翁文鳳 伍小方 張凱旋 唐宇 江燕 阮景軍 周美亮
過表達提高苦蕎毛狀根黃酮積累及其耐鹽性
翁文鳳1,2伍小方2張凱旋2唐宇3江燕1阮景軍1周美亮2
(1貴州大學農學院,550025,貴州貴陽;2中國農業(yè)科學院作物科學研究所,100081,北京;3四川旅游學院食品學院,610100,四川成都)
轉錄因子不僅在植物鹽脅迫網絡中起著重要的作用,還可調節(jié)植物類黃酮的積累。在苦蕎品種川蕎1號中克隆了1個具有轉錄激活活性的家族基因?;蚰鼙籒aCl和脫落酸(ABA)誘導表達,在莖和葉中的表達高于根中。對過表達基因毛狀根的總黃酮含量進行檢測,結果顯示,總黃酮含量在過表達株系中顯著高于野生株系。同時檢測其類黃酮合成途徑中關鍵酶基因的表達量,其中黃烷酮-3-羥化酶基因()的表達量較高??赏茰y該過表達毛狀根株系中總黃酮的積累與的表達有關。在NaCl(100mmol/L)脅迫下,各株系的總黃酮積累受到抑制,過表達株系的含量減少至0.63mg/g。并且,在這種壓力下,的表達水平仍然高于對照。植株在受到脅迫后,對照株系的過氧化氫酶(CAT)活性顯著低于過表達株系。隨著野生型植株受到脅迫的增強丙二醛(MDA)含量增加,但過表達株系的含量趨于穩(wěn)定。以上結果表明,在過表達毛狀根中,總黃酮的積累可能是通過關鍵酶基因的上調表達來調節(jié)的。并且可提高苦蕎毛狀根耐鹽性。通過解析對苦蕎毛狀根中總黃酮積累及植株耐鹽性的影響,為蕎麥耐鹽性和解析其耐鹽機制研究奠定基礎。
苦蕎;;類黃酮;鹽脅迫
苦蕎()(2n=16)屬蓼科,為一種藥食同源作物。苦蕎在我國西南等地有較多種植,是經濟收入之一[1]。因其較高的藥用價值和營養(yǎng)價值被國內外很多學者關注??嗍w富含各種營養(yǎng)物質(如抗性淀粉和蛋白質等),生物活性物質也是苦蕎廣受關注的原因之一,比如,類黃酮和酚類具有很好的藥用療效[2],有降低高血壓和治療動脈硬化的功效[3]??嗍w生長的環(huán)境比較惡劣,常常會受到干旱、冷害和鹽害等多種逆境脅迫。而苦蕎對鹽非常敏感,鹽脅迫會抑制苦蕎生長發(fā)育、減少產量、降低籽粒品質,嚴重時甚至會導致死亡。有研究[4-5]表明,在適當鹽濃度的脅迫下,植物體內通過增加次生代謝物(酚類化合物和萜類化合物)來抵抗逆境。而對于蕎麥這種特殊的作物來說,植株體內黃酮類次生代謝物蘆丁的大量積累又能增加其藥用價值。因此,研究苦蕎中黃酮積累和耐鹽性之間的關系尤為重要。
是最大的轉錄因子調控家族之一,由富含堿性氨基酸殘基的DNA結合域和亮氨酸拉鏈二聚結構域相鄰的蛋白質組成[6],在植物光信號、種子成熟、花發(fā)育、種子積累蛋白、非生物和生物脅迫等生物學過程中發(fā)揮重要的作用[7]。轉錄因子廣泛存在于很多物種中,例如:苦蕎基因組中有96個基因[7],擬南芥中有75個基因被發(fā)現(xiàn)[8],水稻中有89個[9],小麥中約有187個[10]。在植物對逆境調控的機制研究中,的功能已經在國內外都有了一定的報道,如鹽脅迫下,植物體內的耐鹽基因可以通過轉錄因子的調節(jié)來表達,從而提高植株的耐鹽性[7]。
