紅鰭東方鲀的MAPK信號(hào)通路分析

王冠 胡子文 周金旭 王盛南 李鑫 仇雪梅 王秀利

摘 要：為研究紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）不同生長(zhǎng)階段生長(zhǎng)發(fā)育差異的分子機(jī)制，基于13與15月齡紅鰭東方鲀的腦與肌肉組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以及在兩時(shí)期間KEGG通路分析中差異顯著的MAPK信號(hào)通路，結(jié)合基因互作分析對(duì)這期間發(fā)生的生物過(guò)程進(jìn)行生物信息學(xué)方面的關(guān)聯(lián)預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：MAPK信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)fos和jun及其下游基因，促進(jìn)這期間肌肉和骨骼發(fā)育，使紅鰭東方鲀?cè)趦蓵r(shí)期間生長(zhǎng)。而fos和jun在兩組織均上調(diào)，但在腦中抑制fos和jun的基因上調(diào)程度更高，而在肌肉中則較低。MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的egr1、c/ebpβ、ctgf等基因與骨骼發(fā)育相關(guān)，在此期間可能伴隨著紅鰭東方鲀骨骼的生長(zhǎng)。MAPK信號(hào)通路還調(diào)節(jié)tgf-β、ctgf、pai1等與組織纖維化相關(guān)的基因，在轉(zhuǎn)錄層面上纖維化過(guò)程在肌肉中持續(xù)而在腦中減弱，可能促進(jìn)了肌肉與骨骼的發(fā)育。MAPK信號(hào)通路還可能影響脂質(zhì)代謝，即腦中γ-氨基丁酸相關(guān)基因下調(diào)有促進(jìn)脂肪積累的作用，該過(guò)程伴隨著基礎(chǔ)代謝降低。肌肉中核受體亞家族D組（nr1d）基因的下調(diào)促進(jìn)了脂質(zhì)吸收，mstn b基因可能調(diào)節(jié)了這個(gè)過(guò)程。

關(guān)鍵詞：紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）;組織差異基因;MAPK信號(hào)通路;生物信息分析

紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）是國(guó)內(nèi)北方重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，是出口創(chuàng)匯的主要海珍品[1]。但由于在北方養(yǎng)殖的紅鰭東方鲀商品魚(yú)不能當(dāng)年育成[2]，養(yǎng)殖需經(jīng)歷三個(gè)階段，幼魚(yú)魚(yú)苗在5—6月份至10—11月份時(shí)期;11月份至翌年4月份時(shí)期;翌年4月份至10—11月份的養(yǎng)成期。而在養(yǎng)成期的4—6月，雖水溫回升，魚(yú)體活躍，但生長(zhǎng)依然緩慢。由于紅鰭東方鲀?cè)诩棺祫?dòng)物中基因組較小，較易于分析其基因間的關(guān)系，因此紅鰭東方鲀?yōu)榧棺祫?dòng)物模式物種之一[3]。因而研究紅鰭東方鲀?cè)诰徛L(zhǎng)時(shí)期的分子變化，不僅可以了解到這一時(shí)期的生命活動(dòng)，探求縮短緩慢生長(zhǎng)時(shí)期，節(jié)約養(yǎng)殖成本增加收益的方法，同時(shí)可以為應(yīng)用于其它物種提供一定的參考。

腦部存在大量神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，可控制垂體等內(nèi)分泌器官調(diào)節(jié)激素分泌，進(jìn)而影響個(gè)體的生長(zhǎng)代謝。而肌肉則是可以直接反映生長(zhǎng)性狀的組織，有多數(shù)生長(zhǎng)相關(guān)激素受體存在。因此通過(guò)比較研究這兩個(gè)與生長(zhǎng)性狀密切相關(guān)組織的基因表達(dá)差異及對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路之間的關(guān)聯(lián)，有助于了解影響生長(zhǎng)性狀的生理過(guò)程及其涉及到的生化反應(yīng)。

信號(hào)通路是指能將細(xì)胞外的分子信號(hào)經(jīng)細(xì)胞膜傳入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)的一系列酶促反應(yīng)通路。這些細(xì)胞外的分子信號(hào)（即配體）可與位于細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部的受體結(jié)合，引起受體的構(gòu)象變化，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)的進(jìn)一步傳遞。每個(gè)細(xì)胞對(duì)特定的細(xì)胞外信號(hào)分子做出不同反應(yīng)，使它們得以共同完成生命活動(dòng)。而絲裂原活化蛋白激酶（MAPK，Mitogen-activated protein kinase）信號(hào)通路，是一種重要的信號(hào)通路，可由多種信號(hào)激活酪氨酸激酶受體，在激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)后引發(fā)轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞增殖、分化和遷移。因此在MAPK信號(hào)通路上腦與肌肉兩組織的差異可反應(yīng)這期間發(fā)生的生命活動(dòng)。

本研究基于腦、肌肉轉(zhuǎn)錄組的差異基因通過(guò)MAPK信號(hào)通路以及差異基因互作，分析紅鰭東方鲀?cè)诰徛L(zhǎng)的期間兩個(gè)組織在關(guān)鍵的表達(dá)及信號(hào)通路上的差異，以期發(fā)現(xiàn)這個(gè)過(guò)程中影響紅鰭東方鲀生長(zhǎng)的分子變化及生物過(guò)程，為紅鰭東方鲀發(fā)育過(guò)程及生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

