復(fù)方丹參片含量測(cè)定與化學(xué)模式識(shí)別研究

崔新剛 王穎瑩 王新勝

【摘 要】 目的：通過(guò)化學(xué)模式識(shí)別研究，評(píng)價(jià)復(fù)方丹參片的質(zhì)量。方法：采用HPLC法對(duì)復(fù)方丹參片中丹參酮IIA、丹酚酸B、三七皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1及人參皂苷Re進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)合聚類(lèi)分析、主成分分析及正交偏最小二乘判別分析對(duì)復(fù)方丹參片質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：主成分分析和聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致，正交偏最小二乘判別分析法結(jié)果表明不同廠家復(fù)方丹參片的指標(biāo)成分含量存在差異。結(jié)論：化學(xué)模式識(shí)別可為不同廠家復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制提供參考。

【關(guān)鍵詞】 HPLC;指標(biāo)成分;化學(xué)模式識(shí)別

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）16-0039-06

Chemical Component Analysis and Chemical Pattern Recognition from Compound Danshen Tablet

CUI Xingang1 WANG Yingying2 WANG Xinsheng3

1.Luoyang Maternal and Child Health Hospital，Luoyang 471023，China;

2.School of Chemical Engineering and Pharmaceuticals， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023，China;

3.Luoyang Food and Drug Inspection Institute，Luoyang 471023，China

Abstract： Abstract Objective The quality of compound Danshen tablets from different manufacturers was evaluated using chemical pattern recognition.Methods The contents of tanshinone IIA， salvianolic acid B， and panax notoginseng saponins were determined using HPLC method.Principal components analysis， cluster analysis and orthogonal partial least square-discriminate analysis were performed using IBM SPSS 18.0 Statistics software and SIMCA-P 14.5 software.Results The results of principal components analysis and cluster analysis showed that the samples from the same manufacturer could be clustered into one category.The results of orthogonal partial least square-discriminate analysis showed the contents of index compounds were different from different manufacturers.Conclusions The results of chemical pattern recognition can offer reference for quality control of compound Danshen tablet.

Keywords：HPLC;Index Compounds;Chemical Pattern Recognition

復(fù)方丹參片系由丹參、三七、冰片組成的中藥復(fù)方制劑，具有活血化瘀，理氣止痛作用，為《中國(guó)藥典》2015版收載的成方制劑[1]。主治氣滯血瘀所致的胸痹，癥見(jiàn)胸悶、心前區(qū)刺痛;冠心病心絞痛[2]。目前，我國(guó)已有數(shù)家藥廠的復(fù)方丹參片投放市場(chǎng)，但臨床反映不同廠家復(fù)方丹參片的療效存在明顯差異?；瘜W(xué)成分研究顯示不同廠家復(fù)方丹參片中有效成分含量差異顯著[3-4]。為了評(píng)價(jià)不同廠家復(fù)方丹參片的質(zhì)量差異，陳永等[5]測(cè)定三七中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量，評(píng)價(jià)復(fù)方丹參片質(zhì)量。馬啟武[6]測(cè)定復(fù)方丹參片中丹參酮IIA、丹酚酸B的含量，比較其質(zhì)量差異?，F(xiàn)有報(bào)道中提到的評(píng)價(jià)方法常以其中一味藥評(píng)價(jià)其質(zhì)量，通常為方中的君藥或臣藥，不能全面反映其質(zhì)量差異。本研究參考《中國(guó)藥典》2015年版中對(duì)復(fù)方丹參片的檢測(cè)方法，在《中國(guó)藥典》檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，將丹參酮IIA、丹酚酸B及三七總皂苷含量作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。為了更好的綜合比較、評(píng)價(jià)不同廠家復(fù)方丹參片的質(zhì)量，本研究以復(fù)方丹參片中丹參酮IIA、丹酚酸B、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、三七皂苷R1及人參皂苷Re為指標(biāo)，進(jìn)行聚類(lèi)分析、主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，旨在為其質(zhì)量控制提供依據(jù)和參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1200型高效液相色譜儀，包括G1315B型二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)安捷倫科技有限公司）;KQ-100ES超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;賽多利斯BSA8201電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）;易普易達(dá)Smart-S2型超純水機(jī)（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥品與試劑 丹參酮ⅡA對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110766-201816）;丹酚酸B對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111562-201702）;人參皂苷Rg1對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：l10703-201728）;人參皂苷Rb1對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110704-201722）;三七皂苷R1對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110745-201614）;人參皂苷Re對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110754-201823）。樣品分別購(gòu)于不同廠家共10批次，每個(gè)廠家購(gòu)買(mǎi)2個(gè)批次，分別為北京A公司（批號(hào)：20190933;20190331，編號(hào)S1-2）、廣州的B公司（批號(hào)：L18A011;L18A017，編號(hào)S3-4）、云南的C公司（批號(hào)：201811;201910，編號(hào)S5-6）、湖北的D公司（批號(hào)：20190910;20190814，編號(hào)S7-8）、上海的E公司（批號(hào)：201906107;201811027，編號(hào)S9-10）。甲醇、乙腈為色譜純（天津天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）;甲酸為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Sysmetry C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫：25 ℃;流速：1.0 mL·min-1;流動(dòng)相：甲醇-水（73：27）;進(jìn)樣量：10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm。