Liu等[11]研究表明,鹽脅迫相關基因可被轉錄因子激活表達,提高植株的抗逆性,如在擬南芥中,激活了鹽脅迫響應因子,從而提高了耐鹽性。Zhang等[12]研究表明,轉錄因子可通過脫落酸(ABA)介導的信號途徑參與鹽脅迫響應,如在水稻遭受鹽脅迫后,水稻轉錄因子通過提高體內ABA含量來增強其耐鹽性。植物的耐鹽性還可以通過體內滲透調節(jié)物質的積累來提高,有研究[13]表明,具有基因的煙草可以在鹽脅迫后增加超氧化物歧化酶(SOD)的活性并降低過氧化氫的含量,使得耐鹽性提高。有趣的是,有學者[14]發(fā)現(xiàn)和轉錄因子通過與黃酮合成途徑的相關酶基因和啟動子序列中的光調節(jié)單元(LR-Us)協(xié)同結合參與黃酮類物質的合成。因此,克隆苦蕎轉錄因子,研究其在鹽脅迫下在苦蕎毛狀根中發(fā)揮的作用,為深入了解蕎麥的抗逆機理和培育抗逆蕎麥品種奠定扎實的基礎。
已有研究[15]表明,苦蕎中在抗鹽抗旱中發(fā)揮重要作用,并且也有報道[16]指出轉錄因子家族中的某些成員具有調節(jié)黃酮合成的作用。因此,從川蕎1號中克隆得到基因,分析檢測其轉錄活性及FtbZIP5蛋白的理化性質和結構。通過qRT-PCR分析不同濃度NaCl(0、50、100、150mmol/L)誘導下基因的時空表達模式,通過將其整合到過表達載體pCAMBIA1307中,誘導過表達毛狀根,檢測總黃酮含量,研究基因對苦蕎類黃酮合成代謝通路的影響。通過檢測在100mmol/L NaCl處理0、1、3、5d的毛狀根過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量,評估其抗鹽能力,從而解析基因對苦蕎黃酮合成和鹽脅迫的協(xié)同調節(jié)作用。
以川蕎1號種子(由中國農業(yè)科學院作物科學研究所蕎麥基因資源創(chuàng)新組提供)為材料。首先,用鑷子剝去浸泡后變軟的種皮,加入15~20mL 1% NaClO震蕩6min,15~20mL 75%乙醇搖晃3min,用無菌水洗滌5~6次,將其放入MS培養(yǎng)基中,置于組織培養(yǎng)室(光照2000lx,16h/8h)中生長10d。選擇生長狀態(tài)一致的幼苗,移入MS液體培養(yǎng)基中,用搖床120轉/min搖24h。分別加入不同濃度(0、50、100、150mmol/L)NaCl和ABA(100μmol/L),在0、1、6和12h將幼苗的根、莖、葉單獨取樣,然后立即儲存在-80℃冰箱用于提取RNA。
利用諾唯贊相關試劑盒按照說明書立即將提取的RNA反轉錄為cDNA。利用基因特異性引物,以該cDNA為模板,克隆得到基因,其基因引物見表1。用同源重組的方法構建一個含強啟動子35S的過表達載體;以HI和RI為限制性酶切位點,將的編碼區(qū)()連接到植物過表達載體pCAMBIA1307中。
基因的熒光定量PCR引物在NCBI中設計,以作為內部參考基因,參照盧曉玲等[17]的引物序列。使用TaKaRa, SYBR Premix EXTaqTM(Perfect Real time)(R820A)試劑盒進行qRT-PCR分析。公式為(RQ)=2-ΔΔCT,計算相關基因的相對表達量。
使用同源重組法將的插入AS2-1載體的I和I多克隆位點中,并與pACT2空載體共轉化PJ69-4A感受態(tài)細胞。將其涂板于SD/-Leu-Trp(SD-LT),28℃倒置培養(yǎng)2d,挑單克隆于1×TE buffer液體培養(yǎng)基中,震蕩培養(yǎng)12~16h,點于含濃度5和15mmol/L 3-AT的SD/-Leu-Trp-His(SD-LTH)缺陷培養(yǎng)基上,拍照觀察。其陰性對照為pAS2-1與pACT2空載體共轉化PJ69-4A感受態(tài)細胞。其引物見表1。
利用在線平臺(表2)對FtbZIP5蛋白的理化性質及結構進行預測。利用NCBI數據庫挑選10個已報道基因功能的同家族基因,使用MegaX軟件(鄰域連接法)建立關于FtbZIP5蛋白的進化樹。
