免疫檢查點(diǎn)B7-H3表位疫苗的設(shè)計(jì)及其抗腫瘤活性

夏雪霏，張 莉，羅建華，姚文兵，高向東，田 浤*

（1中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京211198；2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊830054）

B7-H3（也稱CD276）是一種免疫檢查點(diǎn)分子，屬于B7超家族，在正常組織中廣泛低表達(dá)，同時(shí)在多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，如黑色素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等［1］。在惡性組織中，B7-H3抑制腫瘤抗原特異性免疫反應(yīng)，從而產(chǎn)生致癌作用［2］。此外，B7-H3還具有非免疫原發(fā)性腫瘤發(fā)生功能，例如促進(jìn)腫瘤遷移和侵襲［3］。有研究表明，B7-H3的過(guò)度表達(dá)會(huì)持續(xù)地抑制人類T細(xì)胞反應(yīng)［4］，尤其優(yōu)先下調(diào)Th1型輔助細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［5］；同時(shí)有研究顯示，在人類肝細(xì)胞癌中，B7-H3通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的M2型極化［6］，抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成，從而加速腫瘤進(jìn)展［7-8］。還有研究表明，B7-H3分子可通過(guò)與NK細(xì)胞上表達(dá)的尚未確定的抑制性受體相互作用而保護(hù)腫瘤免受自然殺傷細(xì)胞的裂解［9］。因此盡管B7-H3的響應(yīng)配體尚未發(fā)現(xiàn)，但腫瘤表面B7-H3的高表達(dá)會(huì)通過(guò)抑制Th1細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞的功能進(jìn)而抑制抗腫瘤免疫活性，使B7-H3分子成為抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)的良好靶標(biāo)。

目前針對(duì)B7-H3分子設(shè)計(jì)的藥物如enoblitu‐zumab（MGA271）為單克隆抗體，在臨床Ⅰ期階段表現(xiàn)出了一定的抗腫瘤活性［10］。異種移植小鼠模型中，靶向B7-H3的CAR-T細(xì)胞在血液瘤和實(shí)體瘤中都產(chǎn)生明顯治療效果［11］。但抗體和CAR-T療法均屬于被動(dòng)免疫治療，存在給藥劑量大、患者依從性差、不能產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答等問(wèn)題。相較于被動(dòng)免疫，主動(dòng)免疫能夠有效刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答［12］，并產(chǎn)生記憶性免疫細(xì)胞以維持長(zhǎng)久療效，防治腫瘤復(fù)發(fā)；產(chǎn)生多克隆抗體，防止抗原突變?cè)斐傻拿庖咛右?；同時(shí)抗原用量較小且給藥次數(shù)少，可以提高患者用藥依從性［13］，因此，開(kāi)發(fā)針對(duì)B7-H3的疫苗具有良好的應(yīng)用前景。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)的硝基化T細(xì)胞表位為基礎(chǔ)［14］，用柔性肽將硝基化T表位與B7-H3分子胞外區(qū)B表位連接，構(gòu)建了靶向B7-H3分子的表位疫苗［15］。B7-H3表位疫苗可以在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出高滴度特異性抗體，能有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，與PD-L1蛋白疫苗聯(lián)用有明顯的協(xié)同效應(yīng)，并能有效改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境。

1 材料

1.1試劑

3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（北京索萊寶科技有限公司）；小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液、小鼠腫瘤淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清FBS（美國(guó)Gibco公司）；PE標(biāo)記的抗小鼠CD3抗體、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體、APC標(biāo)記的抗小鼠CD8抗體、PerCP/Cyanine5.5標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠IL-4抗體、APC標(biāo)記的抗小鼠CD25抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠Foxp3抗體（美國(guó)Bio‐legend公司）；固定破膜液、洗滌緩沖液（美國(guó)BD公司）。

多肽和佐劑均為南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2動(dòng)物

BALB/c雌性小鼠（6～8周齡），SPF級(jí)，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 細(xì)胞株

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26（中國(guó)藥科大學(xué)江蘇省生物藥物成藥性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.4儀器

恒溫培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；水平離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Countstar全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（上海澤權(quán)儀器設(shè)備有限公司）；AccuriC6 PLUS流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