本研究是基于本實(shí)驗(yàn)室的紅鰭東方鲀腦和肌肉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[4]進(jìn)行的后續(xù)分析。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)自健康的（13月齡與15月齡）實(shí)驗(yàn)魚(yú)的腦與肌肉組織，并使用RNA-Seq基因組比對(duì)軟件HISAT2 v2.0.5將過(guò)濾后的序列讀長(zhǎng)（reads）與紅鰭東方鲀參照基因組（FUGU 5）進(jìn)行比對(duì)（mapping）后使用StringTie v1.3.3b軟件進(jìn)行組裝。并以|log2（FoldChange）| > 1 &padj< 0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因，log2（FoldChange）>1為上調(diào)，反之為下調(diào)。通過(guò)超幾何分布原理進(jìn)行富集分析，在富集分析中發(fā)現(xiàn)KEGG（京都基因與基因組百科全書(shū)，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路中MAPK信號(hào)通路具有顯著性（padj<0.05），且與生長(zhǎng)相關(guān)，富集分析圖見(jiàn)王盛南等[4]。因而本文基于該通路對(duì)紅鰭東方鲀?cè)撾A段生長(zhǎng)的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2 性狀測(cè)量

分別測(cè)量13月齡與15月齡紅鰭東方鲀各30尾樣品的體重、體長(zhǎng)和體全長(zhǎng)，使用SPSS19進(jìn)行單因素方差分析，分析這兩時(shí)期這些性狀的差異性。

1.3 差異基因篩選

在前期工作的基礎(chǔ)上[4]，將差異基因進(jìn)一步匯總分析。比較兩組織之間隨時(shí)間變化的差異基因?？烧业桨ㄖ辉谀X或肌肉表達(dá)的差異基因，兩組織中隨時(shí)間表達(dá)趨勢(shì)相同的差異基因，以及兩組織隨時(shí)間表達(dá)趨勢(shì)相反的差異基因等幾類(lèi)，這些差異基因的篩選有助于判斷腦與肌肉這兩組織中，代謝過(guò)程中的相同及差異。

1.4 差異基因互作分析

以上述兩組織之間隨時(shí)間變化的差異基因?yàn)榉治鰧?duì)象，使用STRING 11.0（https：//string-db.org/）在線(xiàn)分析基因產(chǎn)物之間的互作，構(gòu)建蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置最低互作置信值為 0.400，并使用k-means聚類(lèi)的方法對(duì)差異基因?qū)?yīng)的蛋白產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩時(shí)期性狀分析

性狀測(cè)量結(jié)果顯示，13月齡紅鰭東方鲀平均體重（0.46±0.07）kg，平均體長(zhǎng)為（23.68±1.27）cm，平均體全長(zhǎng)為（28.37±1.55）cm;而15月齡平均體重（0.53±0.07）kg，平均體長(zhǎng)為（25.33±1.00）cm，平均體全長(zhǎng)為（29.98±1.24）cm。這些性狀15月齡較13月齡差異均極顯著，P<0.01。體重、體長(zhǎng)和體全長(zhǎng)分別平均增長(zhǎng)14.93%、6.97%及5.70%。

2.2 MAPK信號(hào)通路

KEGG通路分析中，15月齡相對(duì)13月齡的腦組織MAPK信號(hào)通路是與生長(zhǎng)相關(guān)的顯著性最高的信號(hào)通路，通路圖如圖1A（封二）所示，富集到的差異基因也是具顯著性的通路中最多的，有24個(gè)差異基因[4]。其中上調(diào)基因有20個(gè)，因而腦組織MAPK信號(hào)通路顯著性主要是由上調(diào)基因引起，而下調(diào)的基因很少，只有4個(gè)。且由通路圖可知，與增殖分化相關(guān)的基因上調(diào)且包括nr4a1（對(duì)應(yīng)圖1A中Nur77，產(chǎn)物為神經(jīng)生長(zhǎng)因子IB，NGFIB）以及屬于激活蛋白1（Activator protein 1，AP-1）家族的fos（封二圖1A中c-fos）、jun（封二圖1A中c-JUN）及jund。而抑制fos上游基因ERK（細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶）的MKP（MAPK磷酸酶，又稱(chēng)DUSP）的基因也上調(diào)，且上調(diào)程度較fos更高，對(duì)應(yīng)的差異基因包括dusp1、dusp2、dusp6，這些基因全部是上調(diào)基因。而dusp2的產(chǎn)物也有抑制JNK（c-Jun N-末端激酶）的功能。JNK的基因作為jun與jund的上游基因也被上調(diào)程度更大的HSP72（熱激蛋白72）相關(guān)基因抑制。

而在15月齡相對(duì)13月齡的肌肉組織中MAPK通路見(jiàn)圖1B（封二），有15個(gè)差異基因，因其差異基因占該通路表達(dá)的基因較少，使得該通路差異不顯著。在差異基因中上調(diào)基因有12個(gè)，下調(diào)基因只有3個(gè)。而fos、jun及jund這三個(gè)與增殖分化相關(guān)的基因也在肌肉中上調(diào)，相較于腦中不同的是，在上游抑制它們的圖1B（封二）中MKP與HSP72中的基因上調(diào)程度較小，上調(diào)的基因也少，并且圖1B（封二）中MKP的dusp10隨時(shí)間下調(diào)，這些因素可能是肌肉中fos上調(diào)程度較大的原因。而紅鰭東方鲀?cè)趦蓵r(shí)期間體重、體長(zhǎng)和體全長(zhǎng)性狀顯著增加，這些性狀的改變伴隨著肌肉量的增加。因而，有增殖分化相關(guān)作用的fos、jun等上調(diào)基因，可能是這兩時(shí)期間影響肌肉組織生長(zhǎng)，進(jìn)而引起這期間的性狀差異的重要基因。

