氣管滴注PM2.5混懸液對(duì)肺纖維化小鼠的影響及新對(duì)葉百部堿的干預(yù)作用

錢(qián)秀惠，孫 靜，付 三，湯小艷，許翔鴻，張 勉

（中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，南京211198）

灰霾主要由SO2、氮氧化物和可吸入顆粒物組成。流行病學(xué)研究表明，可吸入顆粒物（particu‐late matter，PM）濃度的升高與人群疾病的發(fā)病率和病死率密切相關(guān)［1］。PM2.5是指空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑不超過(guò)2.5μm的顆粒物，能夠透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入下呼吸道，沉積于支氣管和肺泡，并可透過(guò)肺泡壁入侵整個(gè)血液循環(huán)系統(tǒng)，可導(dǎo)致肺部、心血管、中樞神經(jīng)等多部位疾病的發(fā)生和加重［1-6］。目前普遍認(rèn)為PM2.5的致病機(jī)制主要是引起肺部炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而影響心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)［1-3］。肺纖維化是一種慢性進(jìn)行性發(fā)展的間質(zhì)性肺疾病，表現(xiàn)為進(jìn)行性細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，肺組織結(jié)構(gòu)破壞及肺功能逐步喪失，患者多死于進(jìn)行性加重的肺纖維化所致的呼吸衰竭，病死率高，且其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［7-8］。關(guān)于PM2.5對(duì)呼吸系統(tǒng)影響的研究主要集中于肺損傷，對(duì)肺纖維化的報(bào)道較少［9-12］，且PM2.5給藥方式、次數(shù)和劑量等差別較大，大多沒(méi)有考慮霧霾天氣中PM2.5的濃度，現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義有限。因此，本研究以我國(guó)頒布的PM2.5濃度與空氣污染等級(jí)的關(guān)系為依據(jù)［13-14］，確定PM2.5的給藥濃度范圍；在此基礎(chǔ)上研究了PM2.5單獨(dú)滴注（對(duì)正常小鼠的影響）、與博來(lái)霉素（BLM）聯(lián)合滴注（對(duì)肺纖維化小鼠的影響）以及PM2.5滴注次數(shù)對(duì)正常小鼠和肺纖維化小鼠的影響。本研究結(jié)果對(duì)于健康者和肺部疾病患者如何應(yīng)對(duì)霧霾天氣具有一定的指導(dǎo)意義。

百部是潤(rùn)肺止咳的傳統(tǒng)中藥，對(duì)葉百部（StemonatuberosaL.）是中藥百部的主要基源之一，新對(duì)葉百部堿（neotuberostemonine，NTS）是對(duì)葉百部的主要的活性成分，具有止咳、改善肺損傷和肺纖維化的作用［15-18］。本研究擬在探討PM2.5對(duì)BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化影響的基礎(chǔ)上，研究NTS對(duì)PM2.5與BLM聯(lián)合誘導(dǎo)給藥的小鼠肺纖維化是否具有改善作用。

1 材料

1.1 藥品與試劑

鹽酸博來(lái)霉素（bleomycin，BLM，浙江海正輝瑞制藥有限公司）；尼達(dá)尼布（nintedanib，Nib，濟(jì)南軒德化工有限公司）；新對(duì)葉百部堿（neotuberoste‐monine，NTS）為本課題組從對(duì)葉百部（Stemonatu?berosaL.）塊根中分得，其純度大于98%（HPLC歸一化法）［19］；水合氯醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。α-SMA抗體（中國(guó)武漢Proteintech公司）；TGF-β抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；GAPDH（上海Abways公司）；羊抗兔IgG（H+L）HRP（聯(lián)科生物有限公司）。羥脯氨酸（HYP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RIPA裂解液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。其余試劑均為市售分析純。

1.2儀器

TH-150F型智能中流量TSP（total suspended particle，空氣總懸浮微粒）采樣器（南京長(zhǎng)祺環(huán)保設(shè)備有限公司）；DW-86L386式超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）；3700型低溫高速離心機(jī)（日本久保田株式會(huì)社）；冷凍干燥機(jī)（日本東京理化器械株式會(huì)社）；酶標(biāo)儀、電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3動(dòng)物

