蛋白C抗凝系統(tǒng)功能及分子缺陷的研究進(jìn)展

程禮敏

（皖南醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗實訓(xùn)中心，安徽 蕪湖241002）

0 引言

蛋白C抗凝系統(tǒng)是維持機(jī)體內(nèi)凝血與抗凝血系統(tǒng)相對穩(wěn)定狀態(tài)的重要組成部分，蛋白C抗凝系統(tǒng)系統(tǒng)主要包括：蛋白C、蛋白C抑制物、蛋白S、血栓調(diào)節(jié)蛋白以及內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體。內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體不僅在機(jī)體的抗凝過程中起作用[1]，同時參與了機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[2-3]，在細(xì)胞保護(hù)等方面也具有重要意義。

1 蛋白C抗凝系統(tǒng)各組分的生理結(jié)構(gòu)

1.1 蛋白C（protein C，PC）

PC由肝臟合成，以無活性的酶原形式分泌到血漿，是一種依賴維生素K的雙鏈糖蛋白，蛋白C分子由一條輕鏈和一條重鏈經(jīng)單一二硫鍵連接而成。PC滅活FVa和FVIIIa的絲氨酸蛋白酶活性位點位于重鏈，當(dāng)PC的重鏈氨基端上一個小肽段被切下時，就變成一種活化的蛋白C（APC），具有絲氨酸蛋白酶的活性。具體生物學(xué)特性詳見后述。

1.2 蛋白C抑制劑（protein C inhibitor，PCI）

PCI是一種依賴肝素的絲氨酸蛋白酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)于人的血漿、尿液和多種體液中。結(jié)構(gòu)多樣，PCI分子由387個氨基酸殘基組成，活性中心是Arg354-Ser355。PCI抑制譜廣泛，不僅能抑制APC，還能滅活凝血因子Xa、凝血酶、胰蛋白酶等。Geiger[4]在1996年發(fā)現(xiàn)PCI在體內(nèi)的分布存在種族特異性，在人體中，PCI作為一種血漿蛋白，廣泛表達(dá)于多種組織器官，但也在男性生殖器官中高濃度存在，卻只表達(dá)于小鼠的生殖系統(tǒng)上，提示PCI在生殖過程中的作用，涉及人類生殖的幾個步驟，包括受精過程，而且在不同物種間的調(diào)節(jié)作用存在差異。

1.3 蛋白S（protein S，PS）

蛋白S是一種依賴維生素K的血漿糖蛋白，以350nM左右的濃度循環(huán)于血漿中。人體循環(huán)血漿中，大約60%的PS通過高親和力、高分子量復(fù)合物與補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白C4b結(jié)合，形成C4BP結(jié)合蛋白。PS具有多種抗凝特性，雜合子蛋白S缺乏癥與靜脈血栓形成風(fēng)險增加相關(guān)。人和小鼠純合子缺乏癥與胎兒期嚴(yán)重血栓形成、血管系統(tǒng)發(fā)育缺陷等有關(guān)。除了抗凝作用，蛋白S還影響C4BP的補(bǔ)體調(diào)節(jié)特性，而且與TAM家族的酪氨酸激酶受體相互作用[5]。

1.4 血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）

TM是PC的活化輔助因子，是一種表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的跨膜糖蛋白。含有577個氨基酸殘基，主要構(gòu)成1個氨基端的C型凝集素區(qū)和6個EGF樣結(jié)構(gòu)域。 當(dāng)TM與凝血酶結(jié)合，形成T-TM復(fù)合物后，凝血酶的促凝活性即可轉(zhuǎn)化為抗凝活性，導(dǎo)致凝血酶對蛋白C的激活的級聯(lián)反應(yīng)被大大的加速；與此同時，TM能加速凝血酶激活纖溶抑制物的活化，而起到抑制纖溶反應(yīng)的作用。已證實TM存在于所有血管內(nèi)皮細(xì)胞中，腦血管除外[6]。現(xiàn)對于血漿可溶性TM作為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志已經(jīng)達(dá)成共識。TM在多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)出特異性的表達(dá)，提示TM還可能參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。

1.5 內(nèi)皮細(xì)胞蛋白C受體（endothelial cell protein C receptor，EPCR）

EPCR分子屬于跨膜蛋白，是與PC/APC具有高度親和力的內(nèi)皮細(xì)胞表面受體。EPCR在體內(nèi)的表達(dá)存在組織特異性，主要表達(dá)于大血管以及大部分小動、靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞表面[8]。EPCR可在蛋白S的輔助下滅活因子Va和VIIIa，發(fā)揮抗凝作用。同時EPCR結(jié)合APC后可通過蛋白酶活化受體1（PAR-1）的介導(dǎo)而觸發(fā)抗凋亡作用，還可抑制中性粒細(xì)胞的激活以及在組織損傷部位的外滲，導(dǎo)致細(xì)胞表面的黏附分子CD11b/CD18的表達(dá)受到抑制；繼而炎癥細(xì)胞因子合成及釋放減少而發(fā)揮抗炎作用。此外，EPCR是造血干細(xì)胞（HSC）的表面標(biāo)志物之一，可被用于HSC的分選和純化。EPCR可通過PAR-1信號通路等途徑，參與HSC及其微環(huán)境的調(diào)節(jié)，介導(dǎo)HSC在骨髓中的保留和造血功能的重建[9]。