2.3 兩組織間的關(guān)鍵差異基因分析

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組織間只在腦組織表達(dá)的差異基因有86個(gè)，其中有75個(gè)隨時(shí)間下調(diào)，其余隨時(shí)間上調(diào)。在兩月齡時(shí)期間相較于腦，僅在肌肉中有差異表達(dá)的基因則只有3個(gè)，其中有1個(gè)隨時(shí)間上調(diào)，為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶1（SET and MYND domain containing 1，smyd1），研究發(fā)現(xiàn)該基因有心肌和骨骼肌的組織特異性[5]，在對(duì)小鼠[6]和斑馬魚(yú)[7]的研究中發(fā)現(xiàn)，smyd1是調(diào)節(jié)心肌和骨骼肌發(fā)育的關(guān)鍵因子，但未發(fā)現(xiàn)其對(duì)應(yīng)的KEGG通路;另2個(gè)下調(diào)，其中一個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的基因，該基因沒(méi)有與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)匹配的注釋?zhuān)涔δ芪粗硪粋€(gè)為蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基3A（Protein phosphatase 1 regulatory subunit 3A，ppp1r3a）。隨時(shí)間變化，在兩組織同時(shí)上調(diào)表達(dá)的差異基因有22個(gè)基因，而同時(shí)下調(diào)基因有4個(gè)。此外，還有3個(gè)基因在腦中下調(diào)，而在肌肉中上調(diào)，分別是肌生長(zhǎng)抑制素b（Myostatin b，mstnb）、radical S-adenosyl methionine domain containing 2（rsad2）和甘油3-磷酸脫氫酶（Glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1，gpd1）。

2.4 差異基因互作分析結(jié)果

針對(duì)上述腦、肌肉兩組織在兩時(shí)期不同關(guān)聯(lián)的基因，可找到包括在腦中隨時(shí)間下調(diào)而在肌肉中不表達(dá)的基因，腦中隨時(shí)間上調(diào)而在肌肉中不表達(dá)的基因，肌肉組織中有差異而在腦中不表達(dá)的基因，兩組織中隨時(shí)間表達(dá)趨勢(shì)相同的差異基因，以及兩組織隨時(shí)間表達(dá)趨勢(shì)相反的差異基因，將這五類(lèi)進(jìn)行互作分析及聚類(lèi)。我們發(fā)現(xiàn)兩時(shí)期在腦組織下調(diào)表達(dá)而在肌肉中不表達(dá)差異基因有60個(gè)，并出現(xiàn)了兩個(gè)與功能相關(guān)的聚類(lèi)，見(jiàn)圖2（封三），分別與光轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖中示藍(lán)色）和γ-氨基丁酸相關(guān)（圖中示綠色），見(jiàn)圖2（封三）;而在兩組織中隨時(shí)間表達(dá)趨勢(shì)相同的差異基因有23個(gè)被識(shí)別，是與AP-1相關(guān)的一個(gè)聚類(lèi)，見(jiàn)圖3（封三），而其他的分類(lèi)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因產(chǎn)物間的互作。

3 討論

3.1 MAPK信號(hào)通路在兩組織之間的差異

基于腦與肌肉兩組織MAPK信號(hào)通路圖中可以發(fā)現(xiàn)，與增殖分化相關(guān)的基因包括fos、jun及jund在兩組織均上調(diào)表達(dá)，而肌肉中有抑制這些基因功能的MKP與HSP72的相關(guān)基因上調(diào)程度較小，對(duì)應(yīng)差異基因也少。其中MKP對(duì)MAPK起負(fù)調(diào)控作用[8]，而肌肉中dusp10隨時(shí)間下調(diào)，降低了對(duì)ERK及JNK的抑制，可促進(jìn)fos、jun的表達(dá)。而HSP72作為一種熱激蛋白，可以促進(jìn)DNA修復(fù)，并在細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)和分化過(guò)程中發(fā)揮功能[9]。

通路中兩組織差異最大的是gadd45，有4個(gè)屬于該類(lèi)的基因在腦中上調(diào)表達(dá)，而在肌肉中則并無(wú)顯著性。而gadd45功能與生長(zhǎng)停滯和刺激DNA修復(fù)有關(guān)[10]，并可能是腦中taok3基因（TAO基因集內(nèi)）下調(diào)表達(dá)的原因（封二圖1A），TAOK3是一種MAPKKK（絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶又稱(chēng)MAP3K），被證明是成骨細(xì)胞JNK途徑上游的激活劑，有關(guān)人和小鼠的實(shí)驗(yàn)證明，taok3缺乏使JNK途徑的活化有缺陷，并伴隨骨質(zhì)減少[11]。 此外，圖1a中Nur77對(duì)應(yīng)基因也在腦中上調(diào)，其可被生理和物理刺激來(lái)誘導(dǎo)[12]，在小鼠T細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Nur77可以抑制AP-1功能進(jìn)而抑制其下游基因的表達(dá)[13]。腦中GF（生長(zhǎng)因子）基因集上調(diào)表達(dá)，上調(diào)基因?yàn)檠苌伤?2a（angpt2a）。而RTK（受體酪氨酸激酶）中的基因LOC101073085、LOC101064806在腦中上調(diào)，原肌球蛋白受體激酶B（ntrk2b）下調(diào)。蛋白磷酸酶1（ppm1）屬于PP2CA（封二圖1A），在腦中下調(diào)，有負(fù)調(diào)節(jié)MAPKK（絲裂原活化蛋白激酶激酶又稱(chēng)MAP2K）的活性并抑制JNK激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活的作用。