清潔級(jí)雄性ICR小鼠，6周齡，體重22~24 g，購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（蘇）2017-0007。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度24~26℃、相對(duì)濕度50%~60%、晝夜節(jié)律為12 h/12 h的環(huán)境中，自由飲水、進(jìn)食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物飼養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格遵守《中國(guó)藥科大學(xué)倫理委員會(huì)章程》的規(guī)章和制度。

2 方 法

2.1 PM2.5藥液制備分法

將TSP采集器置于室外（中國(guó)藥科大學(xué)江寧校區(qū)）24 h，按照操作說(shuō)明取下PM2.5收集濾片，剪碎，加雙蒸水50 mL超聲20 min，過(guò)濾。濾液于5 000 r/min離心20 min，棄上層，加雙蒸水50 mL超聲，重復(fù)上述步驟4次得到PM2.5混懸液，冷凍干燥即得。稱(chēng)取適量PM2.5粉末，充分分散于0.9%生理鹽水中，制成所需濃度的PM2.5藥液。現(xiàn)用現(xiàn)配，用前混勻。

2.2 小鼠模型制備及給藥方法

2.2.1 模型制備方法 小鼠禁食不禁水12 h，4%水合氯醛麻醉后固定，無(wú)創(chuàng)法氣管滴入所需濃度的藥液50μL，將鼠板直立，旋轉(zhuǎn)1 min，靜置1 min，放回鼠籠休息。BLM劑量為1.5、3 U/kg，于第0天（D0）天滴注。PM2.5劑量為5 mg/kg（經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定），分別滴注3次（D1、D8、D15）或6次（D1、D4、D8、D11、D15、D18），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)至第21天。第22天處死小鼠，取肺組織，分別進(jìn)行病理切片和相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

2.2.2 NTS給藥方案 博來(lái)霉素滴注后的第8天（D8）開(kāi)始，給藥組和陽(yáng)性藥組小鼠分別灌胃給予NTS（30 mg/kg）和Nib（30 mg/kg），假手術(shù)組和模型組小鼠給予同體積的0.9%生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥至第21天。第22天處死小鼠，取肺組織，分別進(jìn)行病理切片和相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。

2.3 肺組織病理切片制作及評(píng)價(jià)方法

10%中性福爾馬林溶液固定的肺組織制作常規(guī)石蠟切片（4μm厚），蘇木精-伊紅（HE）或Mas‐son染色。HE染色切片由專(zhuān)業(yè)研究人員于光學(xué)顯微鏡下閱片，根據(jù)肺泡隔是否增厚、肺內(nèi)血管和氣管周?chē)欠裼醒仔约?xì)胞浸潤(rùn)、支氣管上皮細(xì)胞是否變性脫落以及肺組織是否充血”進(jìn)行炎性評(píng)分，每項(xiàng)的病變由基本正常到重度依次標(biāo)記為0、1、2、3、4、5分，累加4項(xiàng)分?jǐn)?shù)為炎性評(píng)分。Masson染色切片于光學(xué)顯微鏡下觀察膠原纖維（藍(lán)色）的分布情況，每張組織切片選取上、下、左、右和中間5個(gè)視野進(jìn)行拍照，采用Image J軟件選定并計(jì)算每張照片藍(lán)色膠原部分面積和除空白外的總組織面積，計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF，collagen volume frac‐tion），CVF（%）=藍(lán)色膠原面積/總組織面積×100。

2.4 羥脯氨酸含量測(cè)定

小鼠肺組織適量冷凍干燥至恒重，按照羥脯氨酸試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行羥脯氨酸含量的測(cè)定。

2.5 α-SMA和TGF-β蛋白表達(dá)測(cè)定

小鼠肺組織適量，加入RIPA裂解液，充分勻漿裂解后，于4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，Westernblot方法檢測(cè)α-SMA和TGF-β的蛋白表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以xˉ±s表示，單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗(yàn)方差齊性。兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間多重比較采用LSD檢驗(yàn)（方差齊性）或Tamhane′s T2檢驗(yàn)（方差不齊性）。因素主效應(yīng)及其交互效應(yīng)采用析因設(shè)計(jì)方差分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 BLM劑量和PM2.5頻次對(duì)肺纖維化小鼠的影響