2 方法

2.1 B7-H3分子表位預(yù)測(cè)與肽疫苗設(shè)計(jì)

通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org）查詢得到免疫檢查點(diǎn)B7-H3分子胞外區(qū)氨基酸序列為：B7-H3（29~248）：VEVQVSEDPVVALVDT DATLRCSFSPEPGFSLAQLNLIWQLTDTKQLVHSF TEGRDQGSAYSNRTALFPDLLVQGNASLRLQRVR VTDEGSYTCFVSIQDFDSAAVSLQVAAPYSKPSMT LEPNKDLRPGNMVTITCSSYQGYPEAEVFWKDGQ GVPLTGNVTTSQMANERGLFDVHSVLRVVLGAN GTYSCLVRNPVLQQDAHGSVTITGQPLTFPPEA通過(guò)IEDB（http：//www.iedb.org）表 位 在 線 預(yù) 測(cè) 網(wǎng)站對(duì)免疫檢查點(diǎn)分子B7-H3的B表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，并綜合評(píng)價(jià)ParkerHydrophilicity、Chou&Fas‐manBeta-Turn、EminiSurfaceAccessibility、Karplus&SchulzFlexibility、BepipredLinearEpitope多 種B表位預(yù)測(cè)方法結(jié)果，綜合考慮選擇表位的氨基酸長(zhǎng)度。用柔性肽將硝基化T表位與B7-H3分子胞外區(qū)B表位連接，構(gòu)建靶向B7-H3分子的表位疫苗。所有多肽送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2.2 ELISA法評(píng)價(jià)B7-H3肽疫苗免疫原性

2.2.1 動(dòng)物分組及免疫方案 BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組：PBS組、2種不同氨基酸長(zhǎng)度的表位疫苗組，每組6只，確保免疫前組間小鼠體質(zhì)量不產(chǎn)生顯著性差異。免疫方式：腹股溝皮下免疫，疫苗每只50μg，CpG佐劑每只10μg，每周1次，共3次。免疫后每周對(duì)小鼠進(jìn)行眼底靜脈叢取血，6 000 r/min離心20 min，分離上清液即為所需血清，對(duì)血清適當(dāng)稀釋后檢測(cè)第1次免疫后第21和28天抗體滴度。

2.2.2 ELISA法檢測(cè)血清抗體滴度 B7-H3多肽包被于酶標(biāo)條中，37℃孵育2 h；PBST清洗液洗滌5次；加入封閉液，4℃孵育過(guò)夜；PBST清洗液洗滌5次。小鼠血清體積稀釋12 800倍，作為一抗；37℃孵育2 h；PBST清洗液洗滌6次；加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，37℃孵育45 min；PBST清洗液洗滌6次；TMB顯色，37℃避光孵育15 min。加入H2SO4終止；在450/630 nm波長(zhǎng)的條件下檢測(cè)吸收度。

2.3 B7-H3表位疫苗抑瘤效果評(píng)價(jià)

2.3.1 CT26結(jié)腸癌模型構(gòu)建及動(dòng)物分組 每只BALB/c小鼠于右前肢腋下處皮下注射5×105個(gè)CT26細(xì)胞，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到10 mm3左右時(shí)，取造模成功的小鼠，以腫瘤體積大小為標(biāo)準(zhǔn)按照區(qū)間隨機(jī)分組的方法，將小鼠分為4組，每組6只，分別為PBS組、B7-H3-NitraTh組、PD-L1-NitraTh組、B7-H3-NitraTh+PD-L1-NitraTh聯(lián)用組，確保分組時(shí)組間小鼠體重和腫瘤體積均不產(chǎn)生顯著性差異，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 免疫方案 分組后的小鼠隨即進(jìn)行第1次免疫。PBS組、B7-H3-NitraTh組、PD-L1-NitraTh組、B7-H3-NitraTh+PD-L1-NitraTh聯(lián)用組均與CpG佐劑聯(lián)合免疫小鼠，免疫方式：皮下注射，單給藥每次每只50μg，聯(lián)合給藥每種疫苗給藥每次每只25μg，每周免疫1次，共免疫3次。每3天記錄小鼠的體重和腫瘤體積。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到1 500 mm3時(shí)，處死小鼠，取小鼠脾臟、腫瘤、肝、腎進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 B7-H3疫苗對(duì)小鼠脾臟T細(xì)胞亞群分化的影響