而在肌肉中上調(diào)表達(dá)且差異倍數(shù)較大而腦中無(wú)差異的基因有crkl、mknk2b、rps6ka5及myca。其中crkl（封二圖1B中crkⅡ）已被證明可以激活RAS和JUN激酶信號(hào)通路并以RAS依賴(lài)性方式轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞[14]。而mknk2b和rps6ka5的產(chǎn)物屬于圖1B（封二）中MSK1/2，前者被顯示與ERK有相互作用[15]，后者與立即早期基因（ieg）表達(dá)相關(guān)[16]。myca在肌肉中隨時(shí)間也上調(diào)表達(dá)，有驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖的能力[17]。而肌肉中下調(diào)且在腦中無(wú)差異的基因是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3（tgfb3）（封二圖1B中TGFB），可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）形成的分子[18]。

綜上可知，兩個(gè)時(shí)期間腦組織肌肉組織在MAPK通路發(fā)生著不同的生命過(guò)程。兩組織該通路差異基因雖大多與AP-1家族的fos和jun基因相關(guān)，且兩種基因在兩組織中隨時(shí)間都上調(diào)表達(dá)，但腦中很多上調(diào)的基因都抑制ERK與JNK，進(jìn)而抑制fos和jun的表達(dá);而肌肉中則有抑制這兩基因的基因下調(diào)，而促進(jìn)的上調(diào)的趨勢(shì)，促進(jìn)fos和jun的表達(dá)。并且肌肉組織中促進(jìn)肌肉增殖分化的基因上調(diào)。

3.2 MAPK信號(hào)通路影響骨骼發(fā)育

由上述兩組織MAPK信號(hào)通路分析可知，兩種組織間對(duì)AP-1家族的fos和jun基因影響不同，在腦中抑制而在肌肉中促進(jìn)。同時(shí)從兩組織同步變化的差異基因的基因產(chǎn)物關(guān)聯(lián)分析圖（封三圖3）可知，其中AP-1家族的fos在關(guān)聯(lián)性分析預(yù)測(cè)中與聚為一類(lèi)的其余11個(gè)基因產(chǎn)物均相關(guān)。因此這些關(guān)聯(lián)的基因產(chǎn)物可能發(fā)揮了肌肉MAPK中促進(jìn)fos和jun表達(dá)要引起的作用。

AP-1是轉(zhuǎn)錄因子家族，將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)換成特定靶基因表達(dá)的變化，這些靶基因在其啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域帶有一個(gè)AP-1結(jié)合位點(diǎn)，活性可通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的相互作用進(jìn)行調(diào)節(jié)[19]。而AP-1轉(zhuǎn)錄因子包括FOS家族（FOS、FOSB、FRA-1和FRA-2）與JUN家族（JUN、JUNB和JUND），它們可形成異源二聚體[20]。一些研究發(fā)現(xiàn)AP-1家族部分基因與骨骼發(fā)育相關(guān)。小鼠發(fā)育過(guò)程中FOS表達(dá)對(duì)軟骨內(nèi)骨化過(guò)程起關(guān)鍵作用[21]，并且敲除后其骨骼發(fā)育及造血會(huì)有嚴(yán)重缺陷[22]。而缺少fra-1的小鼠會(huì)發(fā)展成一種骨量減少的低骨量疾病[23]，缺少junb的小鼠由于細(xì)胞自主的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞缺陷而具有骨質(zhì)疏松[24]。除此之外，AP-1家族基因可能與纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān)。C-JUN已被證明是成纖維細(xì)胞增殖所必需的，缺乏C-JUN的小鼠成纖維細(xì)胞在紫外線(xiàn)照射后會(huì)經(jīng)歷延長(zhǎng)的細(xì)胞周期停滯[25]。可能由于這些基因，使MAPK通路成為控制成骨細(xì)胞分化進(jìn)而骨骼礦化的分子通路之一[11]。

Aceto等[26]使用全組織轉(zhuǎn)錄組研究改變的重力和藥物治療對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的影響，發(fā)現(xiàn)fos、fosb、egr1（對(duì)應(yīng)封三圖3 ENSTRUG00000008379）、socs3a（對(duì)應(yīng)圖3 socs3）、gadd45b、klf2a隨骨骼增加而增加，而這些基因除gadd45b（見(jiàn)封三圖1A）只在腦中隨時(shí)間上調(diào)表達(dá)外，其他均出現(xiàn)在圖3，而這些基因被證明與骨骼發(fā)育相關(guān)。其中小鼠klf2基因的缺失會(huì)導(dǎo)致血管、骨骼和顱面發(fā)育的缺陷，并參與骨發(fā)育[27]。而在小鼠骨髓細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子3（socs3）的反義敲降強(qiáng)烈抑制破骨細(xì)胞的形成[28]。egr1屬于由生長(zhǎng)因子迅速誘導(dǎo)的早期基因類(lèi)別，在成骨細(xì)胞中被誘導(dǎo)[29]，在斑馬魚(yú)中，egr1被證明是由表皮生長(zhǎng)因子（FGF）誘導(dǎo)的調(diào)控軟骨發(fā)育的調(diào)控級(jí)聯(lián)的一部分[30]。而在大鼠中發(fā)現(xiàn)EGR1可被MAPK通路中的ERK和JNK通路介導(dǎo)[31]，而在人類(lèi)發(fā)現(xiàn)ERK可誘導(dǎo)c/ebpβ（CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白）（封三圖3， ENSTRUG00000007449），而c/EBPβ是EGR1的伴侶蛋白，相互作用后形成的激活復(fù)合物導(dǎo)致ldlr（低密度脂蛋白受體）基因轉(zhuǎn)錄迅速增加[32]，而LDLR家族蛋白[33]在鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞上被證明可能與CTGF結(jié)合[34]，此外鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞上的研究還發(fā)現(xiàn)CTGF與LDLR家族蛋白結(jié)合后可能被迅速內(nèi)化并降解[34]，而在本研究所用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中l(wèi)dlr在兩時(shí)期間不具顯著性，肌肉中表達(dá)量幾乎不變，而腦中表達(dá)量增加與c/ebpβ和egr1表達(dá)趨勢(shì)一致。而CTGF則影響軟骨發(fā)育，敲除ctgf的小鼠在出生時(shí)會(huì)由于嚴(yán)重的軟骨發(fā)育不良而因呼吸壓力而死亡[35]，在非洲爪蟾上的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CTGF可與BMP4（骨形態(tài)發(fā)生蛋白4）結(jié)合并對(duì)其進(jìn)行抑制調(diào)節(jié)[36]。本研究轉(zhuǎn)錄組中bmp4在兩時(shí)期中腦組織表達(dá)均顯著高于肌肉組織，而同組織不同時(shí)期無(wú)顯著差異。此外基于KEGG的TGF-β信號(hào)通路（KEGG ID為tru04350）發(fā)現(xiàn)，BMP與其受體結(jié)合后可磷酸化SMAD1，SMAD1受到SMAD6/7抑制，而SMAD1和SMAD4可促進(jìn)ID4（DNA結(jié)合蛋白抑制劑ID-4）表達(dá)，而ID4可能調(diào)節(jié)一些基因使成骨細(xì)胞分化。在本研究轉(zhuǎn)錄組中在腦中smad1/4表達(dá)量低，smad6/7上調(diào)表達(dá)，id4在下調(diào)表達(dá)。而在肌肉中smad1/4上調(diào)表達(dá)而smad6/7表達(dá)量低，id4表達(dá)量較高。id4在這兩時(shí)期間由腦表達(dá)量顯著高于肌肉，轉(zhuǎn)變?yōu)榧∪獗磉_(dá)量顯著高于腦。上述基因間的互作見(jiàn)圖4。

