廣西壯族哮喘人群5-HTT基因rs3794808位點(diǎn)多態(tài)性與CD4+T淋巴細(xì)胞因子平衡的關(guān)系研究①

蒙明慮 許建國(guó) 陳高 馬迎教（右江民族醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，百色533000）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥、氣道壁重塑和氣道高反應(yīng)性疾病，是一種嚴(yán)重危害人類健康的身心疾病［1］。哮喘和焦慮、抑郁等精神性疾病的發(fā)病機(jī)制存在關(guān)聯(lián)，且與5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（5-HTT）基因多態(tài)性的功能作用有關(guān)［2-3］。以往研究發(fā)現(xiàn)哮喘的高氣道反應(yīng)主要是由免疫功能障礙引起，其中CD4+T淋巴細(xì)胞4個(gè)亞群：輔助性T細(xì)胞Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg起著至關(guān)重要的作用，Th細(xì)胞因子的異常表達(dá)、Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡是哮喘發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制［4-5］。為探討廣西壯族哮喘人群的5-HTT基因rs3794808位點(diǎn)多態(tài)性是否通過(guò)影響CD4+T淋巴細(xì)胞因子的平衡進(jìn)而影響哮喘的發(fā)病，本研究采用病例對(duì)照研究方法，觀察rs3794808位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞因子平衡狀態(tài)的影響，為5-HTT基因參與哮喘發(fā)病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料將廣西西部地區(qū)三甲醫(yī)院收集的221例壯族哮喘患者作為病例組，以208例壯族健康體檢者作為對(duì)照組。全部調(diào)查對(duì)象均在廣西長(zhǎng)期生活、三代均為壯族、未與其他民族通婚，均簽署知情同意書。本研究通過(guò)右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（倫理審查號(hào)2017030501）。哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組制定的《中國(guó)支氣管哮喘防治指南》［6］，病例組排除標(biāo)準(zhǔn)：①上呼吸道功能不全，慢性阻塞性肺疾病（COPD），氣管軟化等引起的喘息及合并其他呼吸系統(tǒng)疾??；②嚴(yán)重心血管疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全等其他系統(tǒng)的嚴(yán)重疾??；③合并自身免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等疾病。對(duì)照組是常規(guī)體檢的健康人，近1個(gè)月內(nèi)無(wú)急性上呼吸道感染、胸部X線檢查未見異常、無(wú)哮喘病史及典型過(guò)敏史、無(wú)自身免疫性疾病史。

共收集病例組221例，其中男性113例（51.1%），女性108例（48.9%），年齡24~85歲，平均年齡（53.21±13.88）歲；對(duì)照組208例，其中男性105例（50.5%），女性103例（49.5%），年齡20~89歲，平均年齡（53.13±15.91）歲，兩組性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.018，P=0.893；t=0.058，P=0.954），資料具有可比性。

1.1.2 試劑及儀器基因分型在北京六合華大基因科技有限公司完成；細(xì)胞因子檢測(cè)試劑購(gòu)自TaKaRa公司；基因擴(kuò)增儀ETC811購(gòu)自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；DNA測(cè)序儀購(gòu)自Applied Biosystems公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集抽取外周靜脈血5 ml，經(jīng)乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）抗凝，其中1 ml血標(biāo)本用于提取DNA，4 ml血標(biāo)本用于血清細(xì)胞因子水平的檢測(cè)。

1.2.2 基因組DNA提取1 ml抗凝血全用于提取DNA，使用TaKaRa公司人全血基因組DNA試劑盒提取DNA，嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟提取DNA，分裝置于-80℃冰箱保存待用。

1.2.3 基因分型采用SNP的PCR重測(cè)序法對(duì)rs3794808位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。PCR擴(kuò)增上游引物：5'-CTAACCCAGGCTCCTCA-3'，下 游 引 物：5'-TC‐GCTTTACCCTCATCT-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA模板1 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，BGI 2×Su‐per PCR Mix 15 μl；RNase-free H2O 12 μl（總反應(yīng)體積30 μl），配好反應(yīng)體系后基因擴(kuò)增儀上執(zhí)行以下反應(yīng)程序：96℃預(yù)變性5 min；96℃變性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，共10個(gè)循環(huán)；96℃變性20 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)物4℃保存。將DNA擴(kuò)增產(chǎn)物用于測(cè)序。測(cè)序反應(yīng)體系為：2 μl Mix（Big‐dye3.1、5×sequencing buffer、H2O），2 μl純 化 后 的PCR產(chǎn)物，1 μl引物（5 mmol/L）。測(cè)序反應(yīng)程序?yàn)椋貉h(huán)條件為：95℃15 s→（95℃15 s→50℃5 s→60℃90 s）×35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)完成后，將反應(yīng)物4℃保存，用ABI 3730XL型DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，部分測(cè)序結(jié)果，見圖1。

