HPLC法測(cè)定豬源纖維蛋白粘合劑中的枸櫞酸離子含量

蔣玉輝 梁蔚陽

[摘要]目的建立豬源纖維蛋白粘合劑中纖維蛋白原和凝血酶兩種成分的枸櫞酸離子含量測(cè)定的方法。方法采用高效液相色譜法，分析色譜柱為 Welch Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相為18 mmol/L 的磷酸二氫鈉-0.1%異丙醇溶液（磷酸調(diào)節(jié) pH 值至2.0），流速1 ml/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行分析。結(jié)果在該色譜條件下測(cè)得纖維蛋白原和凝血酶兩種成分中枸櫞酸離子的濃度線性范圍分別為1～9 mmol/L（ r=0.999）、0.1～0.9 mmol/L（ r=0.999）。加樣回收率分別為99.55%～102.63%（ n=18）、99.69%～101.61%（RSD=0.60%， n=12）。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高，專屬性強(qiáng)，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性好，可用于測(cè)定豬源纖維蛋白粘合劑中的枸櫞酸離子含量。

[關(guān)鍵詞]豬源纖維蛋白粘合劑;纖維蛋白原;凝血酶;枸櫞酸離子;高效液相色譜法

[中圖分類號(hào)] R28? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A?? [文章編號(hào)]2095-0616（2021）23-0078-04

Determination of citrate ion in porcine fibrin adhesive by HPLC

JIANG? Yuhui??? LIANG? Weiyang

Guangdong Institute for Drug Control， Key Laboratory of Blood Products Quality Control of National Medical Products Administration， Guangdong， Guangzhou 510663， China

[Abstract] Objective To establish a method for determination of citrate ion content of fibrinogen and thrombin in porcine fibrin adhesive. Methods HPLC was used， the analytical column was Welch Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm， 5μm）， the mobile phase was 18 mmol/L sodium dihydrogen phosphate -0.1% isopropanol solution （the pH value was adjusted to 2.0 by phosphoric acid）， the flow rate was 1 ml/min， the column temperature was 40℃ ， and the detection wavelength was 210 nm. The standard curve method was used for analyses. Results Under this chromatographic condition， the linear range of citrate concentration in fibrinogen and thrombin was 1-9 mmol/L （r=0.999） and 0.1-0.9 mmol/L （r=0.999）， respectively. The sample recovery rate was 99.55%-102.63%（n=18） and 99.69%-101.61%（RSD=0.60%， n=12）. Conclusion The method is simple， accurate， specific， precise， reproducible and stable， and can be used for the determination of citrate ion in porcine fibrin adhesive.

[Key words] Porcine fibrin adhesive; Fibrinogen; Thrombin; Citrate ion; High performance liquid chromatography

豬源纖維蛋白粘合劑是從健康豬血漿中分別分離、提純豬纖維蛋白原和豬凝血酶，并經(jīng)病毒去除和滅活處理、凍干制成。本品由豬纖維蛋白原及其稀釋劑、豬凝血酶及其稀釋劑4種成分組成，使用時(shí)將纖維蛋白原和凝血酶分別用稀釋劑復(fù)溶后，同時(shí)噴于出血?jiǎng)?chuàng)面，發(fā)揮止血作用[1-2]。

豬源纖維蛋白粘合劑中含有的枸櫞酸離子為枸櫞酸鈉，在豬血采集和生產(chǎn)工藝中引入，因其具有局部抗凝的作用[3-4]，會(huì)影響該藥的止血功效，因此在該藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中要控制其含量。枸櫞酸離子的含量測(cè)定，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的方法有紫外-可見分光光度法[5-6]、酸堿滴定法[7]、離子色譜法[8-9]、全自動(dòng)酶法[10]、高效液相色譜法[11-14]和離子交換-中和滴定法[15]等。本實(shí)驗(yàn)建立的 HPLC 法可以快速準(zhǔn)確測(cè)定豬源纖維蛋白粘合劑中纖維蛋白原和凝血酶兩種成分的枸櫞酸離子含量，為豬源纖維蛋白粘合劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器

高效液相色譜儀（2695/2487，美國(guó) Waters 公司）;電子分析天平（CPA-225D，德國(guó) Sartorius 公司）;真空恒溫干燥箱（VOS-451SD，日本 EYELA 公司）;超純水發(fā)生器（美國(guó) Millipore 公司）。

1.2試藥

枸櫞酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100396-201603，含量100.0%）;異丙醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。豬纖維蛋白原（A 公司，批號(hào)：20131220、20141021、20150605、20150708、20150810; B 公司，批號(hào)：F201501002、BC201501005、 BC201511006），豬凝血酶（A 公司，批號(hào)：20110704、20141007、20131213、20150606、20150708、20150811）。

1.3色譜條件

色譜柱為 WelchUltimateAQ-C18（4.6mm×250 mm，

5μm）;柱溫：40℃;流動(dòng)相：18.0 mmol/L 磷酸二氫鈉-0.1%異丙醇溶液（磷酸調(diào)節(jié) pH 至2.0）;流速1.0ml/min;紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)210nm;進(jìn)樣量：20μl。1.4溶液的制備

1.4.1枸櫞酸對(duì)照品儲(chǔ)備液精密稱取經(jīng)105℃干燥2 h 的枸櫞酸對(duì)照品（C6H8O7，分子量192.14，含量100.0%）1.92 g，用水溶解并定容至100 ml，搖勻得到100 mmol/L 的儲(chǔ)備液。

