宮頸癌患者癌組織中IL-33表達(dá)水平與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性

蘇博 閆振宇 郝尚輝 孫麗 忽平 高毅

南陽市中心醫(yī)院1病理科，3婦產(chǎn)科，4麻醉科（河南南陽473000）；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（河南新鄉(xiāng)453000）

2010-2013年，河北省宮頸癌粗發(fā)病率為14.62/10 萬例，死亡率為3.74/10 萬例，死亡率呈現(xiàn)下降趨勢，但發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢［1］，國家癌癥中心研究數(shù)據(jù)顯示［2］，2015年中國宮頸癌新發(fā)患者高達(dá)近10 萬例，死亡患者3 萬例左右，宮頸癌已嚴(yán)重影響女性健康。盡管高危型人類乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的病理生理基礎(chǔ)，但僅僅部分患者可發(fā)展為宮頸癌［3］，單純從HPV 感染角度難以完全解釋宮頸癌的具體發(fā)病機(jī)制。白細(xì)胞介素-33（interleukin-33，IL-33）屬于內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子［4］，IL-33作為一種促炎因子參與了多種惡性腫瘤如卵巢癌［5］、子宮內(nèi)膜癌［6］等發(fā)病機(jī)制，本課題組前期研究也證實IL-33 可作為宮頸癌的一項生物學(xué)標(biāo)志物［7］，但目前關(guān)于宮頸癌組織中IL-33 的表達(dá)水平尚不清楚，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分析宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達(dá)水平與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象納入2016年1月1日-2017年12月31日于南陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科確診的184 例宮頸癌患者作為研究對象，年齡52 ～61 歲，平均（58.25±7.22）歲；腫瘤大小＜4 cm共83例，≥4 cm 共101 例；鱗癌共137 例，其他病理類型共47 例；腫瘤細(xì)胞中～高分化共61 例，低分化共123 例；肌層浸潤深度＜1/2 共56 例，肌層浸潤深度≥1/2 共128 例；FIGO 分期中Ⅰ期共63 例，Ⅱa 期共121 例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移共104 例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移共80 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）宮頸癌診斷通過術(shù)后組織病理學(xué)診斷；（2）初次來我院就診并確診，宮頸癌為早期，F(xiàn)IGO 分期為Ⅰ～Ⅱa 期，且入院后采用廣泛子宮切除及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)；（3）臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤及宮頸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等；（2）患有嚴(yán)重肝腎功能不全、血栓性疾病及其他不適合手術(shù)的疾病等；（3）合并其他自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白塞病等；（4）術(shù)后失訪。所有患者術(shù)后每1 個月進(jìn)行門診復(fù)診或電話隨訪，必要時進(jìn)行影像學(xué)檢查，終止日期為患者復(fù)發(fā)、死亡日期或末次隨訪日期，本研究中末次隨訪截止日期為2020年12月31日，隨訪時間定義為手術(shù)后至復(fù)發(fā)、死亡時間或截止時間。宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)或死亡定義為預(yù)后不良，其余定義為預(yù)后良好。本研究經(jīng)過我院倫理委員會審核并批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 試劑鼠源性IL-33 單克隆抗體購買于北京義翹神州科技股份有限公司（貨號：10368-HNAE，產(chǎn)地：中國）。SP免疫組化染色試劑盒及二抗（HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG）購買于上海碧云天生物試劑有限公司（上海，中國）。

