廿烷五烯酸單藥和聯(lián)合用藥誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡作用原理的研究

李星 安京華

【摘要】目的：研究廿烷五烯酸在單藥和聯(lián)合用藥時對肺癌細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用的可能原理。 方法：應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測肺癌細(xì)胞的活性氧水平。結(jié)果：通過檢測肺癌細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species， ROS）水平可知，相比卡鉑組與對照組而言，EPA組和聯(lián)合組可明顯提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)論：單獨使用廿烷五烯酸或用聯(lián)合卡鉑治療均可使肺癌細(xì)胞內(nèi)活性氧水平明顯升高，從而使bcl-2表達減弱，可能是肺癌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象增加的原理之一。

【關(guān)鍵詞】廿烷五烯酸；卡鉑；A-549細(xì)胞；ROS

[中圖分類號]R734.2 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]2096-5249（2021）03-0033-02

The study on mechanism of induced apoptosis by eicosapentaenoic acid monotherapy and combination therapy

LI Xing1， AN Jing-hua2 （1. Yufa Town Central Hospital ， Daxing Beijing 102602， China； 2. YanBian University Hospital ， Yanji Jilin 133000， China）[Abstract] Objective： To explore the mechanism of induced apoptosis by eicosapentaenoic acid and carboplatin. Methods： Microplate assay was used to determine Reactive oxygen species （ROS） level of human lung cancer cell line A-549. Results： The level of ROS in EPA group and combined group were significantly higher than those in control group and carboplatin group. Conclusions： ROS lever of EPA group and combined group were obviously increased. expression of bcl-2。That maybe increase the apoptosis of lung cancer cells because ROS can reduce expression of bcl-2.

[Key words] Eicosapentaenoic acid； A-549； ROS

廿烷五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）屬于ω-3多不飽和脂肪酸。PUFAs具有良好的抗癌特性。二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）是一類具有生物活性的大分子，它們的抗癌作用是多樣性的。這些多不飽和脂肪酸具有較高的安全性，在體內(nèi)外均可部分選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞生長。它們還通過增加不同細(xì)胞系對特定抗腫瘤藥物的敏感性來提高化療藥物的療效。這些ω-3多不飽和脂肪酸具有多種抗癌作用，但確切的機制尚不清楚。盡管許多研究已經(jīng)探討了DHA和EPA對實體瘤的作用及其機制，但對于這兩種FAs在血液惡性腫瘤中的作用及其機制還沒有達成共識。目前已有實驗表明ω-3 多不飽和脂肪酸在腫瘤疾病的治療中有作用[1-3]，但其抗腫瘤的具體原理尚處于研究中。本次實驗旨在通過使用EPA單藥和聯(lián)合用藥的不同情況下，研究其誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡增加的可能原理。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 人肺癌A-549細(xì)胞株（北京首都醫(yī)科大學(xué)惠贈）常規(guī)培養(yǎng)于DMEM 培養(yǎng)液中（含10%新生小牛血清），選對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗。

1.2主要試劑 EPA：購自美國SIGMA公司；卡鉑：購于齊魯制藥有限公司；DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium） 培養(yǎng)基購于美國GIBCO，4℃冰箱保存?zhèn)溆?；新生小牛血清（Newborn Calf Serum）：武漢三利生物技術(shù)有限公司，置于56℃恒溫水浴箱30min滅活補體，-20℃冰箱保存； ROS試劑盒：購于碧云天生物公司。

1.3酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞ROS水平 將A-549細(xì)胞制成1×105個/mL細(xì)胞懸液，置于六孔板中培養(yǎng)。設(shè)立對照組，EPA組（EPA 80μg/mL），卡鉑組（卡鉑100μg/mL），聯(lián)合組（EPA 80μg/mL、卡鉑 100μg/mL），每種藥物濃度設(shè)6個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。光密度值（OD值）使用酶標(biāo)儀進行檢測。實驗重復(fù)三次，取平均值。OD值即可反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS18.0進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（_x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞ROS水平 通過實驗結(jié)果可知，用藥48h后，卡鉑組與對照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化無顯著性差異，而EPA組和聯(lián)合組則明顯提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，詳見表1。

3 討論

PUFAs是一大類脂肪酸（FAs）的成員，在其結(jié)構(gòu)中具有多個雙鍵。眾所周知，這些具有生物活性的大分子具有細(xì)胞正常功能所需的各種重要生理作用。這些FAs的許多作用是通過其更活躍的長鏈代謝物介導(dǎo)的，這些代謝物通過改變質(zhì)膜組成、產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)和改變不同基因的表達而起作用。EPA和DHA是長鏈多不飽和脂肪酸（pufa）中的一種，已顯示出多種健康益處。這些FAs通過調(diào)節(jié)包括血壓、凝血、心律和心率在內(nèi)的多種危險因素來降低心血管疾病的風(fēng)險、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，其次，這些FAs對多種代謝途徑的調(diào)節(jié)也有一定的作用，使其在治療炎癥疾病、代謝紊亂（如2型糖尿?。┖兔庖邠p害條件中具有潛在的治療利用價值。長期食用含EPA的食物可顯著增加血漿、血小板和紅細(xì)胞中EPA的含量，且EPA對惡性細(xì)胞都有選擇性作用，對正常細(xì)胞的影響較小。EPA的抗腫瘤作用的機制之一是誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化。其中，保護細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化的主要細(xì)胞內(nèi)機制是GP-x4酶，不同細(xì)胞系對EPA的敏感性可能反映了GP-x4在不同健康細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的差異表達。這將影響保護細(xì)胞免受過氧化損傷的能力。