1.4.2供試品溶液的制備各取樣品1瓶，按標(biāo)示量加水復(fù)溶后，精密量取1 ml，根據(jù)供試品的蛋白質(zhì)濃度，加入適量1.5%磺基水楊酸溶液，混勻。室溫靜置2 h，3000 r/min 離心10 min，取上清液過濾，取續(xù)濾液即得。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取“1.4.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液各適量，分別用水稀釋成適當(dāng)濃度的系列對(duì)照品溶液。纖維蛋白原的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為1、3、5、7、9 mmol/L，凝血酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L。按“1.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定。以枸櫞酸的摩爾濃度（x，mmol/L）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

2結(jié)果

2.1典型色譜圖及回歸方程

對(duì)照品溶液和供試品溶液的典型色譜圖見圖1，枸櫞酸峰出峰時(shí)間穩(wěn)定，峰形良好，與相鄰峰的分離度符合要求?；貧w方程與線性范圍見表1。

2.2方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1定量限與檢測(cè)限考察精密量取“1.4.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，倍比稀釋，并按“1.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限，為0.5946 nmol;當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢出限，為0.0991 nmol。

2.2.2精密度實(shí)驗(yàn)取豬纖維蛋白原（批號(hào)20131220）和豬凝血酶（批號(hào)20150811）樣品，連續(xù)進(jìn)樣6次，枸櫞酸峰面積的 RSD 分別為0.2%、0.5%，表明精密度良好。

2.2.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取豬纖維蛋白原（批號(hào)20150605）和豬凝血酶（批號(hào)20141007）樣品，按“1.4.2”項(xiàng)下分別制備6份供試品溶液，按“1.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定，根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。結(jié)果，纖維蛋白原和凝血酶6份供試品溶液中枸櫞酸離子含量平均值分別為16.5、0.4 mmol/L， RSD 分別為0.9%、1.1%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取豬纖維蛋白原（批號(hào)20141021）供試品溶液，室溫放置0、37 h 時(shí)，進(jìn)樣測(cè)定，兩次峰面積的相對(duì)偏差為0.32%;取豬凝血酶（批號(hào)20150811）供試品溶液，室溫放置0、24 h 時(shí)，進(jìn)樣測(cè)定，兩次峰面積的相對(duì)偏差為0.56%。表明纖維蛋白原和凝血酶供試品溶液室溫放置24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.5加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知枸櫞酸離子含量樣品（豬纖維蛋白原批號(hào)20141021、F201501002，各9份;豬凝血酶批號(hào)20131213，12份），根據(jù)各自枸櫞酸離子標(biāo)準(zhǔn)限度規(guī)定，分別加入一定量的枸櫞酸對(duì)照品，按“1.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“1.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算加樣回收率，見表2。

2.3樣品枸櫞酸離子含量測(cè)定

取豬纖維蛋白原樣品8批、豬凝血酶樣品6批，分別按“1.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“1.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，每批平行測(cè)定2份供試品溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其中枸櫞酸離子含量，見表3。

3討論

豬源纖維蛋白粘合劑在臨床上應(yīng)用日益廣泛，需控制其中的枸櫞酸含量，以期獲得更好的止血效果。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均采用比色法，通過檢測(cè)枸櫞酸與吡啶、醋酐生成的紫紅色溶液吸光度大小來反映枸櫞酸離子含量[5]，其操作過程繁瑣，而且需要用到吡啶、醋酸酐、三氟乙酸等有毒或刺激性試劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員身體有害。因此，有必要建立新的方法測(cè)定豬源纖維蛋白粘合劑中的枸櫞酸離子含量。本研究采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果令人滿意。與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的“比色法”相比較，高效液相色譜法的實(shí)驗(yàn)過程操作較為簡(jiǎn)便，不需要用到有毒試劑，而且準(zhǔn)確性高，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好。

枸櫞酸為三元有機(jī)酸，在色譜柱中的保留較難洗脫。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)選用18.2 mmol/L 磷酸、磷酸二氫鈉（pH 2.0）[16]-0.1%異丙醇溶液作為流動(dòng)相，結(jié)果顯示，枸櫞酸峰與相鄰色譜峰的分離度較差。于是調(diào)整流動(dòng)相為18 mmol/L 的磷酸二氫鈉-0.1%異丙醇溶液，再用磷酸調(diào) pH 值至2.0，使用 C18水相柱，此時(shí)枸櫞酸較快出峰，出峰的峰型好，塔板數(shù)高。雖然不同企業(yè)產(chǎn)品中的輔料不同，但由色譜圖中可看出其他成分均可與枸櫞酸峰達(dá)到基線分離，不干擾其測(cè)定。

枸櫞酸為紫外末端吸收，選擇210 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)既能夠減少溶劑及流動(dòng)相干擾，又保證有足夠響應(yīng)值，進(jìn)行定量檢測(cè)。

由于國(guó)內(nèi)2家企業(yè)生產(chǎn)的豬源纖維蛋白粘合劑中纖維蛋白原和凝血酶的枸櫞酸離子含量差別較大，因此采用了標(biāo)準(zhǔn)曲線法來同時(shí)測(cè)定2家企業(yè)的產(chǎn)品，當(dāng)只有1家企業(yè)樣品時(shí)，也可采用外標(biāo)法來測(cè)定。

本研究采用 HPLC 法檢測(cè)豬源纖維蛋白粘合劑中纖維蛋白原和凝血酶兩種成分的枸櫞酸離子含量，操作簡(jiǎn)便，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性好，可更好地控制該藥品的質(zhì)量。

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（收稿日期：2021-03-30）