外源蛋白在CHO細(xì)胞染色體上一個(gè)新位點(diǎn)的定點(diǎn)整合和穩(wěn)定表達(dá)

胡灣灣，丁學(xué)峰，蔡燕飛，陳 蘊(yùn)，段作營(yíng)，金 堅(jiān)，李華鐘*

（1江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無(wú)錫214122；2江南大學(xué)藥學(xué)院，無(wú)錫214122）

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞是當(dāng)前生物制藥領(lǐng)域廣泛使用的宿主細(xì)胞，生產(chǎn)了超過(guò)70%的治療性蛋白質(zhì)［1-2］。構(gòu)建CHO工程細(xì)胞的傳統(tǒng)方法是將外源基因隨機(jī)整合至細(xì)胞基因組內(nèi)，經(jīng)過(guò)多輪篩選獲得重組細(xì)胞系。此方法耗時(shí)費(fèi)力，并且重組CHO細(xì)胞在生產(chǎn)過(guò)程中易丟失目的基因，導(dǎo)致非生產(chǎn)性細(xì)胞克隆逐漸增多，不利于生產(chǎn)及監(jiān)管［3］。尋找穩(wěn)定的整合位點(diǎn)，將外源基因定點(diǎn)整合至CHO細(xì)胞基因組的穩(wěn)定位點(diǎn)，可有效縮短工程細(xì)胞株的構(gòu)建周期并解決表達(dá)不穩(wěn)定問(wèn)題［4］。

初始位點(diǎn)的選擇對(duì)后期的穩(wěn)定表達(dá)起著決定性作用，經(jīng)過(guò)多年的研究發(fā)現(xiàn)了一些潛在熱點(diǎn)，如人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080中14號(hào)染色體上的Ighg2基因、21號(hào)染色體上Gr ik1基因中第12個(gè)外顯子—第13個(gè)內(nèi)含子區(qū)域［5］；CHO-S和HEK293T細(xì)胞的Hi pp11基因［6］等。雖然有許多關(guān)于穩(wěn)定位點(diǎn)的研究，但是目前CHO細(xì)胞還未有穩(wěn)定性高、產(chǎn)量理想的整合位點(diǎn)成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)［6］。因此，CHO細(xì)胞基因組穩(wěn)定位點(diǎn)的尋找發(fā)現(xiàn)，并探索構(gòu)建定點(diǎn)整合的穩(wěn)定高產(chǎn)細(xì)胞株，對(duì)生物藥的研發(fā)生產(chǎn)有著重大意義。

本研究團(tuán)隊(duì)前期敲除了Bcl-2家族中促凋亡Bak和Bax基因獲得了抗凋亡特性明顯提升的Bak-/Bax-CHO-K1細(xì)胞株（Ie3），應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染和染色體步移技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了該細(xì)胞基因組內(nèi)可表達(dá)示蹤基因Zs green1的多個(gè)位點(diǎn)［7］。其中一個(gè)位點(diǎn)位于染色體NW_003614241.1上，在LOC103162683基因和Cob l l1基因之間，富含AT堿基。Cob ll1基因編碼蛋白質(zhì)cordon-bleu WH2 repeat protein like 1，主要與人慢性淋巴細(xì)胞白血病和形成胰島素抵抗相關(guān)［8-11］，而在CHO細(xì)胞中的功能尚不明確。

為探究NW_003614241.1位點(diǎn)穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的能力，本研究首先觀察了于NW_003614241.1第148 118 bp處隨機(jī)整合Zsgreen1的細(xì)胞株（1g11）Zs green1基因表達(dá)情況。接著同樣應(yīng)用研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的抗凋亡Ie3細(xì)胞株［7，12-13］，采用CRISPR/Cas9技術(shù)，在Ie3細(xì)胞染色體NW_003614241.1上148 052～148 157 bp區(qū)域定點(diǎn)整合增強(qiáng)綠色熒光蛋白EGFP，考察該位點(diǎn)的可編輯性和基因表達(dá)的穩(wěn)定性；隨后采用同樣的整合方法在該位點(diǎn)定點(diǎn)整合了一個(gè)分泌蛋白——人血清白蛋白（HSA），檢驗(yàn)此位點(diǎn)表達(dá)分泌性外源蛋白的穩(wěn)定性，旨在探索CHO細(xì)胞染色體基因組中可定點(diǎn)整合穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的新的位點(diǎn)。

