miR-194-5p靶向TSPAN1基因?qū)ζつw鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響

郜亮 賈振宇（長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院皮膚性病科，長(zhǎng)治046000）

皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cell carci‐noma，CSCC）是一種表皮角質(zhì)形成細(xì)胞衍生的皮膚腫瘤，是世界上最惡性的皮膚腫瘤之一［1］。主要表現(xiàn)為一系列的進(jìn)展性惡性腫瘤，從前體光化角質(zhì)病到原位鱗狀細(xì)胞癌、浸潤(rùn)性鱗狀細(xì)胞癌，最后到轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌［2］。TSPAN1定位于人類染色體1p34.1，屬于四跨膜蛋白超家族新成員，在多種腫瘤組織及細(xì)胞中均有表達(dá)，其機(jī)制可能是通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞分裂的信號(hào)或引起細(xì)胞異向分化或去分化，導(dǎo)致癌組織細(xì)胞增殖或血管生成等，參與癌變和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程［3］。CHEN等［4］發(fā)現(xiàn)抑制TSPAN1基因表達(dá)能夠減少CSCC的增殖、遷移和浸潤(rùn)等惡性生物學(xué)行為。本研究從miRNA靶向基因?qū)膊∵M(jìn)展進(jìn)行調(diào)控的角度出發(fā)，探討可能影響TSPAN1表達(dá)的miRNA，選中miR-194-5p作為研究點(diǎn)。

miR-194-5p參與乳腺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌等多種腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，其上調(diào)往往能夠抑制癌細(xì)胞的遷移與侵襲等［5-9］。WANG等［10］曾證明miR-194-5p與TSPAN1之間的靶向關(guān)系，闡明miR-194-5p作為上游因子調(diào)控TSPAN1表達(dá)，從而對(duì)癌細(xì)胞產(chǎn)生影響。但是其在CSCC中的作用并未完全明確。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上提出假設(shè)：miR-194-5p能夠靶向抑制TSPAN1的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控CSCC的進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源與試劑CSCC A431細(xì)胞系購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)；蘇木精-伊紅染色試劑盒（G1120）、DAB（DA1010）、RIPA裂解液（R0010）、DEME高糖型培養(yǎng)基（11995）購(gòu)自索萊寶科技有限公司；兔抗人一抗TSPAN1（ab254730）、Bax（ab32503）、c-myc（ab32072）、Bcl-2（ab32124）、羊 抗 兔IgG二 抗（ab150077）和Annexin V-FITC試劑盒（ab14085）均購(gòu)自Abcam公司；光鏡（37XF-PC）購(gòu)自上海光學(xué)儀器廠；RNA提取試劑盒（10296010）、Lipofectamine2000（11668027）、無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEMI（31985-070）購(gòu)自Invitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒（RR014A）購(gòu)自寶日醫(yī)生物科技公司；qRT-PCR引物序列由華大基因合成；PCR試劑盒（KR011A1）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；BCA試劑盒（23227）購(gòu)自Thermo Fisher；ECL試劑盒（36208ES60）購(gòu)自Amersham Life Sciences公司；雙熒光素酶試劑盒（E2920）購(gòu)自Pro‐mega；細(xì)胞轉(zhuǎn)染序列均購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；MTT溶液（GL0247）購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司。

1.1.2 主要儀器酶標(biāo)儀（SP-Max 3500FL）購(gòu)自上海閃譜生物科技有限公司；24孔板8 μm Transwell小 室（3413）購(gòu) 自Corning公 司；Matrigel基 質(zhì) 膠（40111ES08）購(gòu)自Sigma公司；倒置顯微鏡（YKDZ-55）購(gòu)自上海永科光學(xué)儀器有限公司；流式細(xì)胞儀（CytoFLEX）購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特。

