亞低溫上調(diào)冷休克蛋白R(shí)BM3表達(dá)減輕腎臟缺血-再灌注損傷

宋克芹 肖琦 肖建生 羅凱鋒

腎移植是終末期腎病病人的首選治療方法[1]，腎移植的成功依賴于高質(zhì)量的供腎，供腎的缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是不可避免的，有研究表明IRI是急性腎損傷、移植腎功能延遲恢復(fù)和急慢性排斥反應(yīng)的危險(xiǎn)因素[2]。

近年來(lái)，應(yīng)用亞低溫（30～34 ℃）來(lái)減輕IRI越來(lái)越受到關(guān)注。過去多數(shù)研究認(rèn)為亞低溫減輕IRI與降低能量代謝有關(guān)，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體溫度降低時(shí)，生物體會(huì)產(chǎn)生一組蛋白來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化，通常我們稱此組蛋白為冷休克蛋白。RNA結(jié)合基序蛋白 3（RNA-binding motif protein 3，RBM3）是哺乳動(dòng)物重要的冷休克蛋白，在32～34 ℃條件下RBM3的表達(dá)量最高[3]。RBM3屬于應(yīng)激反應(yīng)蛋白，在其N段具有RNA結(jié)合區(qū)域，擁有一個(gè)保守的RNA識(shí)別基序，包含兩個(gè)核糖核蛋白結(jié)構(gòu)域[4]，在應(yīng)激反應(yīng)中，RBM3可以結(jié)合并改變信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，RBM3可與Yes相關(guān)蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，改變其穩(wěn)定性及翻譯效率[5]。YAP1是Hippo通路中最重要的效應(yīng)因子之一，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和器官再生的重要蛋白[6]。YAP1亦可上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的表達(dá)[7-8]，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是抗氧化和細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)的主調(diào)節(jié)因子。亞低溫減輕腎臟IRI與RBM3及其下游效應(yīng)分子YAP1的關(guān)系尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠雙側(cè)腎臟IRI模型并用亞低溫進(jìn)行預(yù)處理后，探討亞低溫對(duì)腎臟IRI的作用和RBM3及其下游效應(yīng)分子YAP1/Nrf2在這一過程的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

200～250 g的無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)雄性SD大鼠18只，購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，隨機(jī)分為正常對(duì)照（normal control，NC）組、IRI組和亞低溫預(yù)處理（mild hypothermia preconditioning，MHP）組，每組6只。本研究經(jīng)武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液套裝、脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司，β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、YAP1、B淋巴細(xì)胞瘤（B-cell lymphoma，Bcl）-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）一抗和相應(yīng)二抗均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，RBM3一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Nrf2一抗購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

主要儀器：智能恒溫控制儀購(gòu)自天津建科試驗(yàn)儀器廠，光學(xué)顯微鏡（光鏡）及熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司，低溫高速離心機(jī)購(gòu)自上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海培清科技有限公司。

1.3 模型建立和標(biāo)本獲取

IRI組大鼠用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥于有加熱墊的操作臺(tái)上，使體溫維持在（37±0.5）℃，沿腹中線剃毛并消毒，暴露腹腔后游離雙側(cè)腎蒂，用2-0縫線結(jié)扎阻斷腎動(dòng)、靜脈血流45 min后打開，關(guān)閉腹腔。MHP組大鼠麻醉和消毒同IRI組，用75%乙醇擦拭腹部快速降溫至32℃左右，使其體溫維持在（32±0.5）℃[9]，2 h后緩慢升溫至37℃左右，按前述方法建立腎臟IRI模型。NC組大鼠除了不阻斷腎動(dòng)、靜脈血流外，其余處理同IRI組。

術(shù)后自由進(jìn)食飲水，24 h后再次麻醉，收集血液標(biāo)本和腎臟組織，部分組織放液氮中保存、部分組織放4%多聚甲醛中固定后行HE染色。每組分別取6只大鼠的標(biāo)本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 血清肌酐水平檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清肌酐水平。