2.4.1 小鼠淋巴細(xì)胞的分離 處死小鼠，在75%乙醇中浸泡5~10 min，無(wú)菌條件下取出脾臟，并用PBS對(duì)脾臟進(jìn)行清洗，使用2 mL注射器內(nèi)芯研磨，研磨后組織通過(guò)70μm篩網(wǎng)；用PBS對(duì)細(xì)胞和篩網(wǎng)進(jìn)行沖洗，轉(zhuǎn)移至離心管中，430 r/min離心10 min。棄上清液，加入PBS 1 mL重懸；緩慢滴加細(xì)胞懸液至3 mL淋巴細(xì)胞分離液上層，保持淋巴細(xì)胞分離液與細(xì)胞懸液液面清晰分層；1 032 r/min離心20 min，小心吸取淋巴細(xì)胞層；加入PBS 8 mL，430 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)1次；用PBS重懸細(xì)胞至濃度為每毫升5×106個(gè)備用。

2.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟T細(xì)胞的分化情況 流式抗體標(biāo)記：CD4+T細(xì)胞（PE標(biāo)記的抗小鼠CD3抗體、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體）、CD8+T細(xì)胞（PE標(biāo)記的抗小鼠CD3抗體、APC標(biāo)記的抗小鼠CD8抗體）、Th1細(xì)胞（FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體、PerCP/Cyanine5.5標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ抗體）、Th2細(xì)胞（FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠IL-4抗體）。設(shè)置空染組、單染組作為校正，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別標(biāo)記PE標(biāo)記的抗小鼠CD3抗體、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體、APC標(biāo)記的抗小鼠CD8抗體，4℃孵育30 min。PBS重懸后602 r/min離心5 min，棄上清液。加入固定破膜液重懸細(xì)胞，4℃避光孵育20 min。加入洗滌緩沖液清洗兩次，1 032 r/min離心5 min，棄上清液。標(biāo)記PerCP/Cyanine5.5標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠IL-4抗體，4℃避光孵育30 min。加入洗滌緩沖液清洗1次，1 032 r/min離心5 min，棄上清液。PBS重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 B7-H3疫苗對(duì)小鼠結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境的影響

2.5.1 腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的獲取 剪取適量大小的腫瘤樣本（約1 g），用2 mL注射器內(nèi)芯研磨，邊研磨邊加入PBS沖洗，使得腫瘤組織經(jīng)過(guò)70μm篩網(wǎng)潤(rùn)洗至6孔板中。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管，按照體積比1∶1加入等量的淋巴細(xì)胞分離液。2 000 r/min離心15 min。將乳白色淋巴細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新的15 mL離心管中，向離心管中加入10 mL PBS，2 000 r/min，15 min。棄上清液，用PBS重懸細(xì)胞至濃度為每毫升5×106個(gè)備用。

2.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞情況流式抗體標(biāo)記：CD4+T細(xì)胞（PE標(biāo)記的抗小鼠CD3抗體、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體）、CD8+T細(xì)胞（PE標(biāo)記的抗小鼠CD3抗體、APC標(biāo)記的抗小鼠CD8抗體）、Treg細(xì)胞（FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體、APC標(biāo)記的抗小鼠CD25抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠Foxp3抗體）。設(shè)置空染組、單染組作為校正，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞標(biāo)記PE標(biāo)記的抗小鼠CD3抗體、FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體、APC標(biāo)記的抗小鼠CD8抗體、APC標(biāo)記的抗小鼠CD25抗體，4℃孵育30 min。PBS重懸后602 r/min離心5 min，棄上清液。加入固定破膜液重懸細(xì)胞，4℃避光孵育20 min。加入洗滌緩沖液清洗兩次，1 032 r/min離心5 min，棄上清液。加入PE標(biāo)記的抗小鼠Foxp3抗體，4℃避光孵育30 min。加入洗滌緩沖液清洗1次，1 032 r/min離心5 min，棄上清液。PBS重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各項(xiàng)結(jié)果以xˉ±s表示。采用Student′s t-test對(duì)兩組樣本進(jìn)行顯著性比較，采用Two-Way ANO‐VA對(duì)受雙因素影響的（腫瘤體積和小鼠體重）多組樣本進(jìn)行顯著性比較，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 B7-H3表位疫苗的設(shè)計(jì)與篩選

B7-H3分子蛋白質(zhì)胞外區(qū)預(yù)測(cè)得到的不同氨基酸長(zhǎng)度的B表位序列如下：

B7-H3（B14）：FTEGRDQGSAYSNR；B7-H3（B20）：AAPYSKPSMTLEPNKDLRPG

通過(guò)柔性連接肽GPSL將預(yù)測(cè)的B7-H3蛋白分子胞外區(qū)B表位序列與通用硝基化T細(xì)胞表位（AKFVAAWTLKpNO2PheAA）序列連接，構(gòu)建B7-H3表位肽疫苗候選分子。所有多肽送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成的多肽表位疫苗氨基酸序列分別為：B7-H3（B14）+T（p NO2Phe）11：FTEGRDQGSAYSNRGPSLAKFVAAWTLK（p NO2Phe）AA；B7-H3（B20）+T（p NO2Phe）11：AAPYSKPSMTLEPNKDLRPGGPSLAKFVAAWTLK（p NO2Phe）AA。