1 材料

1.1試劑

無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；BbsⅠ-HF外切酶、T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ（美國(guó)NEB公司）；T4 DNA連接酶（美國(guó)Pro‐mega公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；1×無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（美國(guó)HyClone公司）；CD CHO培養(yǎng)基粉末（美國(guó)Irvine公司）；基因組DNA小量抽提試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；L-谷氨酰胺、嘌呤霉素、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；高保真DNA聚合酶（南京諾唯贊生物科技有限公司）；蛋白酶K（北京索萊寶科技有限公司）；Lipo‐fectamineTM3000試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；HSA抗體、山羊抗小鼠IgG（美國(guó)Abcam公司）。

1.2儀器

C1000 PCR儀、Mini-Protean核酸電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；FACSAria?Ⅲ流式分選儀（美國(guó)BD公司）。

1.3 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞

密碼子優(yōu)化Cas9表達(dá)質(zhì)粒（丹麥科技大學(xué)Dr.Kildegaard饋贈(zèng)）；CD513B-Cas9質(zhì)粒、Psk-U6-gRNA表達(dá)質(zhì)粒（復(fù)旦大學(xué)盧大儒課題組饋贈(zèng)）；大腸埃希菌E.coli DH5α感受態(tài)（北京天根生化科技有限公司）；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞亞株CHO-K1（美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）；Bak-/Bax-CHO-K1細(xì)胞株Ie3（本課題組前期構(gòu)建［5］）；表達(dá)綠色熒光報(bào)告基因Zs green1的Bak-/Bax-CHO-K1細(xì)胞株1g11（本課題組前期構(gòu)建［5］）。

2 方法

2.1 靶向質(zhì)粒的構(gòu)建和位點(diǎn)可編輯性驗(yàn)證

靶向識(shí)別序列sgRNA位于NW_003614241.1中148 052～148 157 bp范圍內(nèi)。首先構(gòu)建sgRNA質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物sgRNA-F和sgRNA-R在以下體系進(jìn)行退火：sgRNA-F 4μL、sgRNA-R 4μL、NEBuf‐fer2 2μL、ddH2O 10μL，水浴95℃5 min，水浴鍋中自然降至室溫。Psk-U6-gRNA質(zhì)粒載體37℃水浴經(jīng)BbsⅠ-HF酶切4 h后，使用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收載體酶切片段。最后，將退火后的sgRNA片段通過(guò)T4 DNA連接酶在16℃過(guò)夜條件下連接至Psk-U6-gRNA載體上。

將構(gòu)建好的sgRNA質(zhì)粒和CD513B-Cas9質(zhì)粒按物質(zhì)的量比1.8∶1用LipofectamineTM3000試劑轉(zhuǎn)染進(jìn)Ie3細(xì)胞。72 h后收集細(xì)胞，提取基因組用edit-F和edit-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ酶切。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。引物序列如表1所示。