1.4.2 腎臟組織HE染色和病理?yè)p傷評(píng)分 腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。石蠟切片切成5 mm，按標(biāo)準(zhǔn)過程進(jìn)行HE染色[10]。光鏡下觀察和拍照。由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法對(duì)組織損傷程度進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：隨機(jī)選取10個(gè)無(wú)重疊的視野（×200），評(píng)分反映小管壞死、刷狀緣脫落、管型形成和小管擴(kuò)張的分級(jí)，分別為0分（無(wú)）、1分（≤10%）、2分（11%～25%）、3分（26%～45%）、4分（46%～75%）和5分（≥76%）[11]。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)組織蛋白 提取各組大鼠腎臟組織總蛋白后加入10%的分離膠中，電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉，置于1:1 000 的一抗（RBM3、YAP1、Nrf2、Bcl-2、Bax）溶液中4 ℃孵育過夜，洗滌后加入1:5 000的二抗溶液室溫孵育2 h，用超敏化學(xué)發(fā)光劑液在暗室中顯影，用β-actin作為內(nèi)參。采用Image J軟件定量分析各組RBM3、YAP1、Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量和Bcl-2/Bax比值。

1.4.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織蛋白 將石蠟切片進(jìn)行脫蠟水化和抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，過氧化氫孵育后封閉，滴加一抗RBM3（1:500）、YAP1（1:1 000）溶液4 ℃過夜，PBS洗滌，滴加1:1 000的二抗溶液室溫孵育50 min，PBS洗滌后滴加顯色液，蘇木素復(fù)染后封片，光鏡下觀察和拍照，觀察各組RBM3、YAP1陽(yáng)性細(xì)胞分布情況。

1.4.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 石蠟切片經(jīng)脫蠟水化，在切片上滴加TUNEL反應(yīng)液37℃孵育2 h，PBS洗滌后滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min，PBS洗滌后封片，使用熒光顯微鏡觀察并采集圖像，比較各組腎臟組織細(xì)胞凋亡率。

1.4.6 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 按照MDA和SOD檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，逐步加入樣本及試劑于96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值，分別計(jì)算各組MDA含量和SOD活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腎功能和腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)

NC組、IRI組、MHP組血清肌酐分別為（29.7±2.8）、（407.1±13.5）、（317.3±14.4）μmol/L，IRI組和MHP組血清肌酐水平均高于NC組，而MHP組血清肌酐水平低于IRI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）。腎臟組織HE染色結(jié)果顯示，NC組腎臟結(jié)構(gòu)基本正常，IRI組與MHP組均可見腎小管壞死，胞核固縮深染、碎裂或溶解，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)，皮髓質(zhì)交界處淤血，髓質(zhì)集合管擴(kuò)張，上皮扁平化，可見蛋白管型形成，MHP組腎臟組織小管壞死、淤血面積小于IRI組，且小管擴(kuò)張程度更輕、蛋白管型形成更少（圖1A）；NC組、IRI組、MHP組腎臟組織病理?yè)p傷評(píng)分分別為（0.78±0.12）、（4.57±0.29）、（3.03±0.60）分，IRI組和MHP組病理?yè)p傷評(píng)分均高于NC組，而MHP組評(píng)分低于IRI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05，圖1B），提示亞低溫預(yù)處理對(duì)腎臟IRI具有保護(hù)作用。

2.2 各組大鼠腎臟組織蛋白表達(dá)水平

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組比較，IRI組和MHP組RBM3、YAP1和Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高（均為P＜0.05），并且MHP組較IRI組更高（均為P＜0.05）；與NC組比較，IRI組和MHP組Bcl-2/Bax比值均降低（均為P＜0.05），MHP組Bcl-2/Bax比值較IRI組升高（P＜0.05），提示亞低溫預(yù)處理可上調(diào)RBM3、YAP1、Nrf2蛋白表達(dá)和Bcl-2/Bax比值（圖2）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，NC組RBM3和YAP1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最少，MHP組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多，IRI組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量位于二者之間，提示亞低溫預(yù)處理可上調(diào)RBM3與YAP1蛋白的表達(dá)（圖3）。