1.2 方法

1.2.1 研究對(duì)象收集我院2017年至2019年根據(jù)臨床表現(xiàn)及組織病理明確診斷的患者病變組織及正常皮膚組織：CSCC共82例（男49例，女33例），作為Model組，年齡38~79歲，平均（62.15±11.47）歲。CSCC組中高分化38例，中分化25例，低分化19例。手術(shù)前均未進(jìn)行過(guò)放療、化療及其他特殊治療，且無(wú)免疫性疾病及系統(tǒng)性疾病。所有CSCC組織及正常皮膚組織樣本均切成小塊后迅速置于凍存管中液氮保存，后移至-80℃冰箱。該實(shí)驗(yàn)所有患者均對(duì)實(shí)驗(yàn)知情同意，并簽署知情同意書，且通過(guò)我院臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)同意。

1.2.2 HE染色所有的標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，HE染色步驟：二甲苯脫蠟2次每次15 min；無(wú)水乙醇5 min 2次；90%乙醇5 min；80%乙醇5 min；水洗5 min。蘇木素染色：蘇木素液染5 min，水洗至變藍(lán)；1%鹽酸乙醇快速分化，水洗至變藍(lán)。脫水、透明、封片：80%乙醇5 min；90%乙醇5 min；無(wú)水乙醇5 min 2次；二甲苯15 min 2次；中性樹膠封片。HE染色光鏡病理組織學(xué)檢查并攝片，觀察各組顯色情況。在形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)上，在400倍放大倍數(shù)下取不同組別，并隨機(jī)采集圖像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)TSPAN1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率取10%的甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋連續(xù)切片厚4 μm。將組織切片放入60℃溫箱烘1 h，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水。高溫高壓下用檸檬酸修復(fù)，1 800 W加熱切片，噴氣后改為1 000 W繼續(xù)加熱2 min，關(guān)掉電磁爐后，自然冷卻10 min，用自來(lái)水冷卻10 min，開高壓鍋蓋，逐漸用自來(lái)水冷卻切片。0.2 mol/L PBS溶液（pH7.4）洗5 min×3次，擦干切片，滴加入兔抗人TSPAN1多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，0.2 mol/L PBS溶液（pH7.4）洗5 min，共3次；擦干切片后，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育15 min；配制顯色劑，將DAB的A、B、C試劑各l滴加入1 ml蒸餾水中，混勻，置4℃冰箱保存；0.2 mol/L PBS溶液（pH7.4）洗5 min，共3次；DAB顯色，室溫暗室保存8 min；用自來(lái)水充分沖洗后，蘇木紫浸染、脫水、透明、封片，光鏡觀察。陰性細(xì)胞核為藍(lán)色或淺藍(lán)色，陽(yáng)性細(xì)胞核為黃色或棕黃色，采用日本Nikon圖像分析軟件進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，每張切片選取3個(gè)等面積不重復(fù)的視野（200倍），計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)采用RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，鑒定RNA純度和完整性后，采用PrimeScript RT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)miR-194-5p、TSPAN1、c-myc、Bcl-2、Bax、內(nèi)參U6和GAPDH引物，交由華大基因合成（表1）。按PCR試劑盒操作步驟進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。miR-194-5p的相對(duì)表達(dá)水平以U6為內(nèi)參，TSPAN1、c-myc、Bcl-2、Bax相對(duì)表達(dá)水平以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法檢測(cè)各組基因的表達(dá)量并進(jìn)行比較。（該實(shí)驗(yàn)同樣適用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.5 Western blot檢測(cè)各組蛋白表達(dá)水平分組收集轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，以12 000 r/min、4℃離心20 min，取上清液分裝備用。按照BCA試劑盒說(shuō)明書操作測(cè)定總蛋白含量后分裝，置于-80℃冰箱冷凍，待用。分別取各組50 μg蛋白，加入蛋白質(zhì)變性劑后行SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、過(guò)夜后，PBST漂洗（5 min×3次），分別加入一抗兔抗人TSPAN1、Bax、c-myc、Bcl-2抗體。37℃孵育2 h，PBST漂洗（10 min×3次），加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育2 h，PBST充分漂洗（10 min×3次）后，化學(xué)熒光法顯色，使用Image J灰度分析軟件對(duì)Western blot檢測(cè)結(jié)果作半定量分析。以GAPDH作內(nèi)參，以目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶的灰度值之比作為蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)生物學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站Targetscan分析TSPAN1的靶向miRNA，人工合成TSPAN1 3'UTR基因片段利用內(nèi)切酶位點(diǎn)SpeⅠ和HindⅢ引入pMIR-reporter中，在TSPAN1野生型上設(shè)計(jì)種子序列的互補(bǔ)序列突變位點(diǎn)，通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切后使用T4 DNA連接酶將目的片段插入pMIR-reporter報(bào)告質(zhì)粒。將測(cè)序正確的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒WT、MUT分別與miR-194-5p共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞HEK-293T。轉(zhuǎn)染48 h后收集并裂解細(xì)胞，分別使用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染將人正常皮膚細(xì)胞和人A431細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于DMEM（高糖型）完全培養(yǎng)基（含100 U/ml青霉素、10%小牛血清、100 μg/ml鏈霉素）中，置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每1~2 d換液1次，細(xì)胞為單層貼壁生長(zhǎng)，到長(zhǎng)滿瓶底時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化為單個(gè)細(xì)胞，獲取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。