1.2.2 宮頸組織中IL-33表達(dá)水平手術(shù)獲取宮頸癌患者癌組織和癌旁組織（距離癌組織3 cm 以上），癌組織和癌旁組織中IL-33 表達(dá)水平采用免疫組化法檢測。取我院病理科石蠟包埋的切片，連續(xù)切片后制成4 μm 厚度切片，常規(guī)進(jìn)行脫蠟和水化，檸檬酸鈉緩沖液加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫溶液室溫孵育15 min 用于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，再次采用PBS 洗滌3 次，每次3 min。10%山羊血清室溫封閉30 min，滴加一抗后4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后PBS 洗滌3 次，每次3 min，滴加二抗室溫孵育30 min。切片用DAB 顯色，蘇木精復(fù)染。切片沖洗干燥后中性樹膠封片。以已知陽性反應(yīng)片作為陽性對照，以PBS 作為一抗用于陰性對照。參考文獻(xiàn)［8］，免疫組化結(jié)果按照如下判定：IL-33 抗原陽性反應(yīng)為細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)黃色顆粒，與背景對比，無色、淺黃色、棕黃色和棕褐色分別得0 分、1 分、2 分和3 分；陽性細(xì)胞數(shù)得分：隨機(jī)采集10 個代表性的視野計算陽性表達(dá)率，陽性表達(dá)率為陽性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)*100%，陽性表達(dá)率5%、5% ～25%、26% ～50%、51% ～75%及75%以上分別得分0 分、1 分、2 分、3 分和4 分。染色強(qiáng)度得分*陽性細(xì)胞數(shù)得分為0 ～1 分、2 ～3 分、4 ～5 分和≥6 分時分別計為陰性（-）、弱陽性（+）、中度陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++），本研究中將“++～+++”視為高表達(dá)，將“-～+”視為低表達(dá)。

1.2.3 臨床病理資料的收集所有研究對象年齡、產(chǎn)次、腫瘤大小、組織學(xué)類型、分化程度、肌層浸潤深度、FIGO 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用頻數(shù)或百分比表示，采用卡方檢驗，宮頸癌患者不良預(yù)后的危險因素采用Cox 風(fēng)險比例模型分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達(dá)及分布本研究中宮頸癌患者癌旁組織中IL-33 均為低表達(dá)，癌組織中IL-33 高表達(dá)共126 例，低表達(dá)共58 例。IL-33 主要表達(dá)于細(xì)胞胞漿中，呈現(xiàn)棕黃色及棕褐色顆粒。結(jié)果見圖1。

圖1 宮頸癌組織中IL-33 表達(dá)情況（×200）Fig.1 IL-33 expression level cervical cancer tissues（×200）

2.2 宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達(dá)水平與臨床-病理特征的關(guān)系宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達(dá)水平在分化程度、肌層浸潤深度、FIGO 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而與年齡、產(chǎn)次、腫瘤大小及組織學(xué)類型無明顯相關(guān)性。結(jié)果見表1。

表1 宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達(dá)水平與臨床-病理特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between the expression level of IL-33 and the clinical-pathological characteristics in cervical cancer tissues例

2.3 宮頸癌患者術(shù)后預(yù)后不良和癌組織中IL-33表達(dá)水平的關(guān)系本研究中隨訪時間為5 ～60 個月，中位隨訪時間為37.25 個月。截止到隨訪結(jié)束，本研究中宮頸癌患者復(fù)發(fā)或死亡共141 例，未復(fù)發(fā)或死亡43 例，其中復(fù)發(fā)或死亡患者癌組織中IL-33 高表達(dá)103 例，低表達(dá)38 例，未復(fù)發(fā)或死亡患者癌組織中IL-33 高表達(dá)23 例，低表達(dá)20 例，預(yù)后不良與預(yù)后良好組患者癌組織中IL-33 表達(dá)水平差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.016）。

2.4 Cox 回歸分析Cox 回歸分析結(jié)果顯示，肌層浸潤深度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和IL-33高表達(dá)是影響宮頸癌患者不良預(yù)后的危險因素（P＜0.001），見表2。

表2 宮頸癌患者不良預(yù)后的單因素和多因素分析Tab.2 Univariate and multivariate analysis of the poor prognosis of patients with cervical cancer

3 討論

宮頸癌嚴(yán)重影響女性的生殖健康，盡管宮頸細(xì)胞學(xué)篩查對檢測早期宮頸癌具有一定重要意義，但是仍無法抑制宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險［9］，隨著近年來分子生物學(xué)的發(fā)展，多項研究致力于探討宮頸癌的分子標(biāo)志物［10］。IL-33 屬于一種炎癥介質(zhì)，參與了多個生殖系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病機(jī)制［5-6］，鑒于目前關(guān)于IL-33 和宮頸癌的相關(guān)性研究報道較少，本研究通過探討宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達(dá)水平及其臨床意義。