圖2 各組大鼠腎臟組織蛋白表達(dá)水平比較Figure 2 Comparison of protein expression levels in kidney tissues of rats among each group

圖3 各組大鼠腎臟組織RBM3和YAP1陽(yáng)性細(xì)胞分布情況（免疫組織化學(xué)，×200）Figure 3 Distribution of RBM3 and YAP1 positive cells in kidney tissues of rats among each group

2.3 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡情況

TUNEL染色結(jié)果顯示，NC組、IRI組、MHP組腎臟組織細(xì)胞凋亡率分別為（0.76±0.15）%、（10.42±0.42）%、（3.79±0.33）%，IRI組和MHP組細(xì)胞凋亡率均高于NC組（均為P＜0.05），MHP組細(xì)胞凋亡率低于IRI組（P＜0.05），提示亞低溫預(yù)處理可減輕腎臟IRI引起的細(xì)胞凋亡（圖4）。

圖4 各組大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡率比較Figure 4 Comparison of the apoptosis rate in kidney tissues of rats among each group

2.4 各組大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激水平

MDA含量檢測(cè)結(jié)果顯示，NC組、IRI組、MHP組MDA含量分別為（0.52±0.07）、（1.38±0.03）、（0.80±0.06）nmol/mg，IRI組 和 MHP組 MDA 含量均高于NC組，MHP組MDA含量低于IRI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）。SOD活性檢測(cè)結(jié)果顯示，NC組、IRI組、MHP組SOD活性分別為（1 060±63）、（499±28）、（833±54）U/mg，IRI組和MHP組SOD活性均低于NC組，MHP組SOD活性高于IRI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）。提示亞低溫預(yù)處理可減輕腎臟IRI所致氧化應(yīng)激損傷并增強(qiáng)抗氧化能力（圖5）。

圖5 各組大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激水平比較Figure 5 Comparison of oxidative stress levels in kidney tissues of rats among each group

3 討 論

IRI是腎移植過程不可避免的損傷，這是影響移植物長(zhǎng)期存活的重要因素。IRI主要是血流再灌注后組織內(nèi)黃嘌呤氧化酶生成的氧自由基引起的，另外再灌注時(shí)，細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步加重鈣超載，Ca2+濃度增加還可以使磷脂酶、蛋白酶激活，導(dǎo)致細(xì)胞不可逆性損傷[12]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直在尋找能夠減輕IRI的方法，這些措施包括缺血預(yù)處理、缺血后處理、藥物處理、基因調(diào)控以及機(jī)械灌注等[13-18]。