故此，MAPK信號(hào)通路及其下游的egr1、c/ebpβ、ctgf、id4等一系列基因調(diào)節(jié)骨骼的發(fā)育。CTGF雖抑制BMP4，但在骨骼發(fā)育中不可或缺。而B(niǎo)MP下游基因在兩組織變化的趨勢(shì)與MAPK信號(hào)通路中兩組織抑制ERK與JNK的基因的趨勢(shì)一致，腦中抑制ERK與JNK的基因上調(diào)，對(duì)應(yīng)抑制BMP下游過(guò)程的基因也上調(diào)，肌肉中與之相反。egr1、c/ebpβ、ctgf等基因在這兩時(shí)期大量且廣泛地表達(dá)，這些基因可能影響在這期間紅鰭東方鲀骨骼的發(fā)育，使得體長(zhǎng)具有顯著性。

3.3 MAPK信號(hào)通路影響組織纖維化

CTGF除與骨骼發(fā)育相關(guān)外，可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）誘導(dǎo)ECM的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)纖維化[18，36]，TGF-β還受KLF4（封三圖3）的調(diào)節(jié)[37]。而在本研究中TGF-β3（封三圖1B中TGFB）在肌肉中隨時(shí)間下調(diào)，在肌肉組織13月齡表達(dá)量顯著高于腦組織，而在腦中兩時(shí)期差異不顯著。而在本研究轉(zhuǎn)錄組中差異表達(dá)的ECM包括膠原蛋白IV（col4）和肌腱蛋白C（tenascin c，tn-c），有研究發(fā)現(xiàn)在ctgf缺陷型小鼠的膠原蛋白IV表達(dá)會(huì)減少且不連續(xù)，而造成血管生成的嚴(yán)重缺陷，因而膠原蛋白IV受TGF-β調(diào)節(jié)且影響血管生成[38]。

此外TGF-β調(diào)控的基因還有SOCS3[35]、HES家族基本螺旋-環(huán)-螺旋（BHLH）[39]以及纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）[40]。BHLH在本研究中兩時(shí)期腦、肌肉轉(zhuǎn)錄組中均下調(diào)（封三圖3，bhlhe41），其旁系同源BHLHE40被證實(shí)抑制myod（肌分化因子）啟動(dòng)子介導(dǎo)的反式激活，對(duì)肌肉生長(zhǎng)具有抑制作用[41]，本研究中myod只在肌肉中表達(dá)，且兩時(shí)期表達(dá)量相近，肌肉中bhlhe41下調(diào)引起的對(duì)myod表達(dá)抑制的減弱不明顯，可能受到其他因子的調(diào)節(jié)。此外PAI-1（圖3中serpine1）是ECM降解酶的抑制劑[40]，并發(fā)現(xiàn)MAPK通路中的ERK對(duì)PAI-1的生成[42]至關(guān)重要。而TGF-β可磷酸化激活SMAD3，并被SMAD6/7抑制，SMAD3可與SMAD4結(jié)合[43]。影響纖維化的基因產(chǎn)物間相互關(guān)系見(jiàn)圖4。

故此，MAPK信號(hào)通路還調(diào)節(jié)tgf-β、ctgf、pai1等誘導(dǎo)或維持ECM的基因，與組織纖維化相關(guān)，在轉(zhuǎn)錄層面上纖維化過(guò)程在肌肉中持續(xù)而在腦中減弱，可能促進(jìn)了肌肉與骨骼的發(fā)育，進(jìn)而使得體長(zhǎng)等性狀顯著增加。