為了篩選出免疫原性較高的多肽表位疫苗，用兩種多肽表位疫苗分別免疫BALB/c小鼠，每周1次，共3次。取第1次免疫后第21、28天的小鼠血清，使用ELISA法檢測(cè)抗體滴度。結(jié)果如圖1-A所示，在第21天，2種多肽表位疫苗都可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體。但是在第28天，B7-H3（B20）+T（p NO2Phe）11誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性B7-H3抗體的能力顯著 高于B7-H3（B14）+T（p NO2Phe）11（P＜0.001）（圖1-A）。因此，選擇B7-H3（B20）+T（p NO2Phe）11用于后續(xù)研究，以下簡(jiǎn)稱為B7-H3-NitraTh表位疫苗。

對(duì)PBS組和經(jīng)過(guò)3次疫苗免疫后的B7-H3-NitraTh疫苗組小鼠肝腎進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示，B7-H3-NitraTh表位疫苗組小鼠肝腎細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯異常（圖1-B）。

Figure 1 Immunogenicity of B7-H3 epitope vaccine（xˉ±s,n=6）A:Antibody titers produced by different B7H3 vaccines after immunizing mice;B:Liver and kidney HE staining of mice immunized with PBS and B7-H3-NitraTh(200×)*P＜0.05,**P＜0.01,****P＜0.000 1 v s PBS group

3.2 B7-H3-NitraTh疫苗的抗腫瘤活性評(píng)價(jià)

在BALB/c小鼠皮下構(gòu)建CT26實(shí)體瘤模型，設(shè)置PBS組、B7-H3-NitraTh疫苗組，同時(shí)將B7-H3-NitraTh與實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的PD-L1-NitraTh蛋白疫苗聯(lián)用，以期獲得更好的抑瘤效果。結(jié)果如圖2-B所示。相比于PBS對(duì)照組，B7-H3-NitraTh疫苗組可以顯著抑制腫瘤體積增長(zhǎng)（P＜0.001），而聯(lián)用組相較于B7-H3-NitraTh疫苗組更能顯著提高抑瘤效果（P＜0.001）。此外，小鼠體質(zhì)量監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，各組間沒(méi)有顯著差異，疫苗的免疫沒(méi)有引起明顯的自身免疫相關(guān)不良反應(yīng)（圖2-C）。

Figure 2 Anti-tumor activity of B7-H3-NitraTh vaccine in mice with colon cancerA:Picture of the tumor removed from the sacrificed mice after the treatment(n=3);B:Mouse tumor volume growth curve measured after immunization with B7-H3-NitraTh vaccine(xˉ±s,n=6);C:Curve of the weight change of mice measured after immunization with B7-H3-NitraTh vaccine(xˉ±s,n=6)****P＜0.000 1 vs PBS group;####P＜0.000 1 v s B7-H3-NitraTh group

3.3 小鼠結(jié)腸癌模型中脾臟CD4+T細(xì)胞分化情況

為了探究腫瘤疫苗的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)脾臟中CD4+T細(xì)胞亞群的變化情況。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與PBS組相比，B7-H3-NitraTh組小鼠脾臟中CD3+CD4+T細(xì)胞比例有明顯提升（P＜0.001），而相較于B7-H3-NitraTh或PD-L1-NitraTh單給藥組，B7-H3-NitraTh+PD-L1-NitraTh組脾臟中CD3+CD4+T細(xì)胞比例更是產(chǎn)生了顯著性提高（圖3-A）。同時(shí)與對(duì)照組相比，B7-H3-NitraTh與PDL1-NitraTh聯(lián)用能顯著性促進(jìn)Th1（CD4+IFN-γ+T）細(xì)胞極化（圖3-B），其Th1細(xì)胞的比例達(dá)到（2.18±0.39）%。這些結(jié)果表明，B7-H3-NitraTh疫苗可以促進(jìn)脾臟中CD4+T細(xì)胞增殖，進(jìn)而更好地輔助CD8+T細(xì)胞發(fā)揮腫瘤殺傷作用，且與PD-L1-NitraTh聯(lián)用后能顯著誘導(dǎo)Th0細(xì)胞朝Th1分化，分泌炎性細(xì)胞因子IFN-γ，促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生。