1.2.4 細(xì)胞因子水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17水平，所有試劑均購(gòu)于TaKaRa公司，整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)分析；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以xˉ±s表示，兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間均數(shù)比較，以單因素方差分析進(jìn)行多組間均數(shù)比較，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組人群SNP位點(diǎn)基因分型及等位基因頻率病例組及對(duì)照組的基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)（χ2=1.067，P=0.893；χ2=0.002，P=0.967），說(shuō)明兩組人群均具有代表性；病例組和對(duì)照組在rs3794808的基因型頻率和等位基因頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；如圖1、表1。

表1 兩組人群5-HTT基因rs379808位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的比較［頻數(shù)（%）］Tab.1 Comparison of polymorphism distribution of locus rs3794808 of 5-HTT gene in two groups［Frequen?cy（%）］

圖1 5-HTT基因rs3794808位點(diǎn)5-3′UTR測(cè)序結(jié)果Fig.1 Direct sequencing graph of locus rs3794808 at 5-3'UTR of 5-HTT gene

2.2 5-HTT基因多態(tài)性與哮喘的關(guān)聯(lián)性分析5-HTT基因rs379808位點(diǎn)CT基因型與TT基因型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），CC基因型、CT+CC基因型與TT基因型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CC基因型發(fā)生哮喘的危險(xiǎn)度是TT基因型的3.090倍（95%CI：1.084~8.808），C等位基因患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)是T等位基因的1.608倍（95%CI：1.136~2.276）。見表2。

表2 5-HTT基因rs379808位點(diǎn)基因型的相對(duì)危險(xiǎn)度分析Tab.2 Relative risk analysis of locus rs3794808 of 5-HTT gene

2.3 兩組人群細(xì)胞因子水平比較病例組血清中的IFN-γ和IL-10水平低于對(duì)照組，而IL-4和IL-17水平明顯高于對(duì)照組；與對(duì)照組相比，病例組的IFN-γ/IL-4較低，而IL-17/IL-10較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表3。

表3 兩組人群血清細(xì)胞因子水平的比較（±s）Tab.3 Comparison of serum cytokine levels between two groups（±s）

表3 兩組人群血清細(xì)胞因子水平的比較（±s）Tab.3 Comparison of serum cytokine levels between two groups（±s）

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2.4 病例組中不同基因型哮喘患者細(xì)胞因子水平的比較攜帶不同基因型的哮喘患者血清中各細(xì)胞因子水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P<0.001）；多重比較顯示，與攜帶TT基因型哮喘患者相比，CC基因型哮喘患者血清中IFN-γ和IL-10的濃度較低，而IL-4和IL-17的濃度較高，IFN-γ/IL-4較低，而IL-17/IL-10較高；CT基因型哮喘患者與TT基因型哮喘患者相比較，血清中IL-17較低，IL-17/IL-10較高。見表4、圖2。

圖2 不同基因型哮喘患者血清細(xì)胞因子水平的比較Fig.2 Comparison of serum cytokine levels in patients with asthma of different genotypes

表4 病例組中不同基因型哮喘患者血清細(xì)胞因子水平的比較（±s）Tab.4 Comparison of serum cytokine levels in patients with asthma of different genotypes in case group（±s）

表4 病例組中不同基因型哮喘患者血清細(xì)胞因子水平的比較（±s）Tab.4 Comparison of serum cytokine levels in patients with asthma of different genotypes in case group（±s）

Note：Multiple comparisons，there were significant differences between CC and TT，CT and TT genotypes，1）P<0.001.

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3 討論

哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，由于無(wú)法完全治愈、反復(fù)發(fā)作且普遍存在焦慮、抑郁等精神問題，哮喘患者患精神性疾病的風(fēng)險(xiǎn)更高［7-8］。哮喘和焦慮、抑郁等精神性疾病之間存在共同的遺傳易感性，重度抑郁的多基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（PRS）與兒童哮喘風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)［9-10］，以往研究表明，體內(nèi)5-HTT基因表達(dá)減少會(huì)增加哮喘和抑郁的風(fēng)險(xiǎn)［3］，5-HTT基因Stin2多態(tài)性與臺(tái)州地區(qū)漢族人群哮 喘 的發(fā) 生 呈顯 著 相關(guān)［11］，雖 然5-HTT基 因rs3794808位點(diǎn)與哮喘的關(guān)系鮮有報(bào)道，但有研究證實(shí)該位點(diǎn)與抑郁等精神性疾患有關(guān)聯(lián)［12］，而哮喘又是一個(gè)典型的心身疾病，因而該位點(diǎn)與哮喘的關(guān)系值得探討和研究。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，5-HTT基因rs3794808位點(diǎn)多態(tài)性可能是壯族人群哮喘發(fā)病的潛在遺傳易感性標(biāo)志，5-HTT作為免疫調(diào)節(jié)劑，參與了炎癥反應(yīng)過(guò)程，與哮喘發(fā)作有關(guān)［13］。為了探討5-HTT基因rs3794808位點(diǎn)與哮喘的關(guān)系是否通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，本研究進(jìn)行了病例對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)5-HTT基因rs3794808位點(diǎn)CC基因型和C等位基因是壯族人群哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)因素，與前期研究結(jié)果一致［13］，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞因子進(jìn)一步了解5-HTT基因rs3794808位點(diǎn)多態(tài)性與Th1/Th2、Th17/Treg平衡的關(guān)系。

