miR-204在宮頸癌中的表達(dá)及對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控機(jī)制研究

任 丹，宋一村，成榮杰，吳紅梅，畢丹丹，王曉菲，李 楠*

(1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第五醫(yī)院 大慶龍南醫(yī)院 病理科，黑龍江 大慶163000;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 a.病理科；b.婦科，黑龍江 哈爾濱150001)

宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一，我國每年新發(fā)病例達(dá)13.15萬，其中宮頸癌死亡人數(shù)約5.3萬，嚴(yán)重危害我國女性身體健康[1-2]，宮頸癌發(fā)病的相關(guān)基因分子信號(hào)機(jī)制及新型靶向治療研究一直是該領(lǐng)域的熱點(diǎn)[3-4]。目前已認(rèn)識(shí)到微小RNA(miRNA)與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)，探索其作用信號(hào)調(diào)控機(jī)制有助于深入認(rèn)識(shí)宮頸癌發(fā)病的分子機(jī)制[5]。以往研究報(bào)道m(xù)iR-204通過介導(dǎo)一系列的信號(hào)通路在宮頸癌及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[6-7]，而miRNA的生物學(xué)功能主要通過靶向基因mRNA結(jié)合來實(shí)現(xiàn)，有研究發(fā)現(xiàn)沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)、CXC趨化因子受體4(CXCR4)參與了宮頸癌的發(fā)病過程[8-9]，miR-204可調(diào)控SIRT1在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用，且SIRT1具有抑制CXCR4表達(dá)活性的作用[10-11]。然而，目前尚不清楚miR-204是否通過介導(dǎo)SIRT1/CXCR4信號(hào)通路參與了宮頸癌的發(fā)病過程。因此，本項(xiàng)目擬借助臨床研究聯(lián)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)通過分子生物學(xué)檢測手段，解析miR-204調(diào)控SIRT1/CXCR4信號(hào)通路在宮頸癌中的作用機(jī)制，以期深入認(rèn)識(shí)宮頸癌發(fā)病的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2017年1月在大慶龍南醫(yī)院行手術(shù)切除的宮頸癌癌組織及癌旁正常組織各30例，患者年齡范圍35-75歲，平均年齡(44.92±3.21)歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)宮頸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社《婦產(chǎn)科學(xué)》第8版標(biāo)準(zhǔn)；(2)所有患者均在本院接受手術(shù)治療，標(biāo)本來源于CIN Ⅱ級(jí)-Ⅲ級(jí)術(shù)后患者；(3)宮頸癌患者臨床分期為Ⅰ期-Ⅱ期；(4)所有患者手術(shù)前均未接受放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)轉(zhuǎn)移性宮頸癌；(2)合并其他部位惡性腫瘤疾?。?3)既往有放化療病史。組織樣本在手術(shù)室收集后于15 min內(nèi)進(jìn)行處理，組織樣本置于液氮罐，被凍存于-80℃冰箱內(nèi),本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。人宮頸癌Hela細(xì)胞株均購于上海中科院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)基，胰蛋白酶購自Gibco公司。胎牛血清購自Hyclone公司。MTT試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒及Western Blot試劑盒購自上海碧云天生物公司。Transwell 小室購自美國Corning 公司。SIRT1、CXCR4一抗購自Proteintech公司。TRIzol 提取試劑、PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real Time RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶日生物技術(shù)有限公司。白藜蘆醇、EX527及 Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma-Aldrich公司。引物序列由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成，miR-204模擬物由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)并合成。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。凝膠成像儀購自Bio-Rad公司。SDS-PAGE蛋白電泳儀及濕式電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購自北京六一儀器廠。ABI7500定量PCR儀購自Life公司。NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)購自美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人宮頸癌Hela細(xì)胞株于37 ℃，5%CO2中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，可用0.25%胰蛋白酶消化用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分組，對(duì)照組：加入PBS液；miR-204過表達(dá)組：轉(zhuǎn)染構(gòu)建miR-204基因過表達(dá)細(xì)胞；miR-204過表達(dá)+SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇組：miR-204過表達(dá)后加入20 μmol/L的白藜蘆醇預(yù)處理2 h；miR-204過表達(dá)+SIRT1拮抗劑EX527組：miR-204過表達(dá)后加入20 μmol/L的EX527預(yù)處理2 h。轉(zhuǎn)染前一天，加入無抗生素的完全培養(yǎng)基，用Opti-MEM稀釋miR-204模擬物，輕輕混勻，室溫靜置5 min；Opti-MEM稀釋Lipofectamine2000，輕輕混勻，室溫靜置5 min；室溫孵育20 min；轉(zhuǎn)染后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4-6 h后更換新的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24-96 h，進(jìn)行后續(xù)處理。