2 蛋白C抗凝系統(tǒng)的生物學(xué)功能

蛋白C抗凝系統(tǒng)的終產(chǎn)物均為活化蛋白C（APC），其各組分發(fā)揮生物學(xué)功能都將依賴于APC。臨床上運用APC治療，可能對創(chuàng)傷性腦損傷具有重要的治療潛力，在腦卒中模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用，APC可改善腦損傷后功能的轉(zhuǎn)歸，并能促進(jìn)缺血后新生血管和神經(jīng)發(fā)生，它還能促進(jìn)血管生成、存活和神經(jīng)原細(xì)胞從小鼠腦室室管膜下區(qū)向周圍區(qū)域遷移，但這些大腦修復(fù)機(jī)制的確切作用仍有待確定[10]。此外，不同的研究揭示了PC/APC在肥胖、肺炎、彌散性血管內(nèi)凝血、阿爾茨海默病、中風(fēng)等疾病中的潛在作用。

2.1 抗凝作用

APC的抗凝活性主要通過以下三種途徑：（1）APC在Ca2+存在時，在PS的協(xié)助下依賴其絲氨酸蛋白酶活性裂解FVa和FVIIIa的重鏈，降低其與磷脂的結(jié)合力，影響FII的形成，從而阻止凝血過程的發(fā)展；（2）FXa與血小板的結(jié)合需要FVa作為媒介，APC滅活FVa后阻礙了FXa與血小板的結(jié)合，對凝血級聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)[11]；（3）APC通過滅活纖溶酶原激活抑制物-1（PAI-1）的活性以及阻止TAFI的生成，進(jìn)而誘導(dǎo)t-PA的釋放，起到促纖溶作用。APC作為一種“按需”抗凝血劑，減少凝血酶的形成，它的抗凝活性還具有種專一性。血漿APC或PC水平的降低與靜脈血栓栓塞的風(fēng)險增加相關(guān)。據(jù)大樣本統(tǒng)計，PC系統(tǒng)的功能障礙是東北亞地區(qū)靜脈血栓性疾病發(fā)生的最主要的遺傳風(fēng)險因素[12-13]。

2.2 抗炎作用

APC可以直接抑制炎癥介質(zhì)的釋放而發(fā)揮直接抗炎作用，且不依賴于其抗凝活性，還可通過EPCR依賴性方式發(fā)揮間接抗炎作用。研究證明[14]，單核細(xì)胞上的Mac-1通過與EPCR的結(jié)合，可作為蛋白C發(fā)揮抗凝和抗炎作用的感受器，促使兩大生理功能相互協(xié)調(diào)整合，從而能夠更好地發(fā)揮保護(hù)機(jī)體的作用。多項體內(nèi)外研究表明[15-17]，APC的直接抗炎作用是通過下調(diào)炎癥因子、趨化因子以及黏附分子的表達(dá)，降低白細(xì)胞的趨化性、調(diào)節(jié)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用而達(dá)到的。

2.3 抗凋亡作用

APC可以直接改變細(xì)胞的基因表達(dá)，而不依賴其抗凝活性。APC可直接作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，NFKB信號傳導(dǎo)通路被阻斷，凋亡相關(guān)基因的mRNA及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)受抑，而抗凋亡基因表達(dá)增加，從而發(fā)揮抗凋亡作用。Domotor團(tuán)隊[18]的研究表明，APC的抗凋亡特性由絲氨酸蛋白酶功能區(qū)與EPCR及PAR-1信號通路共同參與，APC通過EPCR介導(dǎo)降解PAR-1，導(dǎo)致人腦內(nèi)皮細(xì)胞中的Ca2+內(nèi)流減少而起到抗細(xì)胞凋亡的作用。

2.4 APC與膿毒血癥

近年關(guān)于PC系統(tǒng)與膿毒血癥的報道中證實[19-20]，在膿毒血癥發(fā)生發(fā)展過程中，患者常合并凝血系統(tǒng)不同程度的功能紊亂，PC系統(tǒng)發(fā)揮了重要的作用。在病程發(fā)展的早期，表現(xiàn)為凝血系統(tǒng)的激活及血液呈高凝狀態(tài)，APC不僅發(fā)揮抗凝作用，還能有效改善微循環(huán)，增加供氧量，延緩器官衰竭；重癥時表現(xiàn)為彌散性血管內(nèi)凝血。同時，APC有對抗缺血/再灌注（I/R）損傷的作用。Schoots等[21]在腸I/R損傷模型中觀察到，APC通過抗凝和抗炎的聯(lián)合作用可減輕I/R的損傷，保護(hù)腸道屏障功能。Heuer[22]在大鼠膿毒癥動物模型中證實，動物在感染后20h，肝臟組織PC mRNA的表達(dá)明顯下降，轉(zhuǎn)錄水平選擇性地降低，PC表達(dá)下降，TM、EPCR下調(diào)均可引起循環(huán)血液中的APC濃度降低，從而加速膿毒癥的進(jìn)展。通過大量的活體動物實驗表明[23]，利用活化蛋白C治療可減少細(xì)胞因子的生成，抑制白細(xì)胞粘附，減輕病理損害的程度。APC對膿毒癥的防治作用，可能是抗凝、抗炎、改善微循環(huán)、保護(hù)器官等多種效應(yīng)協(xié)同作用的結(jié)果。APC具有細(xì)胞保護(hù)功能，它的治療用途已經(jīng)在嚴(yán)重膿毒癥中得到了評估，并且正在評估它在一些具有重要炎癥成分的疾病中的治療作用。