Table 1 Primers sequence related to sgRNA

2.2 供體質(zhì)粒構(gòu)建和重組單克隆篩選

sgRNA 5′-ACCCTTGTGCCCCAAAGACAGGG-3′引導(dǎo)Cas9復(fù)合物切割位置在染色體NW_003614241.1第148 097 bp處，上下游的兩段長(zhǎng)度為600 bp的DNA序列分別為5′同源臂和3′同源臂。EGFP供體質(zhì)粒和HSA供體質(zhì)粒由蘇州金唯智生物科技有限公司化學(xué)合成。EGFP供體質(zhì)粒在5′同源臂和3′同源臂之間設(shè)計(jì)綠色熒光基因表達(dá)盒（hPGK-EGFP-SV40 polyA）和嘌呤霉素基因表達(dá)盒（EF1α-PuroR-SV40 polyA），在5′同源臂上游有紅色熒光基因表達(dá)盒（CMV-mCherry-SV40 polyA）。HSA供體質(zhì)粒在5′同源臂和3′同源臂之間設(shè)計(jì)包括人血清白蛋白表達(dá)盒（CMV-HSASV40 polyA）、綠色熒光基因表達(dá)盒（hPGK-EGFPSV40 polyA）和嘌呤霉素基因表達(dá)盒（EF1α-PuroRSV40 polyA），在5′同源臂上游有紅色熒光基因表達(dá)盒（CMV-mCherry-SV40 polyA）。質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

Figure 1 Map of donor plasmidA:Map of EGFP donor plasmid;B:Map of HSA donor plasmid

基因敲入體系主要包括sgRNA質(zhì)粒、Cas9質(zhì)粒和供體質(zhì)粒（EGFP質(zhì)粒/HSA供體質(zhì)粒）。sgRNA靶向識(shí)別位點(diǎn)，在Cas9復(fù)合物的作用下通過(guò)同源修復(fù)將供體質(zhì)粒5′同源臂和3′同源臂之間的元件整合至細(xì)胞基因組內(nèi)，紅色熒光基因設(shè)計(jì)在5′同源臂外側(cè)，用于排除隨機(jī)整合事件，定點(diǎn)整合成功的目的細(xì)胞株會(huì)表達(dá)HSA蛋白、綠色熒光蛋白及嘌呤霉素，且不表達(dá)紅色熒光蛋白，外源基因定點(diǎn)整合示意圖見(jiàn)圖2。

將構(gòu)建好的sgRNA質(zhì)粒、CD513B-Cas9質(zhì)粒和供體質(zhì)粒（EGFP質(zhì)粒/HSA供體質(zhì)粒）按物質(zhì)的量比1.8∶1∶1.8，用LipofectamineTM3000試劑轉(zhuǎn)染進(jìn)Ie3細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，4μg/mL的嘌呤霉素壓篩，對(duì)照組細(xì)胞全部死亡后，收集穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞池，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行單克隆分選，篩選只表達(dá)綠色熒光不表達(dá)紅色熒光的單克隆。分選出的單克隆細(xì)胞培養(yǎng)6~7 d后，將能觀察到細(xì)胞團(tuán)的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。使用基因組DNA小量抽提試劑盒收集基因組作為后續(xù)PCR反應(yīng)的模板DNA。5′同源臂側(cè)PCR和3′同源臂側(cè)PCR中間包含部分重疊片段，通過(guò)5′同源臂側(cè)PCR和3′同源臂側(cè)PCR鑒定目的基因的定點(diǎn)整合，通過(guò)全長(zhǎng)PCR鑒定所獲單克隆細(xì)胞是純合子還是雜合子。

Figure 2 Schematic of exogenous gene site-specific integration into Bak-/Bax-CHO-K1 genomeA:Schematic of EGFP gene site-specific integration into Ie3 genome;B:Schematic of HSA gene site-specific integration into Ie3 genome

在重組細(xì)胞中PCR擴(kuò)增驗(yàn)證5′同源臂側(cè)靶位點(diǎn)定點(diǎn)整合外源蛋白EGFP或HSA的正反向引物分別為5′同源臂-F和5′同源臂-R；在重組細(xì)胞中PCR擴(kuò)增驗(yàn)證3′同源臂側(cè)靶位點(diǎn)定點(diǎn)整合外源基因EGFP的正反向引物分別為3′同源臂-EF和3′同源臂-R；在重組細(xì)胞中PCR擴(kuò)增驗(yàn)證3′同源臂側(cè)靶位點(diǎn)定點(diǎn)整合外源基因HSA的正反向引物分別為3′同源臂-HF和3′同源臂-R。引物所在位置如圖2所示，引物序列如表2所示。