將含目的片段的過表達載體pCAMBIA1307-通過A4發(fā)根農桿菌介導,侵染川蕎1號幼苗的莖和葉,誘導毛狀根,取主根系進行PCR鑒定,參考談天斌等[18]的方法。選取陽性根系,培養(yǎng)在MS+100mg/mL頭孢霉素的培養(yǎng)基上。然后選擇健壯的主根系轉移到MS液體(含頭孢霉素)培養(yǎng)基中,在黑暗條件下,搖床120轉/min培養(yǎng)1個月,并更換1次培養(yǎng)基以保證有充足的營養(yǎng)供毛狀根吸收。在波長420nm處,利用AlCl3分光光度法[19]測定過表達毛狀根的總黃酮含量,以A4和空載體(1307空)毛狀根為對照。制作標準曲線為=19.946+0.5193(2=0.9954),其中,為吸光值,為蘆丁濃度。為了研究對黃酮類化合物的調節(jié)作用,檢測其黃酮合成途徑中的關鍵酶基因是重要的,因此,挑選了基因進行qRT-PCR檢測。
將上述誘導的毛狀根轉移到MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d,再次轉移至MS液體培養(yǎng)基(含100mmol/L NaCl)中,在相同條件下培養(yǎng)。并在培養(yǎng)第0、1、3、5天時取樣,并立即儲存于-80℃冰箱備用。主要通過過表達毛狀根的黃酮合成途徑關鍵酶基因的表達量和檢測活性氧代謝相關酶(CAT)活性及物質(MDA)評價毛狀根的耐鹽性。利用酶活檢測試劑盒(索萊寶生化公司)檢測相關酶活性。
表1 引物序列匯總
表2 在線平臺匯總
使用Microsoft Excel 2010進行數據整理,使用IBM SPSS Statistics 25.0進行顯著性分析。
苦蕎基因全長1260bp,共含419個氨基酸。用ExPASy ProtParam進行序列分析,F(xiàn)tbZIP5編碼蛋白的等電點5.06,分子量101153.96,分子式C3742H6226N1260O1555S231;共包含4種氨基酸,其含量從高到低依次為Ala(32.0%)、Gly(26.3%)、Thr(23.3%)和Cys(18.3%)。該基因的不穩(wěn)定指數預測為43.63,為親水蛋白,相對不穩(wěn)定。利用Cell-ploc 2.0預測出位于細胞核中。圖1a為蛋白二級結構的預測結果,無規(guī)則卷曲占比最高,為57.28%;其次為α螺旋,占30.31%;β折疊延伸鏈和β轉角結構分別占10.74%和1.67%。其中,在中間分布的有無規(guī)則卷曲和折疊延伸鏈,兩端主要分布α螺旋,β轉角結構主要分布在碳端。對其FtbZIP5蛋白的三級結構進行預測,該蛋白具有亮氨酸拉鏈典型結構(圖1b)。將與其他已報道的11個轉錄因子構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1c)。結果表明,與小麥耐鹽轉錄因子、和距離較近。從川蕎1號中克隆得到(圖1d)。
如圖2所示,pAS2-1-FtbZIP5+pACT2和對照pAS2-1+pACT2的原液和稀釋液都能在SD-LT缺陷培養(yǎng)基上生長;只有pAS2-1-FtbZIP5+pACT2能在含5或15mmol/L 3-AT的SD-LTH缺陷培養(yǎng)基上正常生長,對照pAS2-1+pACT2沒有生長跡象。表明FtbZIP5在酵母中具有轉錄激活活性。
