗作用的強(qiáng)弱。

拮抗作用強(qiáng)弱的判定：“+++”表示強(qiáng)抑菌效果，內(nèi)生細(xì)菌菌落周圍有明顯的抑菌圈;“++”表示中等抑菌效果，內(nèi)生細(xì)菌菌落周圍有抑菌圈，細(xì)菌與病原菌或食用菌對(duì)峙生長(zhǎng)，病原菌不能覆蓋內(nèi)生細(xì)菌菌落繼續(xù)生長(zhǎng);“+”表示較弱抑菌效果，但病原菌或食用菌能覆蓋細(xì)菌菌落繼續(xù)生長(zhǎng);“-”表示無(wú)抑菌效果;內(nèi)生細(xì)菌對(duì)病原菌或食用菌的生長(zhǎng)無(wú)任何影響。

1.4 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的復(fù)篩 選取平板初篩過程中對(duì)食用菌病原菌具有拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌，通過平板對(duì)峙法、濾紙片法、牛津杯法對(duì)食用菌病原菌的拮抗效果進(jìn)行復(fù)篩。

將平板初篩過程中具有一定拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌接種于裝液量為100mL的NA液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，每個(gè)處理3次重復(fù)。在28℃，180r/min的條件下培養(yǎng)72h，通過離心（4℃，10000r/min，15min）取得上清液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后將所得濾液用于濾紙片法和牛津杯法的測(cè)定。

濾紙片法：溶化好的PDA培養(yǎng)基冷卻到55℃左右，倒平板，平板冷凝后，將活化好的病原菌用無(wú)菌水稀釋后涂布到培養(yǎng)基上，在待檢測(cè)平板上接上蘸有內(nèi)生菌過濾液的濾紙片（直徑10mm），然后將平板置于培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，觀察有無(wú)抑菌圈并測(cè)量抑菌圈直徑的大小。

牛津杯法：將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿10mL，待其凝固（下層）。此外，將融化的PDA培養(yǎng)基冷卻到50℃左右混入病原菌菌液，將混有菌液的培養(yǎng)基15mL加到已凝固的培養(yǎng)基上待凝固（上層）。以無(wú)菌操作在培養(yǎng)基表面直接垂直放上牛津杯（內(nèi)徑6mm、外徑8mm、高10mm），輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙，在杯中加入內(nèi)生細(xì)菌過濾液，加滿后將平板置于培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)，觀察有無(wú)抑菌圈并測(cè)量抑菌圈直徑的大小。

1.5 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的16S rDNA序列分析 將內(nèi)生拮抗細(xì)菌在NA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，用細(xì)菌基因組提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取DNA。16S rDNA基因序列擴(kuò)增采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。

（1）反應(yīng)體系：25μL反應(yīng)液中包含10×PCR Buffer 2.5μL，基因組DNA 0.5μL，10mmol dNTP 0.5μL，20umol引物Pf 0.5μL，20umol引物Pr 0.5μL，Taq酶（5U·uL–L）0.5μL，ddH2O2補(bǔ)足25μL。以去離子水為空白對(duì)照。

（2）PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4min;94℃變性30s，52℃退火45s，72℃延伸1.5min，35個(gè)循環(huán);72℃最后延伸8min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)定后的DNA序列采用http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/中Blast軟件進(jìn)行序列同源序列檢索，進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的分類地位。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)繪圖用Excel，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用DPS（V7.05）的相應(yīng)分析功能進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的初篩 采用平板對(duì)峙法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌對(duì)食用菌病原菌的拮抗效果，82株內(nèi)生細(xì)菌中有8株內(nèi)生細(xì)菌表現(xiàn)出較好的拮抗效果，菌株分別為JL-B16、JL-A07、JL-B05、JL-B11、CT-B19、CT-B01、CT-B04-1、CT-A16。其中根部?jī)?nèi)生細(xì)菌為2株，占全部?jī)?nèi)生細(xì)菌（82株）的2.44%;鞭部?jī)?nèi)生細(xì)菌為6株，占全部?jī)?nèi)生細(xì)菌（82株）的7.32%。其中內(nèi)生細(xì)菌菌株JL-B05、JL-B16、CT-A16、JL-A07對(duì)6種食用菌病原菌均表現(xiàn)出較好的拮抗效果。