選擇第3代細(xì)胞分為7組：Normal組，Blank組（空白對(duì)照組）、negative control（NC）組（陰性對(duì)照）、miR-194-5p agomir組（轉(zhuǎn)染miR-194-5p agomir）、miR-194-5p antagomir組（轉(zhuǎn)染miR-194-5p antagomir）、shRNA-TSPAN1組（轉(zhuǎn)染shRNA-TSPAN1）、miR-194-5p agomir+shRNA-TSPAN1組（轉(zhuǎn)染miR-194-5p agomir和shRNA-TSPAN1）。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度生長(zhǎng)至30%~50%，按li‐pofectamin 2000說(shuō)明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.8 MTT法檢驗(yàn)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后增殖能力變化取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)基體積200 μl。細(xì)胞貼壁24 h，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24 h、48 h及72 h，每孔加20 μl MTT溶液（5 mg/ml），37℃孵育4 h，棄上清液，每孔加150 μl DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)490 nm各孔光吸收值OD，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均值，記錄結(jié)果。

1.2.9 Transwell檢測(cè)取各組侵襲轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞于無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓12 h后消化，PBS沖洗2遍，用含10 g/L BSA（牛血清白蛋白）的無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEMI重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml。實(shí)驗(yàn)采用24孔板8 μm Transwell小室，每組3個(gè)小室，實(shí)驗(yàn)前在小室鋪50 μl Matrigel基質(zhì)膠，48 h后在Transwell小室上室分別加入各組細(xì)胞的單細(xì)胞懸液200 μl（4×104個(gè)細(xì)胞），而小室下室加入650 μl含10% FBS的G-DMEM培 養(yǎng) 液，置 于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。取出小室后，PBS淋洗，后置于甲醇溶液中，室溫下固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽小心擦去微孔膜上層細(xì)胞，于倒置光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，隨機(jī)選取4個(gè)視野，計(jì)算穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.10 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率Annexin VFITC/PI雙標(biāo)染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，將處理好的細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS溶液洗滌2次后離心將細(xì)胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液中，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混合液，避光室溫反應(yīng)15 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液，用流式細(xì)胞儀以激發(fā)波長(zhǎng)488 nm檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（USA）處理，計(jì)量資料采用±s的形式表示，兩組間比較為t檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，正常皮膚組織基底層和角質(zhì)層有明顯分層，細(xì)胞核完整清晰，而CSCC組織中組織切片表皮層明顯增厚，基底層與角質(zhì)層之間的分層界限基本消失，角質(zhì)層細(xì)胞角化不完全，細(xì)胞核形態(tài)也發(fā)生改變（圖1）。

圖1 正常皮膚組織和CSCC組織病理學(xué)觀察Fig.1 Histopathological view of normal skin tissue and CSCC tissue

2.2 CSCC組織中TSPAN1表達(dá)增高與正常皮膚組織相比［陽(yáng)性率（14.75±2.14）%］，CSCC組織中TSPAN1細(xì)胞陽(yáng)性率為（78.47±6.51）%，其表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05）。提示TSPAN1可能參與了CSCC的進(jìn)展。見(jiàn)圖2。

圖2 CSCC組織中TSPAN1表達(dá)增強(qiáng)Fig.2 TSPAN1 expression was up-regulated in CSCC tissue