a:FtbZIP5蛋白二級結構預測;α螺旋(藍色);折疊延伸鏈(紅色);β轉角結構(綠色);無規(guī)則卷曲(紫色)。b:FtbZIP5蛋白三級結構預測。c:FtbZIP5蛋白系統(tǒng)進化樹分析。d:FtbZIP5基因編碼區(qū)序列擴增
1×:原液;10×:稀釋10倍
2.3.1 鹽脅迫下的組織特異性分析 為了進一步確定是否參與了鹽脅迫信號通路,在各組織中,利用qRT-PCR分析了基因受NaCl誘導下的表達情況,并以為內參。結果(圖3a)表明,基因對鹽脅迫很敏感,在不同濃度NaCl處理1h后,基因在根、莖、葉中的表達水平顯著升高。且隨著濃度的升高,根中基因的相對表達量也升高,在NaCl 150mmol/L時最高,是CK(NaCl 0mmol/L)的8倍。在莖中,在NaCl 100mmol/L時,表達量升至最高,比CK高出16倍,隨后降低?;蛟谇o中的表達趨勢與葉相同。如圖3b所示,在用NaCl處理6h以后,在根中的表達受到抑制。在莖和葉中,隨著濃度的增加表達量有升高的趨勢,在NaCl 150mmol/L時,葉中的表達量高達16.50,約是莖(8.13)中的2倍。這表明植物不同組織受到鹽脅迫影響是有先后順序的,依次是根、莖、葉。
2.3.2 ABA誘導下的組織特異性分析 如圖3c所示,ABA(100μmol/L)處理后,在不同組織中的表達量都在1h內迅速增加;且在莖和葉中的表達水平比CK(處理0h)高出40倍以上。在各處理時間段,在根中穩(wěn)定表達;在莖中隨著處理時間的延長,表達量降低;在葉中也是如此。因此,可能參與了苦蕎對ABA誘導的外源脅迫反應和鹽脅迫反應。
顯著差異性用“**”代表,表示P < 0.01,下同
綜上所述,基因在莖和葉中都有高表達水平,且受NaCl和ABA誘導時間和濃度的影響。
通過對組成型過表達毛狀根總黃酮的檢測,結果(圖4)顯示調控毛狀根中的黃酮類物質積累。通過成功誘導出基因的過表達植株(圖4a),檢測了3個過表達毛狀根株系和對照(A4和1307空載體毛狀根)的基因表達量,結果(圖4b)顯示,3個株系中的的表達量都比CK高出幾十至百倍,說明過表達株系構建是成功的。
①生長10d后的川蕎1號無菌苗;②外植體共培養(yǎng);③誘導10d后的外植體;④陽性毛狀根
選擇3個A4、1307空載體株系和3個過表達轉基因株系在同一階段取樣,用分光光度計法測定毛狀根總黃酮含量;其標準曲線為=19.946+0.5193(2=0.9954)。結果(圖5a)顯示,基因過表達株系的總黃酮含量達到0.96mg/g,約是A4野生型株系的2倍,表明基因能夠促進黃酮類化合物的合成。用qRT-PCR檢測關鍵酶基因()的表達量,如圖5b所示,除了的表達量有升高的趨勢外,過表達毛狀根中的表達量都沒有顯著上調甚至是下調。表明基因可能是通過調節(jié)黃酮合成途徑的關鍵酶基因來促進黃酮類化合物的合成。
圖6a所示,用NaCl(100mmol/L)脅迫毛狀根,在7d時,過表達毛狀根總黃酮含量為0.63mg/g,顯著低于不處理時(0.96mg/g),與1307空毛狀根未處理時的含量(0.64mg/g)相差不大。
PAL:苯丙氨酸解氨酶基因;CHS:查爾酮合成酶基因;CHI:查爾酮異構酶基因;F3H:黃烷酮3-羥化酶基因;RT1:鼠李糖基轉移酶基因。“*”表示P < 0.05,下同
以1307空為對照,在NaCl(100mmol/L)脅迫毛狀根3d后,檢測了過表達株系中黃酮合成途徑關鍵酶基因的表達情況。圖6b所示,關鍵酶基因在過表達株系中有升高的趨勢,是1307空的1.5倍;而和都是下降的,表明在鹽脅迫下,黃酮途徑的關鍵酶基因在黃酮合成途徑中發(fā)揮著重要作用。