Table 2 Primers used for PCR

2.3 目的蛋白質(zhì)檢測(cè)

綠色熒光報(bào)告蛋白（ZsGreen1）和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）組合使用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，倒置熒光顯微鏡拍攝條件為曝光時(shí)間1 s，增益為2×，拍攝多個(gè)視野，使用Image J軟件分析細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度；流式細(xì)胞儀檢測(cè)以Ie3為陰性對(duì)照，消化后的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液重懸，上樣量為1×104個(gè)，使用FlowJo軟件分析細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

人血清白蛋白（HSA）是血漿中含量最豐富的蛋白，約占血漿總蛋白的60%，作為血漿擴(kuò)容劑用途廣泛，且基于其無(wú)免疫原性、相對(duì)分子質(zhì)量大及半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，多用于白蛋白融合技術(shù)延長(zhǎng)其他激素、抗體等的半衰期［14］。本研究中HSA的檢測(cè)使用Dot blot和Western blot方法，在細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)接種2×105個(gè)細(xì)胞至6孔板內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞匯合度至80%左右時(shí)換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，檢測(cè)上清中HSA含量。Dot blot和Western blot所使用的一抗均為HSA抗體，二抗均為山羊抗小鼠IgG。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)

CHO細(xì)胞有貼壁和懸浮兩種生長(zhǎng)狀態(tài)。貼壁培養(yǎng)使用完全培養(yǎng)基（DMEM/F12+10%胎牛血清）在T75培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)使用無(wú)血清的CD CHO培養(yǎng)基（L-谷氨酰胺8 mmol/L）在37℃、5%CO2、100 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)。

3 結(jié) 果

3.1 1g11細(xì)胞表達(dá)綠色熒光報(bào)告蛋白ZsGreen1的穩(wěn)定性

為了驗(yàn)證NW_003614241.1位點(diǎn)的穩(wěn)定性，首先檢測(cè)慢病毒隨機(jī)整合示蹤基因Zsgreen1的Bak-/Bax-CHO-K1（1g11）細(xì)胞株在貼壁傳代培養(yǎng)過(guò)程中的平均綠色熒光強(qiáng)度。重組細(xì)胞株的穩(wěn)定性包括傳代穩(wěn)定性和凍存穩(wěn)定性，傳代穩(wěn)定性為細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)物表達(dá)量的穩(wěn)定性，凍存穩(wěn)定性是指定期檢查經(jīng)液氮深低溫冷凍的細(xì)胞復(fù)蘇后產(chǎn)物表達(dá)量的穩(wěn)定性［15］。本實(shí)驗(yàn)1g11細(xì)胞連續(xù)傳代60代，其間每隔10代，使用倒置熒光顯微鏡觀察、Image J軟件分析細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度評(píng)價(jià)傳代穩(wěn)定性，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存。復(fù)蘇第10、20、30、40、50和60代的細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀定量分析各代細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)情況評(píng)價(jià)凍存穩(wěn)定性。

圖3-A為1g11細(xì)胞連續(xù)傳代過(guò)程中熒光顯微鏡拍照結(jié)果，可以看出100%的細(xì)胞均發(fā)綠色熒光，圖3-B為Image J軟件分析熒光場(chǎng)照片中細(xì)胞的平均熒光亮度結(jié)果，顯示不同代次的1g11細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度雖有小幅度降低，但表達(dá)綠色熒光蛋白的水平基本一致，圖3-C為FlowJo軟件分析后的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，顯示不同代次的1g11細(xì)胞熒光強(qiáng)度保持在45 000±2 200，與熒光顯微鏡結(jié)果基本一致，證明了1g11貼壁細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性和凍存穩(wěn)定性，初步證明NW_003614241.1位點(diǎn)的穩(wěn)定性。