3.4 小鼠結(jié)腸癌模型中脾臟和腫瘤CD8+T細(xì)胞分化情況

研究疫苗治療后對(duì)結(jié)腸癌小鼠的脾臟和腫瘤中CD8+T細(xì)胞亞群的影響，結(jié)果顯示，脾臟中CD3+CD8+T細(xì)胞比例在B7-H3-NitraTh疫苗給藥后顯著高于對(duì)照組（P＜0.001）；將B7-H3-NitraTh疫苗與PD-L1-NitraTh疫苗聯(lián)用后，脾臟中CD3+CD8+T細(xì)胞比例有了進(jìn)一步的提升，與B7-H3-NitraTh或PD-L1-NitraTh單給藥組相比產(chǎn)生顯著性差異（P＜0.001）（圖4-A）。對(duì)于腫瘤中浸潤(rùn)的CD3+CD8+T細(xì)胞比例，B7-H3-NitraTh疫苗單獨(dú)給藥后較PBS組有所提高（P＜0.05）；而兩種疫苗聯(lián)用后，脾臟中CD3+CD8+T細(xì)胞比例與對(duì)照組相比產(chǎn)生了更明顯的提高，同時(shí)與B7-H3-NitraTh單給藥組相比產(chǎn)生顯著性差異（P＜0.01）（圖4-B）。這些結(jié)果表明，B7-H3-NitraTh疫苗可以促進(jìn)外周免疫器官和腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞數(shù)量的增多，更好地發(fā)揮CTL效應(yīng)，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。

3.5 小鼠結(jié)腸癌模型腫瘤微環(huán)境Treg細(xì)胞變化

為了進(jìn)一步探究B7-H3-NitraTh疫苗治療后對(duì)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的影響，檢測(cè)了腫瘤中Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。與PBS組相比，B7-H3-Ni‐traTh組可以明顯減少抑制性Treg細(xì)胞的比例（P＜0.01），而相對(duì)于單給藥組，B7-H3-NitraTh+PD-L1-NitraTh聯(lián)合給藥又能進(jìn)一步顯著降低腫瘤中Treg細(xì)胞浸潤(rùn)，Treg細(xì)胞的比例達(dá)到（1.04±0.16）%（P＜0.001）。結(jié)果表明B7-H3-NitraTh疫苗可以減少腫瘤浸潤(rùn)的抑制性Treg細(xì)胞的比例，從而改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境。

Figure 3 Differentiation of CD4+T cells in the spleen of mice with colon cancer（xˉ±s,n=3）A:Frequency of CD4+T cells in the spleen after immunization with B7-H3-NitraTh vaccine;B:Frequency of Th1(CD4+IFN-γ+)T cells in the spleen after immunization with B7-H3-NitraTh vaccine***P＜0.001,****P＜0.000 1 vs PBS group;##P＜0.01,####P＜0.000 1 vs B7-H3-NitraTh group;&&&P＜0.001 vs PD-L1-NitraTh group

Figure 4 Frequency of CD8+T cells in the spleen and tumor of mice with colon cancer（xˉ±s,n=3）A:Frequency of CD8+T cells in the spleen after immunization with B7-H3-NitraTh vaccine;B:Frequency of CD8+T cells in the tumor after immuniza‐tion with B7-H3-NitraTh vaccine*P＜0.05,***P＜0.001,****P＜0.000 1 vs PBS group;##P＜0.01,####P＜0.000 1 vs B7-H3-NitraTh group;&&&P＜0.001 vs PD-L1-NitraTh group

Figure 5 Frequency of Treg cells in the tumor microenvironment of mice with colon cancer after immunization with B7H3 vaccine（xˉ±s,n=3）**P＜0.01,***P＜0.001 vs PBS group

4 討 論

免疫檢查點(diǎn)是治療性腫瘤疫苗設(shè)計(jì)的良好靶點(diǎn)［16］，但是免疫檢查點(diǎn)的B表位預(yù)測(cè)是其中一個(gè)難點(diǎn)。本研究使用的IEDB數(shù)據(jù)庫(kù)是目前應(yīng)用最廣泛的表位數(shù)據(jù)庫(kù)之一。此數(shù)據(jù)庫(kù)收集了已經(jīng)經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)確定的T、B細(xì)胞表位以及主要組織相容性復(fù)合物，同時(shí)提供了Parker Hydrophilicity、Chou&Fasman Beta-Turn、Emini Surface Accessibility、Kar‐plus&Schulz Flexibility、Kolaskar&Tonqaokar Antiqenicity、Bepipred Linear Epitope等多種預(yù)測(cè)工具，分析親水性、可及性、抗原性，并綜合B表位長(zhǎng)度篩選預(yù)測(cè)結(jié)果。

