基于MPMS誘變體系的茶樹菇細(xì)胞工程育種*

吳亞楠，尹顯達(dá)，耿培妍，田宇超，李珊珊，王 謙**

（1.河北大學(xué)生物工程技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071002；2.承德市農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，河北 承德 067000）

茶樹菇（Arocybe aegirita） 隸屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina） 層菌綱 （Hymenomycetes） 傘菌目（Agaricales） 糞銹傘科（Bolbitiaceae） 田頭菇屬（A－grocybe），又名茶新菇、柱狀田頭菇[1]，原生于南方的油茶樹上，故俗稱茶樹菇[2]。其味道鮮美，脆嫩可口；且還含有人體所需的18種氨基酸，其中包括人體不能合成的8種氨基酸，還含有豐富的多種礦物質(zhì)元素和B族維生素，是一種營養(yǎng)價值、藥用價值均較高的珍稀食用菌[3]。

荊條 （Vitex negundo var.heterophylla） 為落葉灌木，喜光、抗旱、耐瘠薄，主要生長于山坡、路旁、林緣土崗等地[4]，適應(yīng)性極強(qiáng)，對土壤要求不嚴(yán)，分布幾遍全國；冀北山地、晉東南山地、太行山、豫西山地丘陵以及晉陜黃土高原等地均有分布[5-6]，而且還具有“愈伐愈盛”的特性[7]。

多功能等離子體誘變系統(tǒng)（multifunctional plas－ma mutagenesis system，MPMS） 以等離子體為主要誘變劑。等離子束進(jìn)入細(xì)胞后，其活性成分與蛋白質(zhì)DNA等生物大分子作用，會造成DNA片段局部損傷，以此激發(fā)細(xì)胞自身的修復(fù)體系，從而產(chǎn)生大量的隨機(jī)突變[8]。該突變方式對堿基無選擇，能在任何位點(diǎn)產(chǎn)生突變，從而產(chǎn)生種類豐富的變異基因[9]。MPMS誘變技術(shù)已應(yīng)用于γ-氨基丁酸高產(chǎn)菌株[10]、淡紫擬青霉產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌種[11]、埃莎霉素Ⅰ高產(chǎn)菌株[12]的選育，與常規(guī)育種手段相比，MPMS具有成本低，操作簡便，無有害氣體，不污染環(huán)境，豐富育種手段等特點(diǎn)。

本研究使用新型育種方法MPMS，利用河北太行山林業(yè)廢棄物荊條進(jìn)行茶樹菇育種工作，通過篩選得到最善于分解利用荊條的高產(chǎn)量、高品質(zhì)、高利用率的茶樹菇菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

出發(fā)菌株茶樹菇AS7（PDA斜面培養(yǎng)），保藏于河北大學(xué)食藥用真菌研究所。

1.1.2 栽培原材料

荊條屑、雜木屑、玉米芯、麩皮等由河北大學(xué)扶貧基地張家口赤城縣靈華食用菌種植有限公司提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)配方

PDA斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%、KH2PO40.1%，MgSO40.1%，pH自然。

液體培養(yǎng)基：玉米粉2%、豆餅粉2%、葡萄糖2%、酵母膏0.2%、KH2PO40.1%、MgSO40.1%。

荊條枝屑篩選培養(yǎng)基：荊條枝屑（過100目篩）0.5%、酵母膏0.2%、VB10.001%、KH2PO40.2%、MgSO40.05%、瓊脂2%。

荊條枝屑栽培培養(yǎng)基：荊條枝屑（粉碎至木屑狀）60%、玉米芯20%、麩皮18%、石灰2%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲體的制備

將PDA培養(yǎng)基中的茶樹菇菌絲刮于液體培養(yǎng)基中，接種后黑暗條件下靜置24 h，再置于25℃、180 r·min-1的搖床上培養(yǎng) 4 d～7 d。

1.2.2 菌懸液的制備

將制備好的菌絲體經(jīng)無菌紗布或無菌銅網(wǎng)過濾，濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，8 000 r·min-1離心5 min，棄上清。用無菌水沖洗沉淀2次，并制成懸浮液。