2.3 TSPAN1為miR-194-5p的靶基因生物學(xué)預(yù)測(cè)網(wǎng)站Targetscan及microRNA org發(fā)現(xiàn)miR-194-5p、miR-27a、miR-27b為TSPAN1的共有靶miRNA（圖3A），檢測(cè)Normal組織及CSCC組織中miR-194-5p、miR-27a、miR-27b的表達(dá)發(fā)現(xiàn)miR-194-5p在CSCC組織中表達(dá)降低最明顯（圖3B），表明miR-194-5p可能在CSCC進(jìn)展中扮演重要角色，因此選擇miR-194-5p進(jìn)行后續(xù)研究，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-194-5p和TSPAN1之間的靶向關(guān)系（圖3C）。

圖3 miR-194-5p在CSCC組織中表達(dá)降低且TSPAN1為miR-194-5p的靶基因Fig.3 miR-194-5p expression was down-regulated in CSCC tissue and TSPAN1 is a target of miR-194-5p

2.4 激活miR-194-5p或抑制TSPAN1的表達(dá)抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化檢測(cè)各組細(xì)胞miR-194-5p、TSPAN1以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果表明，相對(duì)于Blank組，激活miR-194-5p或沉默TSPAN1能夠上調(diào)E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)Vimentin及N-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)（均P<0.05）。抑制miR-194-5p則會(huì)上調(diào)Vimentin及N-cadherin的mRNA和蛋白 表 達(dá)，下調(diào)E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)（均P<0.05）。NC組和Blank組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。見(jiàn)圖4。提示干預(yù)miR-194-5p或TSPAN1的表達(dá)能夠影響CSCC細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

2.5 激活miR-194-5p或抑制TSPAN1的表達(dá)抑制A431細(xì)胞增殖活力qRT-PCR、Western blot及MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于Normal組，其余組中Bax表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)增高，細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)（均P<0.05）。相對(duì)于Blank組，激活miR-194-5p表達(dá)或沉默TSPAN1能夠促進(jìn)Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)，抑制細(xì)胞活力的增強(qiáng)，且miR-194-5p agomir+shRNATSPAN1組效果更明顯（均P<0.05）。抑制miR-194-5p表達(dá)則相反（均P<0.05）。NC組和Blank組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。見(jiàn)圖5。提示干預(yù)miR-194-5p或TSPAN1表達(dá)能夠影響A431細(xì)胞增殖活力，并影響凋亡相關(guān)因子表達(dá)。

圖5 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2表達(dá)及增殖活力檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Results of expressions of Bax，Bcl-2 and prolifera?tion activity

2.6 激活miR-194-5p或抑制TSPAN1的表達(dá)抑制A431細(xì)胞侵襲Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲過(guò)膜情況，結(jié)果顯示，相對(duì)于Normal組，其余各組細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)（均P<0.05）。相對(duì)于Blank組，激活miR-194-5p表達(dá)或抑制TSPAN1表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖侵襲過(guò)膜的數(shù)量，且二者聯(lián)合作用效果更明顯（均P<0.05）。抑制miR-194-5p表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞侵襲（均P<0.05），NC組和Blank組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖6。提示干預(yù)miR-194-5p或TSPAN1的表達(dá)能夠調(diào)控A431細(xì)胞的侵襲。

圖6 過(guò)表達(dá)miR-194-5p或抑制TSPAN1能夠抑制A431細(xì)胞侵襲Fig.6 Overexpression of miR-194-5p or inhibition of TSPAN1 could inhibit invasion of A431 cells

2.7 激活miR-194-5p或抑制TSPAN1的表達(dá)促進(jìn)A431細(xì)胞凋亡Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)染色法檢測(cè)結(jié)果顯示，與Normal組相比，其他各組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.05）。相對(duì)于Blank組，激活miR-194-5p表達(dá)或抑制TSPAN1表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且聯(lián)合作用效果更明顯（均P<0.05）。抑制miR-194-5p表達(dá)能夠抑制細(xì)胞凋亡（均P<0.05）。NC組和Blank組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖7。提示干預(yù)miR-194-5p或TSPAN1表達(dá)能夠影響A431細(xì)胞的凋亡。