哮喘的慢性氣道炎癥由多種細(xì)胞免疫參與反應(yīng)，Th1/Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子失衡是哮喘發(fā)病的基礎(chǔ)［14］。在正常機(jī)體中，IFN-γ和IL-4互相拮抗，維持Th1/Th2平衡，當(dāng)機(jī)體受變應(yīng)原刺激時(shí)，Th1/Th2失衡，Th2占優(yōu)勢(shì)，分泌大量IL-4，抑制IFN-γ活性，促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，使杯狀細(xì)胞增生，氣道黏液分泌增多，氣管增厚，導(dǎo)致氣道狹窄而促使哮喘發(fā)作［15-16］。Th2細(xì)胞分泌的IL-4是慢性炎癥和氣道高反應(yīng)性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，哮喘患者血清的IL-4高于正常對(duì)照組，Th1分泌的IFN-γ可抑制輕度和中度哮喘的發(fā)作，IFN-γ與哮喘的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)［17］。LIANG等［18］對(duì)哮喘小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照小鼠比較，哮喘小鼠的IFN-γ水平降低，IL-4水平升高，體內(nèi)Th1/Th2免疫失衡。有報(bào)道糖皮質(zhì)激素通過(guò)抑制Notch1信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)整小鼠哮喘過(guò)敏性氣道炎癥中涉及的Th1/Th2平衡從而達(dá)到抗炎的目的［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，壯族哮喘人群的IFN-γ水平降低而IL-4水平升高，IFN-γ/IL-4較低，說(shuō)明Th1/Th2細(xì)胞因子免疫失衡參與了壯族人群哮喘炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

以往對(duì)哮喘的研究主要集中在Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Th1/Th2細(xì)胞免疫失衡不足以說(shuō)明哮喘的炎癥反應(yīng)，哮喘還與Th17和Treg失衡有關(guān)［20］。Th17細(xì)胞經(jīng)過(guò)活化后誘導(dǎo)生成IL-17，IL-17會(huì)募集中性粒細(xì)胞，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子在氣道內(nèi)的大量表達(dá)［21］，導(dǎo)致組織破壞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，打破體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)平衡，進(jìn)一步加劇哮喘的發(fā)作。Treg細(xì)胞分泌TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子，抑制嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的活化，減輕Th2細(xì)胞因子IL-4的分泌，從而抑制氣道炎癥反應(yīng)，抑制哮喘的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)哮喘患兒的Th17細(xì)胞頻率升高、Th17/Treg升高，而且與氣道高反應(yīng)性相關(guān)，在對(duì)兒童及成人哮喘的研究中都觀察到了Th17/Treg細(xì)胞因子的失衡，并與成人哮喘病情的嚴(yán)重程度有關(guān)［22-24］。本次研究發(fā)現(xiàn)壯族哮喘人群的IL-10水平比較低，IL-17水平明顯高于對(duì)照組，IL-17/IL-10增高，提示Th17/Treg細(xì)胞因子在壯族哮喘人群中比例失衡。為哮喘的靶點(diǎn)治療提供理論依據(jù)。

本研究顯示5-HTT基因rs3794808位點(diǎn)CC基因型發(fā)生哮喘的危險(xiǎn)性是TT基因型的3.090倍（95%CI：1.084~8.808），為了解5-HTT基因型的差異是否影響Th細(xì)胞因子平衡，對(duì)不同基因型哮喘患者的細(xì)胞因子水平的比較顯示，與攜帶TT基因型哮喘患者相比，CC基因型哮喘患者血清中的IFN-γ和IL-10表達(dá)下降，IL-4和IL-17表達(dá)升高，IFN-γ/IL-4降低及IL-17/IL-10增高，提示5-HTT基因多態(tài)性可能與CD4+T淋巴細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)，有可能通過(guò)影響Th1/Th2、Th17/Treg平衡從而影響哮喘的發(fā)病，此結(jié)果從另一個(gè)角度為哮喘機(jī)制研究提供了切入點(diǎn)和線索，但其中的復(fù)雜機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。