2.1.2 對(duì)照品制備 精密稱(chēng)取丹參IIA對(duì)照品適量，置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含對(duì)照品40 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品制備 取本品10片，糖衣片需先除去糖衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)粉，取約1 g細(xì)粉，置于具塞棕色瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定重量。將所制得供試品溶液進(jìn)行超聲處理（功率250W，頻率33kHz）15 min，放冷，再次稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，置棕色瓶中，即得供試品溶液。

2.1.4 方法學(xué)考察[2]

2.1.4.1 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方丹參片（批號(hào)：20190933、L18A011、201811、20190910、2019061 07，即S1、S3、S5、S7、S9）按供試品溶液的制備方法分別平行制備6份供試品溶液，按2.1.1色譜條件檢測(cè)丹參酮IIA的平均含量，結(jié)果見(jiàn)表1，表明本方法重復(fù)性良好，精密度較高。

2.1.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取復(fù)方丹參片（批號(hào)：20190933、L18A011、201811、20190910、201906107）供試品溶液，按本試驗(yàn)色譜條件分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算丹參酮IIA峰面積RSD，結(jié)果見(jiàn)表1，表明本方法穩(wěn)定性良好。

2.1.4.3 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量復(fù)方丹參片樣品（批號(hào)：20190933、L18A011、201811、20190910、201906107），分別加入一定量的對(duì)照品溶液后，測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1，回收率良好。

2.1.5 樣品測(cè)定 按2.1.3制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，按2.1.1色譜條件，分別測(cè)定10個(gè)樣品中的丹參酮IIA，以外標(biāo)法計(jì)算含量。色譜圖見(jiàn)圖1，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 丹酚酸B的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Sysmetry C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫：25 ℃;流速：1.0 mL·min-1;流動(dòng)相：乙腈-甲醇-甲酸-水（10∶30∶1∶59）;進(jìn)樣量：10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm。

2.2.2 對(duì)照品制備 精密稱(chēng)取丹酚酸B對(duì)照品適量，置于棕色量瓶中，加水制成每1 mL含對(duì)照品60 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品制備 取本品10片，糖衣片需先除去糖衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)粉，取0.15 g細(xì)粉，置于50 mL棕色量瓶中，加水適量，將所制得供試品溶液進(jìn)行超聲處理（功率300W，頻率50kHz）30 min，放冷，加水至刻度，搖勻，離心機(jī)離心，取上清液，即得供試品溶液。

2.2.4 方法學(xué)考察 按照2.1.4方法，結(jié)果見(jiàn)表1，表明本方法重復(fù)性良好，精密度較高，穩(wěn)定性良好，回收率良好。

2.2.5 樣品測(cè)定 按2.1.4樣品測(cè)定方法。色譜圖見(jiàn)圖2，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 三七總皂苷的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Sysmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫：25 ℃;流速：1.0 mL·min-1;流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以水為流動(dòng)相B，按規(guī)定條件進(jìn)行梯度洗脫，詳見(jiàn)表2;進(jìn)樣量：10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm。