3.4 MAPK信號(hào)通路影響脂類(lèi)代謝

此外在MAPK信號(hào)通路中腦上調(diào)表達(dá)的angptl2、socs3及fos和腦中下調(diào)表達(dá)的原肌球蛋白受體激酶B基因（trkb）可能影響著脂肪的代謝，在嚙齒動(dòng)物中已知（Socs3、Angptl4、Fos等基因）與能量穩(wěn)態(tài)和脂肪細(xì)胞生物學(xué)中發(fā)揮作用[44]。此外，在小鼠和人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)BDNF（腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子）和TRKB的遺傳破壞會(huì)導(dǎo)致食欲亢進(jìn)和嚴(yán)重肥胖[44]。而B(niǎo)DNF通過(guò)與TRKB結(jié)合可抑制γ-氨基丁酸（GABA）傳導(dǎo)活性。而GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。其相關(guān)基因在腦組織特異且隨時(shí)間下調(diào)，在肌肉中不表達(dá)，見(jiàn)圖2（封三）綠色聚類(lèi)。GABA是通過(guò)谷氨酸脫羧酶（GAD，封三圖2 gad1/2）的作用從谷氨酸氨基酸合成的[45]，離子型受體GABAAR（封三圖2 gabra1和gabrg2）是GABA的受體。而GABA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GAT1，圖2 slc6a1）可從突觸間隙中去除GABA[46]。此外在人類(lèi)肌肉中發(fā)現(xiàn)GABA受體的表達(dá)與靜息能量消耗增加有關(guān)[47]。而在不同生長(zhǎng)速度的幼豬肌肉轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)能量消耗越大，GABA相關(guān)基因可能表達(dá)越高，其組織脂肪積累的潛力就越弱[48]，故此腦中MAPK信號(hào)通路中angptl2、socs3及fos的上調(diào)及trkb和GABA相關(guān)基因的下調(diào)反映了腦中基礎(chǔ)能量消耗減弱的脂肪積累增加。

而在本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，肌肉中顯著下調(diào)的核受體亞家族D組（nr1d）基因也與脂類(lèi)代謝相關(guān)，其下調(diào)促進(jìn)了參與脂質(zhì)吸收的基因的表達(dá)[49]，因而肌肉脂質(zhì)的含量可能因此降低。而另有研究發(fā)現(xiàn)缺乏mstnb的斑馬魚(yú)能量代謝從蛋白質(zhì)依賴(lài)性轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)依賴(lài)性[50]，而本研究中mstnb在腦中下調(diào)表達(dá)而在肌肉中上調(diào)，因此可能在腦中脂類(lèi)增加而肌肉中脂類(lèi)減少，這個(gè)推測(cè)與其他上述其他基因一致，并且mstnb可能是調(diào)節(jié)這兩個(gè)組織使脂肪代謝不同的原因。

故此兩組織中在兩月間的脂質(zhì)代謝有很大不同，腦中脂類(lèi)可能增加而肌肉中脂類(lèi)減少，這可能由于腦部基礎(chǔ)代謝降低，而肌肉增高。而脂質(zhì)代謝可能受MAPK通路影響，而mstnb可能調(diào)節(jié)兩個(gè)組織脂肪代謝，而trkb、GABA相關(guān)基因的下調(diào)有促進(jìn)脂肪積累的作用，而核受體亞家族D組基因的下調(diào)促進(jìn)了脂質(zhì)吸收。

4 結(jié)論

本研究中，基于13與15月齡紅鰭東方鲀的腦與肌肉組織MAPK信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)在通路中有增殖分化相關(guān)作用的上調(diào)基因fos和jun在腦組織中被抑制調(diào)節(jié)，而在肌肉中則促進(jìn)它們的表達(dá)。此外，fos和jun的下游基因egr1、c/ebpβ、ctgf等上調(diào)且與骨骼發(fā)育相關(guān)。而MAPK信號(hào)通路還調(diào)節(jié)促進(jìn)了肌肉的組織纖維化相關(guān)的基因，而在腦中這個(gè)過(guò)程減弱。此外，MAPK信號(hào)通路還可能影響脂質(zhì)代謝，在腦中脂肪積累被促進(jìn)并伴隨著基礎(chǔ)代謝降低，而肌肉中促進(jìn)了脂質(zhì)吸收。因而MAPK信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)fos和jun及其下游基因，促進(jìn)這期間肌肉和骨骼發(fā)育，使得紅鰭東方鲀?cè)趦蓵r(shí)期間體重、體長(zhǎng)和體全長(zhǎng)性狀顯著增加。

參考文獻(xiàn)：

[1] 馬愛(ài)軍，李偉業(yè)，王新安，等.紅鰭東方鲀養(yǎng)殖技術(shù)研究現(xiàn)狀及展望[J].海洋科學(xué)，2014，38（2）：116-121.

[2] 龐景貴，閻俊禮.紅鰭東方鲀養(yǎng)成技術(shù)要點(diǎn)[J].河北漁業(yè)，2003（3）：15-16.

[3] BRENNER S，ELGAR G，SANFORD R，et al.Characterization of the pufferfish（Fugu） genome as a compact model vertebrate genome[J].Nature，1993，366（6452）：265-268.

[4] 王盛南，胡子文，余云登，等.紅鰭東方鲀不同生長(zhǎng)時(shí)期腦和肌肉的轉(zhuǎn)錄組比較分析[J/OL].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)：1-7[2020-10-17].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.1369.Q.20200428.1709.008.html.

[5] 張方亮，賓石玉，林勇，等.Smyd1蛋白的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2016，27（5）：728-731

[6] PHAN，D，RASMUSSEN T，NAKAGAWA O，et al.BOP，a regulator of right ventricular heart development，is a direct transcriptional target of MEF2C in the developing heart[J].Development，2005，132（11）：2669.

[7] TAN X G，ROTLLANT J，LI H Q，et a1.SmyD1，a histone methyhransferase，is required for myofibril organization and muscle contraction in zebrafish embryos[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（8）：2713-2718.