有關(guān)研究報告顯示，體外EPA處理HL-60和K-562細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞周期延長，G2/M期縮短，兩種細(xì)胞株的壞死率分別為19.6%和4.4%；此外，EPA在HL-60細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的程度更大，其主要通過下調(diào)凋亡的主要調(diào)節(jié)因子bcl-2信號分子的表達來介導(dǎo)，表明EPA（40、60和120μM）可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，但K562細(xì)胞不受EPA對DNA斷裂的影響。盡管不同的EPA敏感和抗EPA白血病細(xì)胞系表達不同水平的促凋亡和抗凋亡因子，如c-myc和Bcl-2，但這些因子表達的差異并不能解釋其對不同細(xì)胞凋亡的不同影響。

此外，一項研究顯示，EPA對兩種淋巴瘤細(xì)胞株Raji和Ramos有誘導(dǎo)壞死和凋亡的作用。使用不同的抗氧化劑逆轉(zhuǎn)EPA的壞死作用，但對其凋亡作用沒有任何影響，表明氧化應(yīng)激是EPA誘導(dǎo)壞死的一種手段。EPA誘導(dǎo)的Ramos細(xì)胞凋亡是通過EPA對凋亡內(nèi)在途徑的直接作用而不是干擾細(xì)胞周期的進展來介導(dǎo)的。三氮雜合酶C是一種酰基輔酶a合成酶（ACS）抑制劑，它的應(yīng)用揭示了ACS在EPA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的重要作用。使用不同的抗氧化劑逆轉(zhuǎn)EPA的壞死作用，但對其凋亡作用沒有任何影響，表明氧化應(yīng)激是EPA誘導(dǎo)壞死的一種手段。EPA誘導(dǎo)的Ramos細(xì)胞凋亡是通過EPA對凋亡內(nèi)在途徑的直接作用而不是干擾細(xì)胞周期的進展來介導(dǎo)的。三氮雜合酶C是一種?；o酶a合成酶（ACS）抑制劑，它的應(yīng)用揭示了ACS在 EPA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的重要作用。實體瘤患者的I期和II期臨床試驗結(jié)果表明，omega-3 FAs是安全的，并且顯示出有希望的結(jié)果，特別是在治療后這些FAs的血濃度顯著升高的患者中應(yīng)用；需要注意的是，EPA改善癌性惡病質(zhì)的推薦劑量為1.5-2g/天，該劑量的副作用很小，然而，增加劑量的益處尚不清楚。盡管多不飽和脂肪酸增加氧化應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物自由基的產(chǎn)生使其易受氧化損傷這一事實臨床上有所爭論，但多不飽和脂肪酸的消耗已被證明是臨床安全的。

有研究顯示，癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，可形成高氧化應(yīng)激狀態(tài)，減少抗凋亡因子bcl-2的表達 [4]，從而增加癌細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。在本實驗中使用活性氧檢測試劑盒檢測肺癌A-549細(xì)胞中ROS水平，可以發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組和EPA組與對照組或卡鉑組相比較，聯(lián)合組和EPA組能顯著引起肺癌A-549細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，且聯(lián)合組升高更明顯。因此推測，當(dāng)EPA單藥或聯(lián)合卡鉑時，肺癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，減少了抗凋亡因子bcl-2的表達，從而引起肺癌細(xì)胞凋亡，為EPA本身及增強卡鉑抗癌作用的原理之一。

參考文獻

[1] 樓健穎， 吳丹， 林漢庭， 等. ω-3多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸對胃癌細(xì)胞株AGS生長和增殖的影響[J]. 中華普通外科雜志， 2007， 22（8）： 613-615.

[2] 秦薇， 朱圣陶. 二十二碳六烯酸對人胰腺癌細(xì)胞增殖的抑制[J].中華臨床營養(yǎng)雜志， 2009， 17（1）： 49-52.

[3] 李星， 安京華， 石俊， 等. ω-3多不飽和脂肪酸廿烷五烯酸單劑以及聯(lián)合卡鉑對人肺腺癌A-549細(xì)胞系增殖和凋亡的影響[J].中華臨床營養(yǎng)雜志， 2012， 20（1）： 30-32.

[4] Mao Y， song G， Cai Q， et al. Hydrogen peroxide-induced apoptosis in human gastric carcinoma MGC803 cells[J]. Cell Biol Int， 2006， 30（4）： 332-327.

作者簡介：李星，北京市大興區(qū)榆垡鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院。E-mail：lix0226@163. com