如圖6c所示,隨著脅迫時間的增長,-OE的CAT活性呈先升高后降低的趨勢,并在脅迫3d時最高,為32.26U/g,是對照(1307空)的2倍多;在脅迫5d時,A4毛狀根的CAT活性低至6.19U/g,但-OE的CAT活性(24.20U/g)和脅迫0d時(21.39U/g)差異不大。由此可知,在鹽脅迫下,毛狀根可能通過增加體內的CAT活性來清除過氧化氫等活性氧,從而提高了毛狀根的耐鹽性。
MDA含量的高低代表了植株體內膜脂受損傷的嚴重程度,也是一個評價植物耐鹽性的指標。由圖6d可看出,其含量在NaCl脅迫后先升高后降低。A4和1307空株系毛狀根MDA含量升高至3d時達到最高值(A4為14.39nmol/g,1307空為18.50nmol/g),高于FtbZIP5-OE(10.36nmol/g);在NaCl的不斷脅迫下,其含量在-OE中趨于穩(wěn)定,且顯著低于另2個株系(<0.01)。由此可以看出,在相同的鹽脅迫下,過表達株系膜脂過氧化程度較低,被損害程度低。
本研究從川蕎1號中克隆了一個抗鹽轉錄因子基因,它通過調控黃酮合成關鍵酶基因的表達來調節(jié)蕎麥類黃酮物質的合成。與其他研究[15]結果類似,該蛋白位于細胞核內,具有轉錄激活活性。此外,對基因在川蕎1號不同組織中的表達進行了檢測,結果表明,鹽脅迫和外源ABA都誘導的表達,且在莖和葉中表達較明顯。通過建立過表達毛狀根株系,檢測到相關酶基因(黃酮合成途徑)在毛狀根中的表達,可知基因通過調控黃酮合成關鍵酶基因來調節(jié)黃酮類物質的合成。通過對毛狀根進行鹽脅迫處理,過表達株系的總黃酮含量顯著高于對照。且過表達毛狀根可能通過提高CAT活性和降低MDA含量來增強其耐鹽性。
在蕎麥中,已經有成熟的根癌農桿菌介導的毛狀根遺傳轉化體系,且得到的毛狀根遺傳穩(wěn)定性高。它們由同一細胞分化而來,得到的陽性過表達毛狀根的概率高,在培養(yǎng)中的增長速度快,且次生代謝產物的產量都高于原植株含量[20]。因此,毛狀根是研究蕎麥重要生物活性物質積累的代謝途徑的理想生物模型。在逆境脅迫下,植株體內次級代謝產物的積累對其耐鹽能力有著很重要的影響,如SOD和MDA對植物具有重要的保護作用[21]。因此,本文通過研究蕎麥毛狀根的耐鹽性,為蕎麥耐鹽生理機制奠定基礎。
植物受鹽害主要表現(xiàn)為體內的生理干旱和活性氧的過度積累。植物遭受嚴重的鹽害會導致體內細胞和組織的氧化損傷,并降低植物產量和品質[22]。有研究[16]表明,在苯丙素途徑中產生的黃酮類代謝產物會在鹽脅迫后發(fā)生變化。在水稻上,花青素、芹菜素-7-O-葡糖苷和毛地黃皂苷等黃酮類化合物可作為植物體內的抗氧化劑,它們通過除去活性氧和降低氧化損傷程度來保護植物,阻止植株和離體的葉片失水,保證植株正常生長[23-24]。本研究中,過表達能促進總黃酮的積累,推測其毛狀根株系具有一定的耐鹽性。
在植物體內,黃酮合成受到和等酶基因的調節(jié)和光照、溫度、逆境脅迫和紫外線等環(huán)境因子的影響[14]。之前的研究[25]表明,植物在鹽脅迫下,體內會產生茉莉酸等激素來誘導參與苯丙素途徑的酶(苯丙氨酸解氨酶),從而導致黃酮類物質的合成。也有研究[26]發(fā)現(xiàn),在用NaCl處理蕎麥時,蕎麥體內黃酮合成基因的表達量顯著增加,導致了黃酮化合物的積累增加。擬南芥中已報道出轉錄因子協(xié)同調節(jié)光誘導的類黃酮合成途徑,主要是與黃酮合成關鍵酶基因和啟動子結合,參與控制光誘導的類黃酮生物合成[14]。在本研究中,促進過表達毛狀根株系的總黃酮積累,且F3H酶基因上調表達。并且在鹽脅迫下,黃酮合成關鍵酶基因的表達沒有受到抑制,表明在鹽脅迫下,很可能是通過調節(jié)黃酮合成關鍵酶基因的表達來調控黃酮合成。