注：“-”表示沒有抑菌效果;“+”表示弱抑菌效果;“++”表示中等抑菌效果;“+++”表示強(qiáng)抑菌效果。

2.2 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的復(fù)篩 通過濾紙片法、牛津杯法等處理方法對(duì)平板初步篩選出的8株內(nèi)生細(xì)菌的拮抗效果進(jìn)行復(fù)篩，8株內(nèi)生細(xì)菌中，內(nèi)生細(xì)菌JL-B05、JL-B16、CT-A16、JL-A07均表現(xiàn)出了對(duì)相應(yīng)食用菌病原菌具有較好的拮抗作用，效果明顯。

濾紙片法和牛津杯法測(cè)定時(shí)采用內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵過濾液對(duì)食用菌病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌影響。從抑菌強(qiáng)度上來看，濾紙片法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌JL-B11、CT-B01、CT-B04-1及CT-B19對(duì)食用菌病原菌的抑菌效果較弱。牛津杯法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌JL-B11、CT-B04-1對(duì)食用菌病原菌的抑菌效果較弱。牛津杯法測(cè)定CT-B01對(duì)蛛網(wǎng)病菌和油疤病菌的抑菌效果明顯;牛津杯法測(cè)定CT-B19對(duì)油疤病菌和黃色霉菌的抑菌效果明顯（詳見表2）。

通過以上分析可以看出，通過濾紙片法和牛津杯法測(cè)定8株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)食用菌病原菌的拮抗效果，內(nèi)生細(xì)菌JL-B05、JL-B16、CT-A16、JL-A07拮抗效果明顯，為后續(xù)內(nèi)生拮抗細(xì)菌抗病機(jī)理研究及防病微生物菌劑的制備奠定了基礎(chǔ)。

2.3 內(nèi)生拮抗細(xì)菌的16S rDNA序列分析 經(jīng)過克隆測(cè)序獲得了4株內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列，通過http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/中Blast軟件對(duì)4株內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行相似性比對(duì)，鑒定細(xì)菌的種類。發(fā)現(xiàn)4株分離物與已知分類地位菌種的16S rDNA 序列相似性達(dá)到了99%～100%，如表3所示。

3 小結(jié)與討論

本研究利用平板對(duì)峙法、濾紙片法、牛津杯法等方法對(duì)82株毛竹內(nèi)生細(xì)菌對(duì)主要食用菌病原菌的拮抗效果進(jìn)行了初篩和復(fù)篩。通過平板對(duì)峙法對(duì)食用菌病原菌的初步篩選，篩選出了JL-B16、JL-A07、JL-B05、JL-B11、CT-B19、CT-B01、CT-B04-1、CT-A16等8株對(duì)6種食用菌病原菌具有初步拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌。另外通過濾紙片法、牛津杯法對(duì)8株具有初步拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了復(fù)篩，篩選出了對(duì)主要食用菌病原菌具有較好拮抗效果的4株內(nèi)生細(xì)菌，菌株編號(hào)分別是 JL-B05、JL-B16、CT-A16、JL-A07，通過細(xì)菌菌落表征性狀觀察和16S rDNA序列分析，4株內(nèi)生拮抗細(xì)菌菌株分屬于2屬3種，分別為芽孢桿菌屬（Bacillus）和短桿菌屬（Brevibacterium）。

本研究篩選出了對(duì)主要食用菌病原菌具有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌，同時(shí)表明毛竹具有功能性極其豐富的內(nèi)生細(xì)菌資源，為內(nèi)生細(xì)菌的生物活性物質(zhì)篩選和開發(fā)提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)，對(duì)防病微生物菌劑的制備及應(yīng)用提供了資源。

基金項(xiàng)目：福建省林業(yè)科技項(xiàng)目（2021FKJ07）;閩江學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目（MYK19027）;福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021I0043）。

作者簡(jiǎn)介：袁宗勝（1976—），男，高級(jí)工程師，從事森林培育及微生物相關(guān)領(lǐng)域研究工作。? 收稿日期：2021-06-01

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（責(zé)編：王慧晴）