1.2.3 MPMS誘變處理

在超凈工作臺中用移液槍吸取50 μL制備好的菌懸液，均勻涂抹在無菌不銹鋼載片上，將其置于無菌平皿內(nèi)移至提前開機(jī)殺菌30 min的MPMS生物誘變育種機(jī)中。MPMS誘變射頻功率為100 W，處理距離3 mm，氣體流量12.00 L·min-1，設(shè)置誘變模式為A-F，以≥99.99%氮?dú)鉃楣ぷ鳉怏w，誘變時間以每10秒遞增的方式設(shè)置，分別為0、10 s、20 s……90 s，每個梯度設(shè)置6個平行[13]。誘變后的載片使用700 μL無菌水沖洗，將沖洗所得處理液充分混勻后，吸取300 μL處理液涂布于荊條木屑再生培養(yǎng)基平板上，25℃避光培養(yǎng)，5 d～10 d后記錄誘變菌株數(shù)，繪制致死率曲線，以確定最佳后誘變照射時間。

1.2.4 誘變菌株的初篩

按3株誘變菌株與1株出發(fā)菌株的方法接入同一PDA平板培養(yǎng)基進(jìn)行拮抗試驗(yàn)[14]，挑選出菌株產(chǎn)生較明顯拮抗反應(yīng)的誘變菌株。

1.2.5 誘變菌株的復(fù)篩

將初篩得到的菌株分別取相同大小的3個菌塊接入荊條枝屑篩選培養(yǎng)基試管中，同時以出發(fā)菌株為對照，25℃恒溫培養(yǎng)。待菌絲萌發(fā)長齊后作為起點(diǎn)劃線，觀察菌株長勢，計算生長速度，統(tǒng)計菌絲生長速度[15]。

挑選長勢、生長速度均優(yōu)于出發(fā)菌菌株的誘變菌株栽培培養(yǎng)基，測定30 d后其多酚氧化酶活性。誘變菌株多酚氧化酶測定采用鄰苯二酚法測定[16-18]。

按荊條屑配方制作菌袋，接種優(yōu)良誘變菌株后，在黑暗的條件下培養(yǎng)，開袋后統(tǒng)計三茬鮮菇的重量，計算生物學(xué)效率[19-21]。

1.2.6 誘變菌株真實(shí)性鑒定

對篩選得到的優(yōu)良誘變菌株與出發(fā)菌株進(jìn)行菌種真實(shí)性鑒定，采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)[22-25]，明確優(yōu)良誘變菌株與出發(fā)菌株在分子水平上的遺傳距離，使用軟件Ntsys 2.10e進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建遺傳關(guān)系聚類樹狀圖。其ISSR引物序列見表1。

表1 ISSR引物序列Tab.1 Sequence of ISSR prime

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MPMS致死率曲線

誘變菌株致死率曲線見圖1。

圖1 致死率曲線圖Fig.1 The lethality curve

由圖1可知，50 s時菌絲體的致死率為79.65%；60 s時菌絲體的致死率為93.07%；70 s時菌絲體的致死率為99.99%；80 s后致死率達(dá)到了100%，因此，選用60 s為MPMS最佳誘變時間。

2.2 誘變菌株的初篩結(jié)果

通過MPMS誘變共得到262株誘變菌株。拮抗試驗(yàn)后，有22株茶樹菇誘變菌株與出發(fā)菌株產(chǎn)生明顯的拮抗反應(yīng)，部分菌株拮抗反應(yīng)見圖2。

圖2 誘變菌株的拮抗反應(yīng)圖Fig.2 Antagonistic reaction diagram of mutagenesis strain

由圖2可知，誘變菌株AM16、AM6以及AM7與出發(fā)菌株AS7產(chǎn)生了明顯的拮抗反應(yīng)。

2.3 誘變菌株復(fù)篩的結(jié)果

2.3.1 誘變菌株與出發(fā)菌株生長速度與長勢對比

荊條枝屑再生篩選培養(yǎng)基中誘變菌株與出發(fā)菌株生長速度、長勢統(tǒng)計結(jié)果見表2。

由表2可知，MPMS誘變試驗(yàn)得到了與出發(fā)菌株有明顯拮抗的20株誘變菌株；其中生長速度較快的菌株AM220、AM27、AM229、AM233、AM17與出發(fā)菌株相比有顯著差異；菌株AM220、AM27、AM229較出發(fā)菌株有極顯著性差異；菌株AM220的生長速度最快，高達(dá)3.42 mm·d-1，比出發(fā)菌株快0.34 mm·d-1。

表2 誘變菌株長勢與生長速度對比結(jié)果Tab.2 Comparison on growth rate and tendency of regeneration strains

2.3.2 誘變菌株與出發(fā)株胞外酶活性對比

1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)數(shù)據(jù)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Glucose standard curve

由圖3可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的回歸系數(shù)R2為0.998 5。

2）誘變菌株多酚氧化酶酶活比較

荊條枝屑再生篩選培養(yǎng)基中誘變菌株多酚氧化酶酶活測定結(jié)果統(tǒng)計見表3。

表3 誘變菌株多酚氧化酶活比較Tab.3 Comparison of polyphenol oxidase activity of regenerated strains