圖7 過(guò)表達(dá)miR-194-5p或抑制TSPAN1能夠誘導(dǎo)A431細(xì)胞凋亡Fig.7 Overexpression of miR-194-5p or inhibition of TSPAN1 could induce apoptosis of A431 cells

3 討論

CSCC是一種常見(jiàn)的皮膚癌，在陽(yáng)光照射下表現(xiàn)為鱗狀、紅色或出血性病變，紫外線照射、皮膚白皙和免疫抑制均是其發(fā)病原因，侵襲性CSCC以高發(fā)病率和高死亡率為特征［11-12］。miRNAs是一種內(nèi)源性、非編碼的微小RNA，長(zhǎng)度為19~25個(gè)核苷酸，參與轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)調(diào)控，miRNA的表達(dá)在宮頸癌、肺癌、胃癌等多種癌癥中發(fā)揮重要作用［13-16］。其可通過(guò)調(diào)節(jié)一個(gè)或多個(gè)靶基因發(fā)揮腫瘤抑制或促進(jìn)作用［17-18］。

目前已有大量關(guān)于miRNA影響CSCC的研究，例如LOHCHAROENKAL等［19］發(fā)現(xiàn)miR-203通過(guò)靶向調(diào)節(jié)c-myc的表達(dá)在CSCC中起抑癌作用；XU等［20］發(fā)現(xiàn)miR-125b通過(guò)靶向調(diào)節(jié)MMP13對(duì)CSCC起抑制作用。而作為常見(jiàn)的抑癌miRNA，miR-194-5p以往也被證實(shí)在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌miRNA的作用，但目前未見(jiàn)miR-194-5p影響CSCC的報(bào)道［5-9］。本研究通過(guò)檢測(cè)CSCC組織中miR-194-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在CSCC中表達(dá)下調(diào)。miRNA通常會(huì)與靶基因結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄或促進(jìn)mRNA降解，進(jìn)而參與多種疾病的進(jìn)展，這一現(xiàn)象也被稱為RNAi［21］。本研究希望進(jìn)一步明確miR-194-5p可能參與CSCC進(jìn)展的機(jī)制并發(fā)現(xiàn)其與TSPAN1存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。

據(jù)報(bào)道，TSPAN1可加速多種癌癥的進(jìn)展，特別是胃癌、結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)惡性腫瘤，但關(guān)于TSPAN1對(duì)CSCC的影響目前未見(jiàn)報(bào)道［22-23］。通常TSPAN1在癌癥組織中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，抑制其表達(dá)則會(huì)抑制癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展［24］。與既往研究結(jié)果一致，本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TSPAN1在CSCC組織中的陽(yáng)性表達(dá)顯著上調(diào)，并且確定了miR-194-5p與TSPAN1之間的靶向關(guān)系；之后又通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-194-5p或下調(diào)TSPAN1表達(dá)能夠抑制CSCC細(xì)胞的增殖、侵襲，加速細(xì)胞凋亡，且將miR-194-5p過(guò)表達(dá)和TSPAN1沉默聯(lián)合作用效果更加明顯。除檢測(cè)各組細(xì)胞的生物學(xué)行為變化外，本研究還檢測(cè)了各組細(xì)胞中凋亡及EMT相關(guān)因子的表達(dá)，以期明確影響細(xì)胞生物學(xué)行為變化的原因。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-194-5p或沉默TSPAN1的表達(dá)能夠促進(jìn)Bax、抑制Bcl-2，并改善EMT相關(guān)因子變化情況，這也進(jìn)一步證實(shí)了miR-194-5p/TSPAN1在CSCC中的作用。

綜上所述，miR-194-5p通過(guò)靶向調(diào)控TSPAN1基因抑制A431細(xì)胞的EMT、增殖、侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這將為CSCC的診斷和治療提供一定的參考。但本研究也存在一定的局限性：本研究?jī)H探討了體外miR-194-5p/TSPAN1如何影響CSCC的進(jìn)展，未進(jìn)行相關(guān)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，這也是課題組后期要進(jìn)一步完善的地方。