油酸甲酯對多殺菌素發(fā)酵合成的影響

李子勇 曾曉寧 滿建魯 閆亮

(山東勝利生物工程有限公司 272000）

畜牧業(yè)作為農業(yè)農村經濟發(fā)展的重要支柱產業(yè)，為保障國家畜產品供給、增加農牧民收入、改善居民生活水平做出重要貢獻。同時，隨著經濟的發(fā)展和人們生活水平的提高，有機畜牧業(yè)和綠色畜牧業(yè)的轉型升級，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴峻考驗。國家高度重視畜牧業(yè)綠色發(fā)展和有機養(yǎng)殖，在動物養(yǎng)殖過程中盡量使用有機飼料和無抗飼料，而飼料來源起決定性作用。在農作物種植過程中，農藥殘留是影響我國綠色發(fā)展和有機養(yǎng)殖的重要因素之一。多殺菌素是全球低毒農藥的典型代表，同時也是世界上最具有發(fā)展前途的農藥。作為一種安全性高，作用位點專一，低毒高效的典型的新型微生物藥物具有較好的發(fā)展前景。

多殺菌素(Spinosad,1)是由刺糖多孢菌合成的大環(huán)內酯類抗生素[1]，分子中含有獨特的四環(huán)結構，四環(huán)母核的9、17位上分別連接有L-鼠李糖和D-福樂糖胺。1類化合物中活性最高的兩個組分是spinosyn A和spinosyn D[2]，其他組分活性較弱。目前實驗室流行的多殺菌素發(fā)酵工藝大多使用植物油或油酸甲酯作為產物合成的碳源，以提高多殺菌素的產量。馬坤等[3]研究發(fā)現(xiàn)，植物油對刺糖多孢菌生長及其合成多殺菌素能力有比較明顯的影響。油酸甲酯和植物油成分類似，是一種不飽和脂肪酸酯，其在發(fā)酵液中利用率的高低是影響抗生素效價提高的關鍵[4]。由于油酸甲酯難溶于發(fā)酵液，濃度過高會影響發(fā)酵液中的溶氧，對微生物的生產代謝不利，最終會影響產物的合成。因此，多殺菌素發(fā)酵工藝一般在基礎培養(yǎng)基中添加少量油酸甲酯，中間過程補入一定量的油酸甲酯，保證既能維持發(fā)酵液中油酸甲酯的濃度，又不會對菌絲生長及多殺菌素的合成產生不利影響。王美玲等[5]研究發(fā)現(xiàn)，油脂的補加種類、濃度、時間會明顯影響抗生素的產量，所以深入研究油酸甲酯對發(fā)酵過程中微生物的生長狀態(tài)及次級代謝的影響，確定最佳的補料周期和濃度，對多殺菌素的發(fā)酵工藝改進具有重要的指導意義。鑒于此，本文通過基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中油酸甲酯替代淀粉和不同發(fā)酵周期添加不同濃度油酸甲酯對多殺菌素發(fā)酵合成影響的研究與探討，為工業(yè)化生產多殺菌素提供試驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

原始菌種：刺糖多孢菌，保存于山東勝利生物工程有限公司菌種中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖1.0%、酵母浸粉0.5%、瓊脂2.5%、脫脂奶粉0.5%、七水硫酸鎂0.1%。

種子瓶培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%、玉米淀粉1.5%、酵母粉2%、七水硫酸鎂0.25%。

發(fā)酵瓶培養(yǎng)基：葡萄糖4%、玉米淀粉6%、棉籽餅粉2%、酵母粉0.8%、麩質粉0.6%、蛋白胨1.2%、甘油0.6%、硫酸銨0.1%、磷酸氫二鉀0.2%、硫酸亞鐵0.0003%、碳酸鈣0.6%。

1.1.3 試劑

葡萄糖、酵母浸粉、瓊脂、酵母粉、蛋白胨、甘油、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸銨、硫酸亞鐵、油酸甲酯等均為國產試劑。

1.1.4 儀器設備

高效液相色譜儀，沃特世科技上海有限公司；氣相色譜儀，安捷倫科技中國有限公司；全封閉式搖瓶機，上海世平實驗設備有限公司；超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 刺糖多孢菌的培養(yǎng)

（1)在超凈工作臺上，刮取約25mm2的斜面菌層，接種到種子瓶培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)72h，培養(yǎng)條件28.0℃，200r/min。

（2)將種子液取出，在超凈工作臺上，按照10%的接種量轉接至發(fā)酵瓶中，在28.0℃，220r/min的條件下，搖床培養(yǎng)280h。研究基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中油酸甲酯替代淀粉和不同發(fā)酵周期添加不同濃度油酸甲酯對多殺菌素發(fā)酵合成影響。每次設置3個平行樣，同時進行發(fā)酵。

1.2.2 油酸甲酯含量測定

參照文獻[6]。

1.2.3 多殺菌素效價的測定

參照文獻[7]。

2 結果與討論

2.1 基礎培養(yǎng)基不同濃度的油酸甲酯等量替代淀粉對多殺菌素發(fā)酵影響

多殺菌素發(fā)酵過程中，在培養(yǎng)基中添加不同含量的油酸甲酯代替原工藝配方中的淀粉，會對多殺菌素合成產生不同程度的影響，通過試驗確定了發(fā)酵基礎培養(yǎng)基中油酸甲酯的最佳添加量，結果如表1（試驗數(shù)據均為平均值，下同)。