[8] CHANG L F，KARIN M.Mammalian MAP kinase signalling cascades[J].Nature，2001，410（6824）：37-40.

[9] MAYER M P，BUKAU B.Hsp70 chaperones：cellular functions and molecular mechanism[J].Cellular and molecular life sciences，2005，62（6）：670.

[10] SALVADOR J M，BROWN-CLAY J D，F(xiàn)ORNACE A J.Gadd45 in stress signaling，cell cycle control，and apoptosis[J].Adv Exp Med Biol，2013，793：1-19.

[11] LI Z，OH H，CUNG M，et al.TAOK3 is a MAP3K contributing to osteoblast differentiation and skeletal mineralization[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2020，531（4）：497-502.

[12] MAXWELL M A，MUSCAT G E.The NR4A subgroup：immediate early response genes with pleiotropic physiological roles[J].Nuclear receptor signaling，2006，4（1）：nrs.04002.

[13] LIU X D，WANG Y，LU H，et al.Genome-wide analysis identifies NR4A1 as a key mediator of T cell dysfunction[J].Nature，2019，567（7749）：525-529.

[14] SENECHAL K，HALPERN J，SAWYERS C L.The CRKL adaptor protein transforms fibroblasts and functions in transformation by the BCR-ABL oncogene[J].Journal of Biological Chemistry，1996，271（38）：23255-23261.

[15] SCHEPER G C，PARRA J L，WILSON M，et al.The N and C termini of the splice variants of the human mitogen-activated protein kinase-interacting kinase Mnk2 determine activity and localization[J].Molecular and cellular biology，2003，23（16）：5692-5705.

[16] SOLOAGA A，THOMSON S，WIGGIN G R，et al.MSK2 and MSK1 mediate the mitogen variants of the human mitogen-activated protein kinase-interac[J].The EMBO journal，2003，22（11）：2788-2797.

[17] LIU Y C，LI F，HANDLER J，et al.Global regulation of nucleotide biosynthetic genes by c-Myc[J].PloS one，2008，3（7）：e2722.

[18] TAYA Y ，O'KANE S ，F(xiàn)ERGUSON M W，et al.Pathogenesis of cleft palate in TGF-β3 knockout mice[J].Development，1999，126（17）：3869-3879.

[19] EFERL R，WAGNER EF.AP-1：a double-edged sword in tumorigenesis[J].Nature Reviews Cancer，2003，3（11）：859-868.

[20] WAGNER E F ，EFERL R.Fos/AP-1 proteins in bone and the immune system[J].Immunological Reviews，2010，208（1）：126-140.

[21] RTHER U，GARBER C ，KOMITOWSKI D ，et al.Deregulated c-fos expression interferes with normal bone development in transgenic mice[J].Nature，1987，325（6103）：412-416.

[22] WANG Z Q ，OVITT C，GRIGORIADIS A E，et al.Bone and haematopoietic defects in mice lacking c-fos[J].Nature，1992，360（6406）：741-745.

[23] EFERL R ，HOEBERTZ A ，SCHILLING A F，et al.The Fos-related antigen Fra-1 is an activator of bone matrix formation[J].Embo Journal，2014，23（14）：2789-2799.

[24] KENNER L，HOEBERTZ A，BEIL F T，.et al.Mice lacking JunB are osteopenic due to cell-autonomous osteoblast and osteoclast defects[J].Journal of Cell Biology，2004，164（4）：613-623.

[25] SHAULIAN E ，KARIN M .AP-1 in cell proliferation and survival[J].Oncogene，2001，20（19）：2390-2400.

[26] ACETO J， NOURIZADEH-LILLABADI R， MARE R，et al.Zebrafish bone and general physiology are differently affected by hormones or changes in gravity[J].PLoS ONE，2015，10（6）： e0126928.

[27] RENN J ，PRUVOT B ，MULLER M.Detection of nitric oxide by diaminofluorescein visualizes the skeleton in living zebrafish[J].Journal of Applied Ichthyology，2014，30（4）：701f App

[28] FOX S W，HAQUE S J，LOVIBOND A C，et al.The possible role of TGF-β-Induced suppressors of cytokine signaling expression in osteoclast/macrophage lineage commitment in vitro[J].The Journal of Immunology，2003，170（7）：3679-3687.

[29] GRANET C ，BOUTAHAR N ，VICO L ，et al.MAPK and SRC-Kinases control EGR-1 and NF-κB inductions by changes in mechanical environment in osteoblasts[J].Biochem Biophys Res Commun，2001，284（3）：622-631.

[30] DALCQ J， PASQUE V， GHAYE A，et al.RUNX3，Egr1 and SOX9B form a regulatory cascade required to modulate BMP-signaling during cranial cartilage development in zebrafish[J].Plos One，2012，7（11）：e50140.

[31] HWANG A R， NAM J O， KANG Y J.Fluvastatin inhibits advanced glycation end products-induced proliferation，migration，and extracellular matrix accumulation in vascular smooth muscle cells by targeting connective tissue growth factor[J].The Korean Journal of Physiology & Pharmacology，2018，22（2）：193-201.

[32] ZHANG F，LIN M，ABIDI P，et al.Specific interaction of Egr1 and c/EBPβ leads to the transcriptional activation of the human low density lipoprotein receptor gene[J].Journal of Biological Chemistry，2003，278（45）：44246-44254.

[33] GLIEMANN J.Receptors of the low density lipoprotein（LDL） receptor family in man.Multiple functions of the large family members via interaction with complex ligands[J].Biological Chemistry，1998，379（8-9）：951.

[34] SEGARINI P R ，NESBITT J E ，LI D ，et al.The low density lipoprotein receptor-related protein/α2-macroglobulin receptor is a receptor for connective tissue growth factor[J].Journal of Biological Chemistry，2001，276（44）：40659.