Figure 3 Expression of green fluorescent protein stability in 1g11 adherent cellsA:Bright field and fluorescence field photos of 1g11 adherent cells of different generations;B:Image J analyzes the average fluorescence mean intensity of cells in bright field photos;C:Green fluorescence intensity of 1g11 adherent cells of different generations

3.2 sgRNA編輯效率驗(yàn)證

檢測(cè)sgRNA在Ie3細(xì)胞內(nèi)的實(shí)際編輯情況，PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)染后細(xì)胞池的Cas9切割位點(diǎn)上下游的序列，用T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ對(duì)PCR產(chǎn)物酶切驗(yàn)證，如果細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了基因編輯事件，DNA會(huì)同源定向修復(fù)在切開缺口處發(fā)生錯(cuò)配，T7核酸內(nèi)切酶Ⅰ可以識(shí)別并切割發(fā)生錯(cuò)配的DNA雙鏈。PCR擴(kuò)增片段大小為850 bp，切割后理論上會(huì)出現(xiàn)302 bp和547 bp兩條條帶，瓊脂糖凝膠電泳圖結(jié)果如圖4-A所示，與理論結(jié)果相符，說(shuō)明sgRNA可以在目標(biāo)靶點(diǎn)有效編輯。使用Image J軟件分析圖4-A凝膠中條帶的灰度值［14］，得到sgRNA在Ie3細(xì)胞內(nèi)的編輯效率為69.5%。

測(cè)序結(jié)果（圖4-B）顯示：在PAM序列上游的第4個(gè)堿基之后發(fā)生了明顯的套峰，Cas9復(fù)合物識(shí)別的位置正是PAM序列上游的3，4堿基之間，這也證明了有細(xì)胞在目標(biāo)靶點(diǎn)發(fā)生了基因編輯事件。

3.3 NW_003614241.1定點(diǎn)整合EGFP基因單克隆細(xì)胞株的篩選

根據(jù)所設(shè)計(jì)的敲入整合策略，成功發(fā)生定點(diǎn)整合事件的細(xì)胞株表達(dá)EGFP，表現(xiàn)為只發(fā)綠色熒光；發(fā)生隨機(jī)整合事件的細(xì)胞株可能既表達(dá)EGFP也表達(dá)mCherry或只表達(dá)mCherry，表現(xiàn)為既發(fā)綠色熒光也發(fā)紅色熒光或只發(fā)紅光；未發(fā)生整合事件的細(xì)胞株不發(fā)熒光。收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選的結(jié)果如圖5所示，以Ie3細(xì)胞為陰性對(duì)照，只發(fā)綠色熒光的細(xì)胞為24.1%，分選只發(fā)綠色熒光的單克隆細(xì)胞。

提取單克隆細(xì)胞基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，如PCR產(chǎn)物的電泳圖（圖6-A，6-B）所示，5′同源臂和3′同源臂PCR產(chǎn)物分別在1 800 bp和3 200 bp附近，與預(yù)期相符，經(jīng)5′同源臂側(cè)PCR、3′同源臂側(cè)PCR篩選出3株陽(yáng)性單克隆株（EGFP-Ie3-19、EGFPIe3-48、EGFP-Ie3-51），PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明在NW_003614241.1上的第148 097 bp處敲入了完整EGFP。全長(zhǎng)PCR結(jié)果（圖6-C）表明獲得的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞為雜合子，測(cè)序結(jié)果顯示4 800 bp大小的條帶包含定點(diǎn)整合完整的EGFP，2 200 bp大小的條帶為未整合的染色體DNA，與預(yù)期相符。

Figure 4 Results of sgRNA editing efficiency verificationA:Agarose gel electrophoresis of T7E1 digests of PCR products of cell pool genome transfected with plasmid sgRNA and CD513B-Cas9,M:DL2000 marker,1:PCR products of Ie3 cell pool transfected with plasmid sgRNA and CD513B-Cas9,2:T7E1 digests PCR products of Ie3 cell pool transfected with plasmid sgRNA and CD513B-Cas9;B:Sequencing of genomic PCR products of Ie3 cells transfected with sgRNA and CD513B-Cas9 plasmid