2.3.2 對(duì)照品制備 精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品、三七皂苷R1對(duì)照品及人參皂苷Re對(duì)照品適量，加70%甲醇制成每1 mL含人參皂苷Rg1及人參皂苷Rb1各0.2 mg，三七皂苷R1及人參皂苷Re各0.05 mg的混合溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品制備 取本品10片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)粉，取約1 g，精密稱(chēng)定，精密加入70%甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，將所制得供試品溶液進(jìn)行超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。。

2.3.4 方法學(xué)考察 按照2.1.4.方法，結(jié)果見(jiàn)表1，表明本方法重復(fù)性良好，精密度較高，穩(wěn)定性良好，回收率良好。

2.3.5 樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖3，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 主成分分析 以10批復(fù)方丹參片中的指標(biāo)成分含量測(cè)定結(jié)果為變量，運(yùn)用SPSS Statistics 18.0軟進(jìn)行主成分分析，計(jì)算成分特征值、貢獻(xiàn)率及累計(jì)貢獻(xiàn)率，前2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為96.692%，可以反映復(fù)方丹參片質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)表3。將10批復(fù)方丹參片中指標(biāo)成分含量結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P 14.5軟件，得分矩陣圖見(jiàn)圖4。S1～2為一類(lèi)，S3～6為一類(lèi)，S7～10為一類(lèi)。

2.5 聚類(lèi)分析 以復(fù)方丹參片的指標(biāo)成分含量結(jié)果為變量，運(yùn)用SPSS Statistics 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用組間連接法，以歐式平方距離為度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖可知在組間距為25時(shí)，10批樣品分為3類(lèi)，S1～2為一類(lèi)，S3～6為一類(lèi)，S7～10為一類(lèi)，該結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致。

2.6 正交偏最小二乘判別分析 以含量測(cè)定結(jié)果為變量，導(dǎo)入SIMCA-P1 14.5軟件，進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析，模型參數(shù)為R2X為1，R2Y為0.892，Q2為0.312，說(shuō)明矩陣良好，得分矩陣圖見(jiàn)圖6。分類(lèi)結(jié)果與主成分分析、聚類(lèi)分析結(jié)果一致。以VIP值大于1位標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到指標(biāo)成分三七皂苷R1、丹酚酸B和人參皂苷Re為復(fù)方丹參片的差異組分，見(jiàn)表3。

3 討論

復(fù)方丹參片為我國(guó)的現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑，是常用臨床藥。表1可知，不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片都符合《中國(guó)藥典》2015版標(biāo)準(zhǔn)，每片含丹參酮ⅡA不得少于0.20 mg，丹酚酸B不得少于5.0 mg，人參皂苷Rg1、人參皂苷 Rb1、三七皂苷R1及人參皂苷Re的總量不得少于6.0 mg。但主成分分析和聚類(lèi)分析結(jié)果表明，不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方丹參片間存在一定的差異，正交偏最小二乘判別分析結(jié)果表明三七皂苷R1、丹酚酸B和人參皂苷Re是控制復(fù)方丹參片的關(guān)鍵成分。

基于主成分分析和聚類(lèi)分析結(jié)果，同一廠家不同批次的樣品聚為一類(lèi)，說(shuō)明同一廠家化學(xué)組分差異較小，質(zhì)量較穩(wěn)定。由圖4～5可知，不同廠家如兩個(gè)廠家編號(hào)S3～4與S5～6，廠家S7～8與廠家S9～10復(fù)方丹參片聚為一類(lèi)，結(jié)果表明這些生產(chǎn)廠家可能在原料來(lái)源和生產(chǎn)工藝具有類(lèi)似之處。本研究獲得的結(jié)果為復(fù)方丹參片的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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（收稿日期：2021-01-18 編輯：劉 斌）

基金項(xiàng)目：河南科技大學(xué)青年基金項(xiàng)目（2014QN010）。

作者簡(jiǎn)介：崔新剛（1986-），男，漢族，碩士，研究方向?yàn)橹兴幖爸兴幣浞筋w粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：cuixingang5207@163.com