[35] IVKOVIC S， YOON B S， POPOFF S N，et al.Connective tissue growth factor coordinates chondrogenesis and angiogenesis during skeletal development[J].Development，2003，130（12）：2779-2791.

[36] ABREU J G，KETPURA N I，REVERSADE B，et al.Connective-tissue growth factor（CTGF） modulates cell signalling by BMP and TGF-β[J].Nature cell biology，2002，4（8）：599-604.

[37] LI H X，HAN M，BERNIER M，et al.Krüppel-like factor 4 promotes differentiation by transforming growth factor-β receptor-mediated smad and p38 MAPK signaling in vascular smooth muscle cells[J].Journal of Biological Chemistry，2010， 285（23）：17846-17856.

[38] HALL-GLENN F， DE YOUNG R A， HUANG B L，et al.CCN2/connective tissue growth factor is essential for pericyte adhesion and endothelial basement membrane formation during angiogenesist[J].PloS one，2012，7（2）：e30562.

[39] KENNARD S， LIU H， LILLY B.Transforming growth factor-β （TGF-β1） down-regulates Notch3 in fibroblasts to promote smooth muscle gene expression[J]. Journal of Biological Chemistry， 2008， 283（3）： 1324-1333.

[40] LI Z Z，HONG Z，PENG Z Q，et al.Acetylshikonin from Zicao ameliorates renal dysfunction and fibrosis in diabetic mice by inhibiting TGF-β1/Smad pathway[J].Human Cell，2018，31：199-209

[41] HSIAO S P，HUANG K M，CHANG H Y，et al.P/CAF rescues the Bhlhe40-mediated repression of MyoD transactivation[J].Biochemical Journal，2009，422（2）：343.

[42] SAMARAKOON R ，HIGGINS C E ，HIGGINS S P ，et al.Differential requirement for MEK/ERK and SMAD signaling in PAI-1 and CTGF expression in response to microtubule disruption[J].Cellular Signalling，2009，21（6）：986-995.

[43] POHLERS D，BRENMOEHL J，LFFLER I，et al.TGF-β and fibrosis in different organs—molecular pathway imprints[J].Biochimica et Biophysica Acta，2009，1792（8）：746-756.

[44] BOCHUKOVA E G，LAWLER K，CROIZIER S，et al.A transcriptomic signature of the hypothalamic response to fasting and BDNF deficiency in Prader-Willi syndrome[J].Cell reports，2018，22（13）：3401-3408.

[45] ROBERTS A W ，ROBB L ，RAKAR S ，et al.Placental defects and embryonic lethality in mice lacking suppressor of cytokine signaling 3[J].Proc Natl Acad，U S A，2001，98（16）：9324-9329.

[46] HIRUNSATIT R，GEORGE E D，LIPSKA B K，et al.Twenty-one-base-pair insertion polymorphism creates an enhancer element and potentiates SLC6A1 GABA transporter promoter activity[J].Pharmacogenetics and genomics，2009，19（1）：53.

[47] WU X X，PATKI A ，LARA-CASTRO C ，et al.Genes and biochemical pathways in human skeletal muscle affecting resting energy expenditure and fuel partitioning[J].Journal of Applied Physiology，2011，110（3）：746.

[48] AYUSO M ，ALMUDENA F，YOLANDA N，et al.Developmental stage，muscle and genetic type modify muscle transcriptome in pigs：effects on gene expression and regulatory factors involved in growth and metabolism[J].Plos One，2016，11（12）：e0167858.

[49] RAMAKRISHNAN S N，LAU P，BURKE L J，et al.Rev-erbβ regulates the expression of genes involved in lipid absorption in skeletal muscle cells： evidence for cross-talk between orphan nuclear receptors and myokines[J].Journal of Biological Chemistry，2005，280（10）：8651-8659.

[50] GAO Y P，DAI Z R，SHI C，et al.Depletion of myostatin b promotes somatic growth and lipid metabolism in zebrafish[J].Frontiers in endocrinology，2016（7）：88.

Abstract：In order to investigate the molecular mechanisms underlying the differences in growth between the different growth stages of Takifugu rubripes，this study combined gene interaction analysis with transcriptomic data from brain and muscle tissues of 13- and 15-month-old T.rubripes and MAPK signaling pathways that differed significantly in the KEGG pathway analysis between the two stages to predict the biological processes that occurred during these periods. And bioinformatic correlation prediction was performed.The results showed that MAPK signaling pathway promoted muscle and bone development during these periods by regulating fos and jun and their downstream genes，which led to the growth of T.rubripes during the two-stage period.While fos and jun were upregulated in both tissues，the genes that repress fos and jun were more upregulated in the brain and less in the muscle. MAPK signaling pathway-mediated genes such as egr1，c/ebpβ，and ctgf were found to be associated with skeletal development，and may accompany skeletal growth of T.rubripes during these periods.MAPK signaling pathway also regulates tgf-β，ctgf，pai1 and other genes associated with tissue fibrosis，and at the transcriptional level the fibrosis process persists in muscle and is diminished in brain，possibly promote the development of muscle and bone，and sort out its possible intergenic interaction process.MAPK signaling pathway may also affect lipid metabolism，while downregulation of γ-aminobutyric acid-related genes in brain has a role in promoting lipid accumulation，a process that may be accompanied by a decrease in basal metabolism， while downregulation of nuclear receptor subfamily D（nr1d） genes in muscle promotes lipid uptake， and mstn b genes may regulated this process.

Key words：Takifugu rubripes; tissue differential genes; MAPK signaling pathway; bioinformatic analysis

（收稿日期：2021-07-08）