3.4 定點(diǎn)整合EGFP基因單克隆細(xì)胞株的表達(dá)水平

對(duì)懸浮馴化成功的EGFP-Ie3-19、EGFP-Ie3-48、EGFP-Ie3-51 3株細(xì)胞，每隔15代用流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)情況，如圖7所示3株單克隆均表達(dá)EGFP，熒光強(qiáng)度保持在10 000左右。3株單克隆之間綠色熒光強(qiáng)度也基本保持一致，細(xì)胞間個(gè)體差異較小。表明此位點(diǎn)可以定點(diǎn)整合穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP。

Figure 5 B ak-/Bax-CHO-K1 cell pool sorting results with targeted integration of EGFP

Figure 6 PCR verification results of B ak-/Bax-CHO-K1 cells with targeted integration of EGFP geneA:Results of 5′junction PCR(M:DL 2000 DNA Marker,1:EGFP-Ie3-19,2:EGFP-Ie3-48,3:EGFP-Ie3-51);B:Results of 3′junction PCR(M:DL 5000 DNA Marker,1:EGFP-Ie3-19,2:EGFP-Ie3-48,3:EGFP-Ie3-51);C:Results of out-out PCR(M:DL 5000 DNA Marker,1:EGFP-Ie3-19,2:EGFP-Ie3-48,3:EGFP-Ie3-51,4:Ie3(negative control))

Figure 7 Flow cytometric analysis results of Bak-/B ax-CHO-K1 cells with targeted integration of EGFP geneA:Green fluorescence intensity of EGFP-Ie3-19 cells of different generations;B:Green fluorescence intensity of EGFP-Ie3-48 cells of different gener‐ations;C:Green fluorescence intensity of EGFP-Ie3-51 cells of different generations;D:Comparison result of green fluorescence intensity among EGFP-Ie3-19,EGFP-Ie3-48 and EGFP-Ie3-51

3.5 NW_003614241.1定點(diǎn)整合表達(dá)人血清白蛋白HSA

利用CRISPR/Cas9技術(shù)將可分泌表達(dá)的人血清白蛋白HSA基因整合到Ie3細(xì)胞染色體的NW_003614241.1上的第148 097 bp處，經(jīng)Dot blot篩選最終得到3株陽(yáng)性克隆HSA-Ie3-4、HSA-Ie3-52和HSA-Ie3-61。通過(guò)PCR驗(yàn)證外源基因的整合情況，通過(guò)Western blot檢測(cè)培養(yǎng)上清液中HSA的分泌表達(dá)情況，結(jié)果如圖8所示。PCR產(chǎn)物的電泳圖（圖8-A，8-B，8-C）顯示，5′同源臂和3′同源臂PCR產(chǎn)物分別在4 100 bp和5 500 bp附近，與預(yù)期相符；全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物在7 000 bp和2 200 bp附近均有條帶，7 000 bp大小的條帶包含定點(diǎn)整合的HSA基因，2 200 bp大小的條帶則是Ie3染色體DNA，回收條帶進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與預(yù)期一致。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖8-D）顯示在70 kD左右出現(xiàn)了目標(biāo)條帶，與HSA蛋白的68 kD一致，說(shuō)明在HSA-Ie3-4、HSA-Ie3-52、HSA-Ie3-61 3個(gè)單克隆株中HSA基因得以定點(diǎn)整合和表達(dá)。

4 討 論

Figure 8 PCR and Western blot detection of HSA gene expression on adherent cellsA:Results of 5′junction PCR(M:DL 5 000 DNA Marker,1:HSA-Ie3-4,2:HSA-Ie3-52,3:HSA-Ie3-61);B:Results of 3′junction PCR(M:DL 10 000 DNA Marker,1:HSA-Ie3-4,2:HSA-Ie3-52,3:HSA-Ie3-61);C:Results of out-out PCR(M:DL 10 000 DNA Marker,1:HSA-Ie3-4,2:HSAIe3-52,3:HSA-Ie3-61,4:Ie3(negative control));D:Western blot results of HSA gene expression in adherent cells(M:Molecular mass marker,1:HSA-Ie3-4,2:HSA-Ie3-52,3:HSA-Ie3-61,Exposure time 30 s)

