異丙酚對熱損傷小鼠氧化應(yīng)激損傷的保護效應(yīng)探究

陳石生

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院太和分院內(nèi)科 廣東廣州510540）

中暑屬于急性熱致疾病，表現(xiàn)為中心體溫迅速升高至40℃以上，伴有中暑神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重時可引起多臟器功能障礙綜合征（MODS），具有較高的致殘率、病死率[1]。高熱可造成人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）生成，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起細(xì)胞毒性改變，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[2~3]。異丙酚是一種短效、快速的鎮(zhèn)靜藥，具有不良反應(yīng)少、易喚醒、起效快等優(yōu)點，同時可抑制細(xì)胞內(nèi)ROS生成，減輕細(xì)胞損害[4]。但異丙酚是否能夠有效改善熱損傷所致的氧化應(yīng)激損傷研究較少。本研究分析異丙酚對熱損傷小鼠氧化應(yīng)激損傷的保護效應(yīng)，為臨床治療提供新思路?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器Gibco公司的胎牛血清（FBS）、胰酶、雙抗；購自ThermoScientificTM公司的ROS、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒；Caspase活性檢測試劑盒（Biovision公司）；英國Astra Zeneca公司提供的異丙酚；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；脂肪乳購自輔仁藥業(yè)集團有限公司；酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 實驗動物SPF級BALB/c小鼠，雄性，6~8周齡，體質(zhì)量25~30 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2011-0015。1.3模型制作與分組 按隨機數(shù)字表法將BALB/c小鼠分為37℃組、37℃+異丙酚組、37℃+脂肪乳組、43℃組、H2O2+異丙酚組、43℃+異丙酚組6組，每組10只。HUVECs鋪入細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，密度1.0×105/ml，置入43℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)實施2 h熱打擊，隨后以5%CO2、37℃常規(guī)培養(yǎng)6 h，創(chuàng)建HUVECs熱打擊模型。37℃+脂肪乳組：在含10%脂肪乳培養(yǎng)基內(nèi)置入細(xì)胞，時間為6 h；37℃+異丙酚組：在含50 μM異丙酚培養(yǎng)基內(nèi)置入細(xì)胞，時間為6 h；43℃+異丙酚組：在含50 μM異丙酚培養(yǎng)基內(nèi)置入細(xì)胞，時間為6 h，隨后實施熱打擊；H2O2+異丙酚組：細(xì)胞先用200 μM H2O2預(yù)處理，再置入含50 μM異丙酚培養(yǎng)基內(nèi)置入細(xì)胞，時間為6 h。

1.4 細(xì)胞活力檢測 用WST-1法檢測，各組處理后放置在孵育箱（37℃）內(nèi)培養(yǎng)6 h，分別在96孔板的每孔內(nèi)加入約10 μl WST-1，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶聯(lián)免疫檢測儀讀取450 nm處的OD值，判斷細(xì)胞活力。

1.5 ROS檢測 用熒光探針法測定主動脈內(nèi)皮ROS表達(dá)。按照試劑盒處理主動脈內(nèi)皮組織，均漿，冷PBS重懸，加入適量熒光探針DHE，37℃、避光孵育30 min，細(xì)胞內(nèi)ROS變化用流式細(xì)胞儀測定，激發(fā)、發(fā)射波長分別為353 nm、515 nm。

1.6 ATP含量檢測 用熒光素-熒光素酶法，將對數(shù)生長期HUVECs鋪入96孔板，每孔5×103，細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后進行上述分組處理，為獲得背景數(shù)值，另準(zhǔn)備對照孔，只含HPSS液，不含細(xì)胞。每孔內(nèi)加入與細(xì)胞懸液等體積的熒光素酶試劑，室溫避光，孵育10 min，穩(wěn)定熒光，用多光譜微孔板閱讀器分析熒光強度。