1.3.2qRT-PCR 檢測mRNA的表達(dá) TRIzol提取試劑提取組織和細(xì)胞總RNA，光度計(jì)測定總RNA濃度，測定RNA在260 nm、280 nm的吸光度值，檢測純度和計(jì)算濃度，RNA樣品A260/280在1.8-2.1為合格。通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，引物見表1，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序見表2、表3。采用2-ΔΔCt分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表3 反應(yīng)程序

1.3.3Western Blot檢測細(xì)胞SIRT1、CXCR4蛋白表達(dá) 加入RIPA裂解液至冰上充分裂解，離心后取上清，BCA法測定總蛋白濃度，用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后電轉(zhuǎn)，用5% TBS(含脫脂奶粉)封閉1 h，加入1∶1000稀釋的SIRT1、CXCR4和GAPDH一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗5 min×3次后加入適當(dāng)濃度(1∶5000)的二抗，室溫孵育1 h。TBST漂洗5 min×3次，暗室內(nèi)浸入ECL液顯色。

1.3.4MTT法檢測細(xì)胞活力 于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h不同時(shí)間點(diǎn)，每孔加入 MTT溶液 20 μl，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸棄原培養(yǎng)基，加入150 μl DMSO，室溫下孵育10 min；隨后振蕩10 min，以空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測定490 nm處OD值，繪制細(xì)胞的活力曲線。

1.3.5Annexin V-FIPC/PI雙染色法流式細(xì)胞儀檢測凋亡 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以105個(gè)/ml密度培養(yǎng)24 h；加入5 ml不含胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，1 000 rpm/min，離心5 min，PBS漂洗2次，棄上液，取細(xì)胞數(shù)105個(gè)加入100 μl 1×binding buffer，分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，冰浴反應(yīng)18 min；每管再加入1×binding buffer 300 μl，用300目尼龍網(wǎng)過濾，用FACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.6Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 胰酶消化，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至(1-10)×105個(gè)/ml，加200 μl懸液至上室，然后加500 μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基至下室，培養(yǎng)24 h。取出小室，甲醇固定15 min，蘇木素染液染色15 min，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)，重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)測定結(jié)果采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-204、SIRT1、CXCR4在宮頸癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)

與癌旁正常組織相比，宮頸癌組織中miR-204 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯下降，SIRT1和CXCR4mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1。

圖1 miR-204、SIRT1、CXCR4在宮頸癌組織和癌旁正常組織的表達(dá)

2.2 調(diào)控miR-204對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組相比，miR-204過表達(dá)組細(xì)胞增殖率顯著下降(P<0.05)，miR-204過表達(dá)+白藜蘆醇組增殖率無明顯差異(P>0.05)，miR-204過表達(dá)+EX527組增殖率顯著下降，且miR-204過表達(dá)+EX527組與miR-204過表達(dá)組存在顯著性差異(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 調(diào)控miR-204對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖影響

2.3 調(diào)控miR-204對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲的影響

Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組相比，miR-204過表達(dá)組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)顯著下降(P<0.05)，miR-204過表達(dá)+白藜蘆醇組無明顯差異(P>0.05)，miR-204過表達(dá)+EX527組顯著下降，且miR-204過表達(dá)+EX527組與miR-204過表達(dá)組存在顯著性差異(P<0.05)，詳見圖3。