近年來(lái)，關(guān)于如何解決CHO細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的不穩(wěn)定這一問(wèn)題，研究人員已經(jīng)進(jìn)行了多方面的嘗試。傳統(tǒng)的隨機(jī)整合方法，不能從根本上消除基因組的固有不穩(wěn)定性及整合位點(diǎn)不穩(wěn)定這兩個(gè)因素，而尋找CHO細(xì)胞基因組內(nèi)的穩(wěn)定位點(diǎn)，將外源基因通過(guò)定點(diǎn)整合的方式整合至位置已知的位點(diǎn)［17］，可以有效避免這一問(wèn)題。初始位點(diǎn)的選擇對(duì)后期的穩(wěn)定表達(dá)起著決定性作用，理想的位點(diǎn)應(yīng)具備穩(wěn)定性強(qiáng)、適用度寬、表達(dá)量高等特性。

本課題組前期利用慢病毒轉(zhuǎn)染及染色體步移技術(shù)發(fā)現(xiàn)的多個(gè)潛在穩(wěn)定表達(dá)位點(diǎn)中，有的位點(diǎn)，Zsgreen1報(bào)告基因的表達(dá)受培養(yǎng)條件的制約，無(wú)血清培養(yǎng)條件下Zsgreen1表達(dá)水平大大降低；有的位點(diǎn)，序列中含有較多的未知堿基無(wú)法進(jìn)行編輯［7］，所以需要對(duì)每一潛在位點(diǎn)的可編輯性和表達(dá)外源蛋白的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

染色體NW_003614241.1上148 052~148 157 bp區(qū)域也是本課題組利用慢病毒轉(zhuǎn)染及染色體步移技術(shù)發(fā)現(xiàn)的CHO細(xì)胞基因組內(nèi)新的表達(dá)位點(diǎn)之一［7］，經(jīng)60代傳代實(shí)驗(yàn)證明慢病毒整合的綠色熒光示蹤基因Zsgreen1在貼壁1g11細(xì)胞中可以穩(wěn)定表達(dá)。將EGFP基因用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)整合到抗凋亡Ie3細(xì)胞的上述位點(diǎn)的第148 097 bp處，在懸浮培養(yǎng)傳代60代過(guò)程中EGFP可以穩(wěn)定表達(dá)，說(shuō)明該位點(diǎn)可以定點(diǎn)整合并穩(wěn)定表達(dá)EGFP蛋白。將HSA基因用同樣的方法定點(diǎn)整合到該位置，經(jīng)檢測(cè)HSA基因也可以穩(wěn)定表達(dá)，說(shuō)明該位點(diǎn)可以定點(diǎn)整合并穩(wěn)定表達(dá)分泌蛋白。上述結(jié)果表明該位點(diǎn)有望是一個(gè)可定點(diǎn)整合表達(dá)外源蛋白的理想位點(diǎn)。

本研究所獲得的成功定點(diǎn)整合到此位點(diǎn)的6株陽(yáng)性單克隆均為雜合子，單拷貝的外源基因會(huì)影響表達(dá)水平。通過(guò)聯(lián)合利用其他位點(diǎn)進(jìn)行在多個(gè)位點(diǎn)定點(diǎn)整合同一外源基因，或者通過(guò)在該位點(diǎn)插入著陸墊，利用Bxb1重組酶系統(tǒng)在著陸墊上插入多拷貝，或者利用IRES序列將外源基因串連整合表達(dá)，都可能通過(guò)增加目的基因的拷貝數(shù)，有效提高外源基因的表達(dá)水平［18］。