1.7 Caspase活性檢測 取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的HUVECs實施分組處理，收集細(xì)胞，PBS沖洗，重復(fù)3次，滴加50 μl細(xì)胞裂解液，4℃下作用10 min，對樣品裂解，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心操作1 min，取上清液。分別在每個細(xì)胞樣品內(nèi)加入Caspase底物Ac-DEVD-AMC，37℃下孵育2 h，對Caspase-3/9活性檢測。用酶標(biāo)儀讀取405 nm的OD值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)，用（±s）表示計量資料，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力對比37℃各組細(xì)胞活力對比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），43℃組細(xì)胞活力低于37℃組，且H2O2+異丙酚組、43℃+異丙酚組細(xì)胞活力高于43℃組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞活力對比

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)ROS情況對比37℃各組細(xì)胞內(nèi)ROS含量對比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；43℃組細(xì)胞內(nèi)ROS含量高于37℃組，H2O2+異丙酚組、43℃+異丙酚組細(xì)胞內(nèi)ROS含量低于43℃組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組細(xì)胞內(nèi)ROS情況對比

2.3 各組細(xì)胞內(nèi)ATP情況對比37℃各組細(xì)胞內(nèi)ATP含量對比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；43℃組細(xì)胞內(nèi)ROS含量低于37℃組，43℃+異丙酚組、H2O2+異丙酚組細(xì)胞內(nèi)ATP含量高于43℃組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組細(xì)胞內(nèi)ATP情況對比

2.4 各組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性情況對比37℃各組細(xì)胞內(nèi)Caspase活性對比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；43℃組細(xì)胞 內(nèi)Caspase-3/9活性高于37℃組，43℃+異丙酚組、H2O2+異丙酚組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3/9活性低于43℃組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9活性情況對比

3 討論

中暑的病理生理學(xué)反應(yīng)除熱暴露直接損傷外，繼發(fā)于熱損傷后全身炎癥反應(yīng)綜合征更為關(guān)鍵，能進展為“類膿毒癥”反應(yīng)，誘發(fā)MODS過程[5]。在早期熱損傷中血管內(nèi)皮細(xì)胞（VECs）占有重要地位，既是熱損傷效應(yīng)器官，可覆蓋于全身器官血管內(nèi)皮和循環(huán)系統(tǒng)，又是熱損傷的放大器官，其損傷能夠引起凝血激活、炎癥放大，損傷各種器官功能[6~7]。另外，VECs會減少內(nèi)皮表面糖包和內(nèi)皮細(xì)胞生成活化蛋白C等抗凝成分，增加vWF等促凝成分，促使血小板活化，促進微血栓形成，減少組織灌注，誘發(fā)臟器功能障礙，并會造成內(nèi)皮損害加重，形成惡性循環(huán)，最終誘發(fā)MODS。

ROS是中暑過程中VECs損傷的重要方式之一，熱損傷早期會損傷細(xì)胞DNA，增加細(xì)胞內(nèi)ROS爆發(fā)性，損傷線粒體，造成細(xì)胞死亡。使用ROS特異性抑制劑能夠使細(xì)胞內(nèi)ROS水平，逆轉(zhuǎn)熱損傷所致的細(xì)胞損傷[8]。本研究結(jié)果提示在熱損傷過程中，異丙酚可發(fā)揮抗凋亡、抗氧化損傷、保護線粒體作用。異丙酚起效迅速，用藥后可迅速穿過細(xì)胞膜，廣泛分布至全身各器官組織內(nèi)，可使自由基對ATP的損傷減輕，抑制鈣超載，有助于線粒體呼吸功能改善，還能影響線粒體脂質(zhì)過氧化過程，防止線粒體內(nèi)膜流動性改變、通透性增高，對線粒體膜結(jié)構(gòu)形成保護[9~10]。異丙酚可使熱損傷引起的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷減輕，增加內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位、MPTP穩(wěn)定性，提高細(xì)胞內(nèi)ATP水平，對Caspase介導(dǎo)的線粒體凋亡通絡(luò)形成抑制，阻礙其活化，進而改善內(nèi)皮細(xì)胞線粒體功能。另外，異丙酚還能經(jīng)抑制中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡、減少自由基生成、抑制炎癥介質(zhì)與細(xì)胞因子表達(dá)等發(fā)揮抗氧化作用。

綜上所述，在熱損傷過程中，異丙酚可發(fā)揮抗凋亡、抗氧化損傷、保護線粒體作用。