此外，考慮到免疫檢查點(diǎn)是自身蛋白，存在免疫耐受，較低的免疫原性限制了疫苗的開(kāi)發(fā)。而本課題組前期篩選得到一種硝基化通用Th表位，該表位可以和多種小鼠MHCⅡ類分子以及人的HLAⅡ類分子結(jié)合，打破MHC限制性［15］，同時(shí)借助免疫原性氨基酸對(duì)硝基苯丙氨酸打破自身免疫耐受，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該硝基化T細(xì)胞表位可以輔助自體蛋白HER-2和PD-L1打破免疫耐受，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度特異性抗體［17-18］。因此將B7-H3分子B表位預(yù)測(cè)序列通過(guò)柔性連接肽GPSL與硝基化通用T表位相連構(gòu)成表位多肽疫苗免疫小鼠，結(jié)果顯示兩種不同氨基酸長(zhǎng)度的表位疫苗均能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，一定程度上表明預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，提示未來(lái)可以通過(guò)此方法快速篩選得到蛋白分子B表位。但是相比于14個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的B7-H3（B14）+T（pNO2Phe）11，20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度B7-H3（B20）+T（pNO2Phe）11能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更高滴度的特異性抗體，且隨時(shí)間增加抗體滴度逐漸增高，證明其具有較強(qiáng)的免疫原性。因此，選擇B7-H3-NitraTh表位疫苗用于后續(xù)研究。

臨床前研究表明，免疫檢查點(diǎn)的同時(shí)阻斷可產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤效果［19］。因此嘗試將具有一定抗腫瘤活性的B7-H3-NitraTh疫苗與實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的PD-L1蛋白疫苗聯(lián)用，以期獲得更好的抑瘤效果。結(jié)果顯示，B7-H3-NitraTh+PD-L1-NitraTh疫苗聯(lián)合給藥相較于B7-H3-NitraTh疫苗單給藥可更加顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)。

通過(guò)檢測(cè)脾臟中淋巴細(xì)胞變化情況探究腫瘤疫苗的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)兩種給藥方式都在一定程度上刺激了T細(xì)胞活化并提高CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例。CD4+T細(xì)胞可與在抗原呈遞細(xì)胞表面表達(dá)的MHC-Ⅱ反應(yīng)而激活，激活的CD4+T細(xì)胞可分泌細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)或協(xié)助免疫反應(yīng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，B7-H3-NitraTh+PD-L1-NitraTh疫苗聯(lián)合給藥可顯著提高Th1的比例，即誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1（CD4+IFN-γ+T）細(xì)胞方向極化。Th1細(xì)胞主要分泌炎性細(xì)胞因子，如IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α、TNFβ等，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，起到免疫殺傷作用；Th1細(xì)胞也可促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、活化巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和其他細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，在激活免疫系統(tǒng)并清除腫瘤細(xì)胞中起到重要作用［20］。

實(shí)體腫瘤中浸潤(rùn)的效應(yīng)T細(xì)胞，一定條件下可控制腫瘤的發(fā)展，臨床研究表明，腫瘤組織高CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)與患者預(yù)后成正相關(guān)［21］，但同時(shí)腫瘤中也會(huì)有抑制性的調(diào)節(jié)性Treg細(xì)胞的浸潤(rùn)，Treg可抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［22］。B7-H3-NitraTh疫苗可以增加腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞的比例，同時(shí)減少腫瘤中抑制性Treg細(xì)胞的比例，提示可能存在使腫瘤浸潤(rùn)的抑制性Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化為分泌IFN-γ的炎癥細(xì)胞等相關(guān)機(jī)制［23］，從而改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境，這需要后續(xù)進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究篩選得到的B7-H3表位疫苗可以產(chǎn)生高滴度特異性抗體，有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，并能增加腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞的比例，同時(shí)減少腫瘤中抑制性Treg細(xì)胞的比例，改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境，可以作為有效的腫瘤疫苗候選。并在與免疫檢查點(diǎn)PD-L1疫苗聯(lián)用后可以產(chǎn)生更好的抑瘤效果，促進(jìn)Th1細(xì)胞極化，為不同免疫檢查點(diǎn)阻斷劑之間的聯(lián)合給藥提供參考。