由表3可知，誘變菌株AM220、AM27、AM7、AM236、AM233、AM229等6株多酚氧化酶活性均高于出發(fā)菌株，且與出發(fā)菌株相比有極顯著性差異，其中誘變菌株AM220的多酚氧化酶活性最高。

2.3.3 優(yōu)良誘變菌株生物學(xué)效率比較

優(yōu)良誘變菌株于荊條枝屑栽培培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其生物學(xué)效率統(tǒng)計結(jié)果見表4。

表4 優(yōu)良誘變菌株生物學(xué)效率對比Tab.4 Comparison of biological efficiency of regenerating strain

由表4可知，優(yōu)良誘變菌株AM220、AM27、AM7、AM236、AM233與出發(fā)菌株相比有顯著性差異，優(yōu)良誘變菌株AM220、AM27與出發(fā)菌株相比有極顯著性差異。菌株AM220的滿袋時間為38 d，比出發(fā)菌株滿袋時間提前8 d，生物學(xué)效率提高11.57%，因此確定菌株AM220是最適宜分解荊條的茶樹菇菌株。

2.4 ISSR試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 優(yōu)良誘變菌株ISSR指紋圖譜

通過復(fù)篩篩選得出優(yōu)良誘變菌株，其部分ISSR指紋圖譜見圖4。

圖4 引物807、811和P6對6株菌株的ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.4 ISSR profiles from primer 807、811 and P6 for 6 strains

由圖4所示，對篩選得到的優(yōu)良誘變菌株AM7、AM27、AM220、AM233、AM236與出發(fā)菌株AS7進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)，在挑選的21條引物中，引物 807、809、811、815、852、P1、P2、P6 的擴(kuò)增圖譜效果較好，條帶清晰穩(wěn)定、分布合理且具有差異性。共獲得34條擴(kuò)增條帶，各條引物可獲得2條～6條擴(kuò)增條帶，其中有17條擴(kuò)增條帶與出發(fā)菌株有差異，擴(kuò)增條帶大小在250 bp～2 000 bp。

2.4.2 優(yōu)良誘變菌株親緣關(guān)系分析

優(yōu)良誘變菌株與出發(fā)菌株遺傳關(guān)系見圖5。

圖5 優(yōu)良誘變菌株與出發(fā)菌株遺傳關(guān)系聚類樹狀圖Fig.5 UPGMA dendrogram based on the similarity coefficient within superior regeneration strains and parents

由圖5可知，對篩選所得的誘變菌株AM7、AM27、AM220、AM233、AM236，與出發(fā)株進(jìn)行聚類分析，5株優(yōu)良誘變菌株與出發(fā)菌株的遺傳相似系數(shù)變異為0.678～0.883，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.745時，菌株可分為3個類群。第一類是菌株AM236，第二類是菌株AM27和菌株AM7，第三類是菌株AM220、AM233和出發(fā)菌株AS7。說明5種優(yōu)良誘變菌株均與出發(fā)株存在不同程度差異。誘變菌株AM236與出發(fā)菌株AS7的遺傳相似系數(shù)最小，說明菌株AM236發(fā)生了明顯的基因突變。

3 討論

研究使用MPMS誘變育種技術(shù)進(jìn)行育種，確定最佳誘變時間為60 s，共選育出茶樹菇誘變菌株262株。通過與出發(fā)菌株的拮抗試驗(yàn)篩選出20株誘變菌株。復(fù)篩通過生長速度、長勢試驗(yàn)測定，篩選出10株優(yōu)于出發(fā)株的誘變菌株；另通過多酚氧化酶酶活測定，篩選出6株優(yōu)于出發(fā)株的優(yōu)良誘變菌株；最后通過優(yōu)良誘變菌株生物學(xué)效率的比較，確定出一株善于分解荊條的誘變菌株AM220，其生長速度可達(dá)3.42 mm·d-1，比出發(fā)菌株快0.34 mm·d-1，生物學(xué)效率可達(dá)81.70%，比出發(fā)株高11.57%。

ISSR分子鑒定結(jié)果表明，5株優(yōu)良誘變菌株與出發(fā)菌株的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.678～0.883，5株優(yōu)良誘變菌株與出發(fā)菌株均存在不同程度的差異。

MPMS可以用作食用菌誘變育種新技術(shù)。荊條屑具備栽培茶樹菇的前景，是產(chǎn)業(yè)扶貧、生態(tài)農(nóng)業(yè)可以利用的技術(shù)途徑之一。