受到鹽脅迫后,植物體內會產生一系列酶清除物質(過氧化物酶)和非酶清除物質(黃酮類物質)來提高植物的耐鹽性[27];在本研究中,受到脅迫后的過表達毛狀根的總黃酮含量(0.63mg/g)高于對照植株。經過100mmol/L NaCl處理不同時間后,過表達株系的CAT活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,這表明在適當的鹽脅迫誘導下,植物可能通過提高體內的CAT活性來清除活性氧,維持植株正常生長,提高植物耐鹽性[28]。在植物中,MDA的積累升高了膜脂過氧化程度,抗逆性降低[29];在文中的過表達毛狀根株系中,MDA含量最低,表明該株系體內的過氧化程度低,組織細胞膜損傷程度低,受到的傷害較小,所以耐鹽性強。綜上所述,基因通過調節(jié)黃酮合成途徑中關鍵酶基因來調控黃酮合成。在鹽脅迫下,通過過表達,增加了毛狀根CAT活性,并降低了MDA含量,從而提高了其耐鹽性。因此,基因上調提高了苦蕎毛狀根黃酮合成并提高其耐鹽性。
在鹽脅迫下總黃酮的積累可能與關鍵酶基因的上調表達有關。并且在鹽脅迫下,可以通過在毛狀根中積累次生代謝產物CAT并減少MDA的積累來提高毛狀根的耐鹽性。據此推測基因上調提高了苦蕎毛狀根黃酮合成并提高其耐鹽性。
[1] 唐宇,邵繼榮,周美亮. 中國蕎麥屬植物分類學的修訂. 植物遺傳資源學報,2019,20(3):646-653.
[2] Liu Y X,Cai C Z,Yao Y L,et al. Alteration of phenolic profiles and antioxidant capacities of common buckwheat and tartary buckwheat produced in China upon thermal processing. Journal of the Science of Food and Agriculture,2019,99(12):5565-5576.
[3] Kanter M,Aktas C,Erboga M. Protective effects of quercetin against apoptosis and oxidative stress in streptozotocin-induced diabetic rat testis. Food and Chemical Toxicology,2012,50(3/4):719-725.
[4] Wahid A,Ghazanfar A. Possible involvement of some secondary metabolites in salt tolerance of sugarcane. Journal of Plant Physiology,2006,163(7):723-730.
[5] Annamaria G,Marco M,Moira M,et al. Effect of nitrogen starvation on the phenolic metabolism and antioxidant properties of yarrow (Becker ex Rchb.). Food Chemistry,2008,114(1):204-211.