圖3 調(diào)控miR-204對(duì)宮頸癌細(xì)胞侵襲影響

2.4 調(diào)控miR-204對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，miR-204過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，miR-204過表達(dá)+白藜蘆醇組無明顯差異(P>0.05)，miR-204過表達(dá)+EX527組顯著上升(P<0.05)，且miR-204過表達(dá)+EX527組與miR-204過表達(dá)組存在顯著性差異(P<0.05)，詳見圖4、圖5。

A：對(duì)照組；B：miR-204過表達(dá)；C：miR-204過表達(dá)+白藜蘆醇組；D：miR-204過表達(dá)+EX527組

圖5 各組宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

2.5 調(diào)控miR-204對(duì)宮頸癌細(xì)胞SIRT1、CXCR4的影響

qPCR檢測及WB檢測結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-204過表達(dá)組SIRT1、CXCR4顯著下降(P<0.05)，miR-204過表達(dá)+白藜蘆醇組無明顯差異(P>0.05)，miR-204過表達(dá)+EX527組顯著下降(P<0.05)，且miR-204過表達(dá)+EX527組與miR-204過表達(dá)組存在顯著性差異(P<0.05)，詳見圖6、圖7。

注：與對(duì)照組及miR-204過表達(dá)+白藜蘆醇組相比，*P<0.05，與miR-204過表達(dá)組相比，#P<0.05。

圖7 調(diào)控miR-204對(duì)宮頸癌細(xì)胞SIRT1、CXCR4 蛋白的影響

3 討論

宮頸癌是發(fā)病率最高的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，高發(fā)病率及病死率是導(dǎo)致宮頸癌患者不良預(yù)后的主要原因[12]。盡管近年來治療手段得到了長足發(fā)展，但由于發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，中晚期宮頸癌患者預(yù)后并未得到明顯改善[13]。進(jìn)一步深入闡明宮頸癌發(fā)病的分子機(jī)制對(duì)于提高宮頸癌診治能力具有重要意義，近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在宮頸癌發(fā)生發(fā)展等惡性進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

miR-204定位于人類9號(hào)染色體上73424891-73425000位置之間，屬于抑癌基因，近來研究表明miR-204參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等[14]。本研究發(fā)現(xiàn)與癌旁正常組織相比，miR-204在宮頸癌組織中的表達(dá)量顯著降低，與Wu等的研究[15]結(jié)果類似。據(jù)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，miR-204具有多種靶基因，SIRT1便是其中之一，但關(guān)于miR-204調(diào)控SIRT1是否參與宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為目前不得而知，為了進(jìn)一步探究miR-204的具體功能是否與調(diào)控SIRT1通路有關(guān)，本研究miR-204模擬物轉(zhuǎn)染至宮頸癌細(xì)胞誘導(dǎo)呈miR-204過表達(dá)模型，然后分別予以SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇和抑制劑EX57干預(yù)，觀察各自處理對(duì)細(xì)胞增殖，侵襲和凋亡的影響，結(jié)果顯示，與不處理的對(duì)照組相比，miR-204過表達(dá)組的細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲能力下降，SIRT1、CXCR4 表達(dá)水平均明顯下降，同時(shí)凋亡率明顯增加，表明提高miR-204表達(dá)有助于減緩腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移，而給予白藜蘆醇后，細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲及凋亡能力，SIRT1和CXCR4 表達(dá)水平均未發(fā)生明顯變化，表明給予SIRT1激動(dòng)劑后可以逆轉(zhuǎn)miR-204過表達(dá)引起的抗腫瘤作用，與之相反的是給予抑制劑后，miR-204過表達(dá)的抗腫瘤作用明顯增強(qiáng)，提示SIRT1為miR-204參與調(diào)控的下游靶基因，SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性組蛋白脫乙酰酶，研究顯示抑制SIRT1可發(fā)揮抑癌作用[16]。CXCR4在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，能夠促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[17]，本研究進(jìn)一步證實(shí)SIRT1和CXCR4在宮頸癌中高表達(dá)，抑制其表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞增長。本研究表明可通過提高miR-204表達(dá)抑制SIRT1/CXCR4通路參與調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，miR-204在宮頸癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，提高miR-204表達(dá)可以經(jīng)SIRT1/CXCR4通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)凋亡，miR-204 可作為一種潛在的治療靶點(diǎn)。