3 蛋白C系統(tǒng)各組分的分子缺陷

3.1 PC的分子缺陷

PC基因定位于2號染色體（2q13～q14），共有10 802個堿基，含有9個外顯子和8個內(nèi)含子?；蛲蛔兎N類300多，突變類型以常染色體顯性遺傳多見，也有隱性遺傳，且目前沒有發(fā)現(xiàn)明顯的種族及地區(qū)差異。臨床上將遺傳性PC缺陷癥分為兩型：I型中，PC活性和PC水平，二者均降低；II型中存在PC分子缺陷，僅PC活性下降，PC水平正常。在I型中，60%以上為錯義突變，由于這些氨基酸的置換導(dǎo)致PC與其他殘基相互作用被改變，干擾蛋白的折疊，致使蛋白快速地在細(xì)胞間降解。導(dǎo)致II型PC缺陷癥的突變均是錯義突變，突變多發(fā)生在蛋白的功能區(qū)。同時PC血漿水平還受基因多態(tài)性的調(diào)節(jié)[24-25]。

3.2 PS的分子缺陷

PS基因定位于3號染色體（3q11.1～3q11.2），由兩個高度同源性基因組成：PSα和PSβ。自1984年首次報道PS缺陷癥以來，迄今已報道的PS基因突變有200多種，為常染色體顯性遺傳。以I型雜合子型多見，在I型基因缺陷中已知有片段缺失、框架移位等，累及1～15外顯子。II型較為少見，其基因突變位于前肽的第一、二類表皮生長因子區(qū)。Hurtado等[26]分析12種與PS缺乏相關(guān)的天然PROS1突變在基因和蛋白質(zhì)表達(dá)上的功能相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PS缺乏的主要原因是突變蛋白質(zhì)的合成、穩(wěn)定性或分泌缺陷。目前關(guān)于PS缺陷的報道只局限于散在的病例研究，還有關(guān)于PS與PC的聯(lián)合缺陷的個案報道[27]，但都缺乏大規(guī)模的病例對照研究，其與血栓性疾病發(fā)病的相關(guān)性有待進(jìn)一步的探索。

3.3 TM及PCI的分子缺陷

多項研究表明[28-30]，TM基因的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)含有突變位點或基因多態(tài)性，與腦出血、冠狀動脈硬化以及血栓性疾病有密切關(guān)系，可溶性血栓調(diào)節(jié)蛋白濃度調(diào)節(jié)了腦梗死的風(fēng)險和預(yù)后。但具體的基因突變對生理功能的影響，由于樣本量的不足或是地域、種族差異，至今仍沒有統(tǒng)一結(jié)論的報道。目前關(guān)于PCI基因突變的研究主要集中在與生殖系統(tǒng)的關(guān)系上，突變導(dǎo)致基因表達(dá)的蛋白質(zhì)發(fā)生空間結(jié)構(gòu)上的變化，引起男性精子的產(chǎn)生、發(fā)育以及成熟均發(fā)生障礙，從而造成男性不育[31]。

3.4 EPCR的分子缺陷

人體EPCR基因位于20號染色體q11.2，包含3個內(nèi)含子和4個外顯子?；蛲蛔冇绊慐PCR蛋白分子的表達(dá)，依賴EPCR的PC活化功能受到損傷，可能與動靜脈血栓形成有關(guān)[32]。此外，基因多態(tài)性與蛋白表達(dá)的改變以及家族性和獲得性血栓性疾病有關(guān)，同時影響多種疾病，包括：瘧疾、膿毒癥、腫瘤、不良妊娠結(jié)局等的易感性[33-34]。目前報道的EPCR基因變異主要在內(nèi)含子1位點C2532T，外顯子3（6367位點）23bp嵌入，5’-UTR 1651C/G的多態(tài)性，內(nèi)含子2 6333C/T的多態(tài)性[35-36]等。目前關(guān)于EPCR的分子缺陷都是個別散在的報道，還有待收集大規(guī)模的樣本做進(jìn)一步的探索，對EPCR基因型的進(jìn)一步深入研究和對自身抗體的識別將有助于預(yù)估病患發(fā)生血栓性事件的發(fā)生率，繼而實行個體化治療。