[6] Ariel F D,Manavella P A,Dezar C A,et al. The true story of the HD-Zip family. Trends in Plant Science,2007,12(9):419-426.
[7] Liu M,Wen Y,Sun W,et al. Genome-wide identification,phylogeny,evolutionary expansion and expression analyses oftranscription factor family in tartaty buckwheat. BMC Genomics,2019,20(1):483.
[8] Guo X L,Hou X M,F(xiàn)ang J,et al. The rice GERMINATION DEFECTIVE 1,encoding a B3 domain transcriptional repressor,regulates seed germination and seedling development by integrating GA and carbohydrate metabolism. The Plant Journal,2013,75(3):403-416.
[9] Corrêa L G,Ria?o-Pachón D M,Schrago C G,et al. The role oftranscription factors in green plant evolution:adaptive features emerging from four founder genes. PLoS ONE,2008,3(8):e2944.
[10] Li X Y,Gao S Q,Tang Y M,et al. Genome-wide identification and evolutionary analyses oftranscription factors in wheat and its relatives and expression profiles of anther development relatedgenes. BMC Genomics,2015,16:976.
[11] Liu J X,Srivastava R,Che P,et al. Salt stress responses in Arabidopsis utilize a signal transduction pathway related to endoplasmic reticulum stress signaling. The Plant Journal,2007,51(5):897-909.
[12] Zhang S X,Haider I,Kohlen W,et al.Function of the HD-Zip I genein ABA-mediated drought and salt tolerances in rice. Plant Molecular Biology,2012,80(6):571-585.
[13] Lakra N,Nutan K K,Das P,et al. A nuclear-localized histone-gene binding protein from rice () functions in salinity and drought stress tolerance by maintaining chlorophyll content and improving the antioxidant machinery. Journal of Plant Physiology,2015,176:36-46.
[14] Hartmann U,Sagasser M,Mehrtens F,et al. Differential combinatorial interactions of cis-acting elements recognized by,,andfactors control light-responsive and tissue-specific activation of phenylpropanoid biosynthesis genes. Plant Molecular Biology,2005,57(2):155-171.
[15] Li Q,Zhao H X,Wang X L,et al. Tartary buckwheat transcription factor,regulated by,can improve salt/drought resistance in transgenic. International Journal of Molecular Sciences,2020,21(3):1123.
[16] Malacarne G,Coller E,Czemmel S,et al. The grapevinetranscription factor is involved in the regulation of flavonoid biosynthesis. Journal of Experimental Botany,2016,67(11):3509-3522.
[17] 盧曉玲,何銘,張凱旋,等. 苦蕎鼠李糖基轉移酶基因的克隆與轉化毛狀根研究. 作物雜志,2020(5):33-40.
[18] 談天斌,盧曉玲,張凱旋,等.基因的克隆及在苦蕎毛狀根中的功能分析. 植物遺傳資源學報,2019,20(6):1542-1553.
[19] 李為喜,朱志華,李國營,等. AlCl3分光光度法測定蕎麥種質資源中黃酮的研究. 植物遺傳資源學報,2008,9(4):502-505.
[20] Park N I,Li X H,Uddin R M,et al. Phenolic compound production by different morphological phenotypes in hairy root cultures ofGaertn. Archives of Biological Sciences,2011,63(1):193-198.
[21] 蘇文華,張光飛,李秀華,等. 植物藥材次生代謝產物的積累與環(huán)境的關系. 中草藥,2005(9):139-142.
[22] 許盼云,吳玉霞,何天明. 植物對鹽堿脅迫的適應機理研究進展. 中國野生植物資源,2020,39(10):41-49.
[23] Zhan X,Shen Q,Chen J,et al. Rice sulfoquinovosyl transferase SQD2.1 mediates flavonoid glycosylation and enhances tolerance to osmotic stress. Plant Cell Environment,2019,42(7):2215-2230.