IL-33 屬于白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL1）家族成員之一，其編碼基因位于9 號染色體短臂上，IL-33 本質(zhì)上屬于一種促炎因子，表達(dá)于多種類型細(xì)胞如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞中［11-12］，IL-33 通過其受體ST2 可參與絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）等多種炎癥信號通路的調(diào)節(jié)［13-14］，而炎癥與腫瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［15］。ZHOU 等［16］發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞可分泌IL-33，IL-33 能通過其受體ST2 誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，當(dāng)IL-33 或ST2 基因沉默后可抑制這種現(xiàn)象的發(fā)生；此外，IL-33 能顯著提促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)和分泌［17］，VEGF 可受到M2型巨噬細(xì)胞的調(diào)控而參與腫瘤組織中新生血管的形成［18］。另一方面，IL-33 除了通過直接或間接促進(jìn)腫瘤組織中的血管形成之外，也能通過作用于免疫細(xì)胞而影響腫瘤微環(huán)境，最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，JOVANOVIC 等［19］證實，當(dāng)對乳腺癌小鼠模型中給予IL-33 后可抑制樹突狀細(xì)胞的成熟，促進(jìn)免疫耐受并降低自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。本課題組前期研究證實［7］，宮頸癌患者血清中IL-33 表達(dá)水平顯著升高，在臨床分期、腫瘤細(xì)胞分化程度上存在顯著差異，IL-33 單獨(dú)診斷宮頸癌敏感度和特異度均可達(dá)80%以上，本研究進(jìn)一步通過免疫組化分析宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，癌旁組織中IL-33 均為低表達(dá)，癌組織中IL-33 大多為高表達(dá)，且宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達(dá)水平在分化程度、肌層浸潤深度、FIGO 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上存在顯著差異（P＜0.05），這一結(jié)果與本研究前期結(jié)果基本相一致。目前關(guān)于IL-33 如何參與調(diào)控宮頸癌發(fā)病的具體分子生物學(xué)機(jī)制報道較少，HPV 持續(xù)性感染可導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，但是具體機(jī)制不清楚，KULHAN 等［20］研究顯示，宮頸組織中HPV 的持續(xù)性感染可能會誘導(dǎo)IL-33 高表達(dá)，最終通過多種信號途徑促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生，此外，WANG 等［21］發(fā)現(xiàn)IL-33 也可誘導(dǎo)宮頸組織中IFN-γ表達(dá)上調(diào)而參與宮頸癌的發(fā)病機(jī)制。隨訪期間發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中IL-33 高表達(dá)組復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險顯著高于低表達(dá)組，提示IL-33 高表達(dá)與宮頸癌患者的不良預(yù)后有關(guān)，本研究同時發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞低分化、肌層浸潤深度越深、FIGO 分期越高和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達(dá)水平均顯著升高，腫瘤細(xì)胞分化程度越低，說明惡性程度越高，而肌層浸潤深度越深和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，說明腫瘤細(xì)胞越容易進(jìn)行局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，F(xiàn)IGO 分期是綜合多種因素進(jìn)行預(yù)后評估，通常FIGO 分期越高，預(yù)后越差，劉海鳳等［8］證實這些臨床因素均是宮頸癌患者不良預(yù)后的指標(biāo)之一，本研究進(jìn)一步通過Cox 回歸分析證實IL-33 高表達(dá)與宮頸癌患者不良預(yù)后有關(guān)。因此，筆者認(rèn)為宮頸癌組織中IL-33 高表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為評估宮頸癌預(yù)后的一種生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，宮頸癌患者癌組織中IL-33 表達(dá)水平顯著升高，與宮頸癌的臨床病理特征顯著相關(guān)，對宮頸癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有著極其重要的意義，IL-33 也可作為篩查宮頸癌的一種生物學(xué)標(biāo)志物，然而，日后IL-33 如何調(diào)節(jié)宮頸癌的發(fā)病機(jī)制仍是下一步繼續(xù)研究的方向。