近年來(lái)，應(yīng)用亞低溫來(lái)減輕器官組織IRI越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注。亞低溫治療是指將病人的體溫降至30～34 ℃而達(dá)到預(yù)防或治療疾病目的的方法，應(yīng)用亞低溫預(yù)防組織IRI已有很多的研究報(bào)道[19]。亞低溫治療在實(shí)驗(yàn)性腦卒中模型和卒中病人中被公認(rèn)為有效的神經(jīng)保護(hù)方法，并擴(kuò)展了其他神經(jīng)保護(hù)劑的治療窗口[20]。在肝臟IRI動(dòng)物模型中，亞低溫預(yù)處理可以減輕肝臟IRI所致線粒體損傷和氧化應(yīng)激損傷[21-22]。在本實(shí)驗(yàn)中，MHP組的血清肌酐水平及腎臟組織病理?yè)p傷評(píng)分均低于IRI組，證實(shí)了亞低溫預(yù)處理對(duì)腎臟組織IRI具有保護(hù)作用。亞低溫對(duì)IRI保護(hù)作用的機(jī)制可能不僅僅與降低能量代謝有關(guān)，當(dāng)生物體溫度下降時(shí)會(huì)產(chǎn)生RBM3蛋白，當(dāng)體溫為32℃時(shí)可誘導(dǎo)其高表達(dá)[3]。RBM3不僅在低溫環(huán)境下表達(dá)量上升，在一些癌癥組織以及低氧環(huán)境中表達(dá)也會(huì)上調(diào)[23-24]。在本實(shí)驗(yàn)中，MHP組RBM3蛋白表達(dá)量高于IRI組，提示腎臟組織在缺氧和亞低溫環(huán)境的雙重刺激下誘導(dǎo)了RBM3蛋白高表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)RBM3可以與YAP1的mRNA 3’-非翻譯區(qū)相結(jié)合，控制其轉(zhuǎn)錄和翻譯，YAP1是RBM3蛋白的靶蛋白之一[5]。YAP1蛋白是Hippo通路中最重要的效應(yīng)因子之一，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和器官再生的重要蛋白[6]。以往研究顯示，YAP1在前列腺癌、胰腺癌、膽囊癌以及胃癌等多種腫瘤中表達(dá)異常升高，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的功能[25-28]。在本實(shí)驗(yàn)中，YAP1蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與RBM3一致，二者在MHP組表達(dá)量最高；同時(shí)，MHP組細(xì)胞凋亡率明顯低于IRI組，提示亞低溫預(yù)處理可減少細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax比值升高，表明細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)，其作用機(jī)制可能為亞低溫通過上調(diào)RBM3和YAP1蛋白抑制細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激損傷是IRI的另一重要病理生理過程，氧化應(yīng)激損傷是由血流再灌注后組織內(nèi)黃嘌呤氧化酶生成的氧自由基引起的，當(dāng)體內(nèi)氧自由基的生成量超過體內(nèi)抗氧化防御機(jī)制則會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。MDA是IRI誘導(dǎo)的線粒體損傷的標(biāo)志[29]，SOD是抗氧化防御機(jī)制的重要組成部分，有利于過氧化物的去除和還原[30]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過檢測(cè)MDA含量和SOD活性來(lái)評(píng)估氧化應(yīng)激損傷，結(jié)果顯示MHP組的MDA含量較IRI組明顯下降，SOD活性較IRI組明顯升高，提示亞低溫處理可降低MDA含量和提升SOD活性，表明亞低溫治療可以減輕大鼠腎臟IRI的氧化損傷并改善抗氧化防御系統(tǒng)。但亞低溫減輕氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制尚不明確，是否與亞低溫誘導(dǎo)的YAP1蛋白相關(guān)？在卵巢癌和膀胱癌化學(xué)藥物治療耐藥的研究中發(fā)現(xiàn)，YAP1的表達(dá)上調(diào)伴隨著Nrf2的表達(dá)增加，而沉默YAP1的表達(dá)伴隨著Nrf2的表達(dá)下調(diào)，并且YAP1表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞的抗氧化活性降低[6-7]。轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是抗氧化和細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)的主調(diào)節(jié)因子。在生理?xiàng)l件下，Nrf2會(huì)降解，細(xì)胞氧化應(yīng)激觸發(fā)Keap1 Nrf2復(fù)合體的構(gòu)象變化，從而阻止Nrf2的降解，未降解的Nrf2與小Maf蛋白形成異二聚體，并通過抗氧化反應(yīng)元件/親電反應(yīng)元件激活靶基因以保護(hù)細(xì)胞[31-32]。在本實(shí)驗(yàn)中，Nrf2的表達(dá)與YAP1的表達(dá)趨勢(shì)一致，結(jié)合YAP1的表達(dá)趨勢(shì)又與RBM3相一致，說(shuō)明亞低溫減輕氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制可能是通過RBM3/YAP1/Nrf2通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，亞低溫預(yù)處理對(duì)腎臟IRI具有保護(hù)作用，可減輕IRI所致細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制可能通過誘導(dǎo)RBM3及其下游分子YAP1/Nrf2蛋白表達(dá)上調(diào)來(lái)實(shí)現(xiàn)，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步論證。本研究為亞低溫預(yù)處理減輕IRI提供了新的見解，為減輕供腎IRI提供了潛在的新的分子靶點(diǎn)。