[24] Dong N Q,Sun Y,Guo T,et al. UDP-glucosyltransferase regulates grain size and abiotic stress tolerance associated with metabolic flux redirection in rice. Nature Communications,2020,11(1):2629.
[25] Pedranzani H,Sierra-de-Grado R,Vigliocco A,et al. Cold and water stresses produce changes in endogenous jasmonates in two populations ofAit. Plant Growth Regulation,2007,52:111-116.
[26] Li X H,Kim Y B,Kim Y,et al. Differential stress-response expression of two flavonol synthase genes and accumulation of flavonols in tartary buckwheat.Journal of Plant Physiology,2013,170(18):1630-1636.
[27] Abdallah S B,Aung B,Amyot L,et al. Salt stress (NaCl) affects plant growth and branch pathways of carotenoid and flavonoid biosyntheses in. Acta Physiologiae Plantarum,2016,38(3):72.
[28] 王琰,陳建文,狄曉艷. 水分脅迫下不同油松種源SOD、POD、MDA及可溶性蛋白比較研究. 生態(tài)環(huán)境學報,2011,20(10):1449-1453.
[29] 劉會超,賈文慶. 鹽脅迫對白三葉莖的POD、CAT的影響研究. 吉林農業(yè)科學,2009,34(1):43-46.
The Overexpression ofImproves Accumulation of Flavonoid in the Hairy Roots of Tartary Buckwheat and Its Salt Tolerance
Weng Wenfeng1,2, Wu Xiaofang2, Zhang Kaixuan2, Tang Yu3, Jiang Yan1, Ruan Jingjun1, Zhou Meiliang2
(1College of Agronomy, Guizhou University, Guiyang 550025, Guizhou, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3College of Food Science and Technology, Sichuan Tourism University, Chengdu 610100, Sichuan, China)
Thetranscription factors, with an important role in salt stress network, can regulate flavonoid accumulation in plant. In this paper, thefamily genewith transcriptional activation activity, was cloned from the ‘Chuanqiao 1’. Expression ofgene in stems and leaves was higher than that in root when treated by NaCl and abscisic acid. Flavonoid detection was carried out on hairy roots of overexpressing thegene strain, and results showed that flavonoid accumulation in overexpressing strains was significantly higher than that in wild-type plants. And the expression of key enzyme gene flavanone-3-hydroxylase () in flavonoid synthesis pathway was high, which can speculate that accumulation of total flavonoids in overexpressed hair root strains was associated withexpression. Under the stress of 100mmol/L NaCl, the accumulation of total flavonoids in all lines was suppressed, and the content of total flavonoids in overexpression lines decreased to 0.63mg/g, and the expression ofwas still higher than that of the control. Catalase activity of the control was significantly lower than that of the overexpressing strains after stressing. After stressing by NaCl, the content of malondialdehyde in wild-type plants increased and that in overexpressing strains was stable. The above results indicated that overexpressing thegene in the hairy roots, the increase in total flavonoid content may be regulated by the up-regulation of the key enzyme gene; andalso improved the salt tolerance of tartary buckwheat roots. This paper analyzed the role ofin the accumulation of total flavonoids and salt tolerance in the hairy roots of tartary buckwheat, and laid a foundation of studying the salt tolerance of buckwheat and analyzing the salt tolerance mechanism of buckwheat.
Tartary buckwheat;; Flavonoids; Salt stress
10.16035/j.issn.1001-7283.2021.04.001
翁文鳳,主要從事蕎麥品質抗逆研究,E-mail:1332721469@qq.com
阮景軍為通信作者,研究方向為苦蕎種質資源創(chuàng)新和抗逆境關鍵基因挖掘,E-mail:jjruan@gzu.edu.cn;周美亮為共同通信作者,研究方向為蕎麥屬植物種質資源與品質抗逆研究,E-mail:zhoumeiliang@caas.cn
國家重點研發(fā)計劃(2019YFD1001300,2019YFD1001304)
2021-01-12;
2021-05-08;
2021-05-28