表1 培養(yǎng)基中不同油酸甲酯替代量對放瓶效價的影響

在培養(yǎng)基中添加油酸甲酯對多殺菌素的合成效果明顯，隨著油酸甲酯含量由2%增加到4%，放瓶效價達到2065μg/ml，比對照提高29.9%，說明油酸甲酯促進了多殺菌素的生物合成。但當油酸甲酯含量達到6%以后，添加量的增大反而對多殺菌素的合成產生反作用，培養(yǎng)基中添加8%的油酸甲酯時，放瓶效價與添加2%油酸甲酯量的效價差距不大，繼續(xù)添加可能會對多殺菌素的合成產生不利影響，因此，在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中油酸甲酯添加量控制在4%最佳。

2.2 發(fā)酵過程補加油酸甲酯對多殺菌素合成的影響

2.2.1 72h添加油酸甲酯對發(fā)酵的影響

發(fā)酵運行至72h時，在搖瓶中分別添加2%、4%、6%、8%的油酸甲酯，監(jiān)測放瓶時油酸甲酯的殘留及效價的變化，分析對多殺菌素合成的影響。具體結果如表2。

表2 72h不同油酸甲酯添加量對油酸甲酯殘留及放瓶效價的影響

在油酸甲酯殘留上，72h4組搖瓶中的油酸甲酯殘留量逐步增加，與添加量有一定的對應關系。效價增長方面，隨著添加量增加，效價逐步提升，添加油酸甲酯量6%的組放瓶效價較對照組提高22.7%，但添加量至8%組后，效價反而低于6%添加組。經分析認為，出現(xiàn)以上情況可能因為在一定油酸甲酯濃度范圍內，刺糖多孢菌的次級代謝活力最強，油酸甲酯量濃度過低不能充分激活或誘導多殺菌素的生物合成，濃度過高則又抑制了微生物的次級代謝。

在多殺菌素的生物合成上，油酸甲酯添加量在一定濃度限度內時，其效價增長趨勢與發(fā)酵液中的油酸甲酯的殘留量變化趨勢類似，說明效價的增長與微生物對油酸甲酯的利用率呈現(xiàn)對應關系，但油酸甲酯的添加超過一定限度后會反過來抑制多殺菌素的合成。

2.2.2 120h添加油酸甲酯對發(fā)酵的影響

120h時在搖瓶中分別添加2%、4%、6%、8%油酸甲酯對多殺菌素發(fā)酵的影響情況如表3。在油酸甲酯殘留方面，與72h添加實驗類似，隨著油酸甲酯添加量的增加，發(fā)酵液中的油酸甲酯殘留也逐漸增多，尤其是添加量超過6%以后，油酸甲酯的累計速度加快，說明油酸甲酯的利用率已接近極限。

表3 120h不同油酸甲酯添加量對油酸甲酯殘留及放瓶效價的影響

在多殺菌素的合成上，此階段添加油酸甲酯比72h添加效果更為明顯。油酸甲酯添加量2%、4%、6%的3組都增加了產物的合成，只是增加幅度不同，其中以6%的添加量增加最為明顯。與油酸甲酯殘留趨勢類似，加量增加到8%以后，放瓶效價比6%有一定幅度的降低，說明過量的油酸甲酯對菌體的次級代謝產生副作用，抑制多殺菌素的合成速度。

2.2.3 168h添加油酸甲酯對發(fā)酵的影響

168h時在搖瓶中分別添加2%、4%、6%、8%的油酸甲酯對多殺菌素發(fā)酵的影響情況如表4。在油酸甲酯殘留方面可以看出，各個添加梯度殘留量基本接近線性關系，說明此階段添加的油酸甲酯已基本無法被菌體代謝利用，這可能是微生物的代謝能力進一步下降的表現(xiàn)。

表4 168h不同油酸甲酯添加量對油酸甲酯殘留及放瓶效價的影響

對多殺菌素合成的影響方面，油酸甲酯添加量為2%、4%、6%雖然都有促進作用，但促進作用已不明顯，而且這3個梯度的差別不大，預計后期可能出現(xiàn)產物分解，效價降低。而8%油酸甲酯加量組明顯對產物合成有抑制作用，放瓶時效價接近對照組。從整體表現(xiàn)來看，168h時菌體的生長代謝旺盛期已過，菌體已經或接近衰亡期，此時，油酸甲酯添加不當可能會對發(fā)酵帶來災難性后果。

3 結論

在發(fā)酵工業(yè)中，尤其是在抗生素發(fā)酵過程中，在培養(yǎng)基中適量添加植物油既可作為消泡劑又可作為碳源參與生產菌的代謝反應[8]。分析多殺菌素合成途徑，多殺菌素的合成中需要大量乙酰CoA，乙酰CoA 可由糖酵解途徑和脂肪酸分解途徑提供[9]。油酸甲酯和植物油類似，其化學結構為不飽和脂肪酸酯，分解后可產生多種短鏈脂肪酸和?；鵆oA，為多殺菌素的生物合成提供前提和能量供應。

本文通過研究在基礎培養(yǎng)基和不同的發(fā)酵周期補加油酸甲酯發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中油酸甲酯的利用有一定的階段性，過高的油酸甲酯濃度會對產物的合成產生抑制作用。在發(fā)酵液中菌絲活性處于較高水平時，油酸甲酯分解利用率高，可以為菌體對產物的合成提供充分的前提，合成多殺菌素的能力強。油酸甲酯補加實驗表明，分別在周期72、120 和168h 時添加不同含量的油酸甲酯，以120h 時補加效果最好，補加量6%最佳，放瓶時油酸甲酯的殘留在0.5g/100ml 左右，放瓶效價提高33.6%。本試驗為多殺菌素的工業(yè)化生產提供可靠依據，而多殺菌素的工業(yè)化生產將為我國畜牧業(yè)的綠色發(fā)展和有機養(yǎng)殖做出重要貢獻。