為了探索BLM劑量與PM2.5給藥次數(shù)對(duì)小鼠肺纖維化模型的影響，采用析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)研究了BLM劑量（0、1.5、3.0 U/kg）和PM2.5混懸液（5 mg/kg，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）給藥頻次（0、3、6次，即每周0次或1次或2次）對(duì)小鼠肺纖維化的影響。具體通過(guò)考察小鼠單給予PM2.5混懸液3次（P3）或6次（P6），或單給予BLM 1.5 U/kg（B1）或3U/kg（B2），或給予BLM 1.5U/kg+PM2.5混 懸 液3次（C13）或6次（C16），或給予BLM 3U/kg+PM2.5混懸液3次（C23）或6次（C26）的肺纖維化相關(guān)指標(biāo)變化來(lái)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果如表1、圖1所示。與假手術(shù)（sham）組相比，除P3組外其余各組的HYP含量均顯著升高；各組肺組織切片的HE炎性評(píng)分均顯著高于假手術(shù)組；除P3、P6、B1組外其余各組肺組織切片（Masson染色）的膠原沉積分?jǐn)?shù)（CVF）均顯著高于假手術(shù)組，說(shuō)明BLM高劑量組（P＜0.05）和各聯(lián)合給藥組（P＜0.01）小鼠均發(fā)生了實(shí)質(zhì)性肺纖維化。與B1組相比，聯(lián)合給藥C13、C16組小鼠HYP含量、HE炎性評(píng)分和膠原沉積分?jǐn)?shù)CVF均顯著高于B1組；與B2組相比，聯(lián)合給藥的C23、C26組小鼠主要表現(xiàn)為膠原沉積分?jǐn)?shù)CVF顯著升高。與P3組相比，C13、C23組小鼠HYP含量、炎性評(píng)分和CVF均顯著高于P3組。與P6組比，C16、C26組小鼠的HYP含量和CVF顯著升高。

Table 1 Factorial design groups and experimental results(xˉ±s,n=5)

Figure 1 Effects of BLM dose and PM2.5 administration times on pulmonary fibrosis in miceThe mice grouping scheme and dosing plan are shown in Table 1.BLM were intratracheally given to mice on day 0 and PM2.5 on days 1,8,15(3 times)or on days 1,4,8,11,15,18(6 times),and kept until day 21A:Lung injury was assessed by HE staining(×100);B:Collagen deposition was assessed by Masson′s trichrome staining(blue,×100)

析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表2，BLM劑量和PM2.5頻次對(duì)HYP、HE評(píng)分和膠原沉積分?jǐn)?shù)CVF均有顯著影響（P＜0.01），二者的交互作用僅對(duì)CVF有一定影響（P＜0.05）。從F來(lái)看，BLM濃度對(duì)HYP含量和CVF的影響大于PM2.5給藥次數(shù)的影響，而PM2.5給藥次數(shù)對(duì)HE評(píng)分的影響大于BLM劑量的影響。從方差分析結(jié)果看，BLM劑量為3 U/kg、PM2.5給藥6次時(shí)小鼠肺纖維化極為嚴(yán)重，不太適合用于考察藥物的藥效；且當(dāng)BLM濃度為3 U/kg時(shí)，小鼠病死率也較高。因此選擇BLM劑量1.5 U/kg、PM2.5給藥3或6次為造模方案。

Table 2 Analysis of variance forBLM dose and PM2.5 frequency

3.2 NTS對(duì)PM2.5與BLM聯(lián)合造模肺纖維化小鼠的影響

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以BLM（1.5 U/kg）、PM2.5給藥3次為模型M1，以BLM（1.5 U/kg）、PM2.5給藥6次為模型M2，以美國(guó)FDA于2014批準(zhǔn)的治療肺纖維化藥物尼達(dá)尼布（nintedanib，Nib）［20］為陽(yáng)性藥，研究新對(duì)葉百部堿（NTS）對(duì)M1和M2模型小鼠的影響，實(shí)驗(yàn)方案如表3所示。從小鼠體重和肺系數(shù)來(lái)看（圖2），小鼠體重整體來(lái)說(shuō)差別不大；NTS1組的肺系數(shù)較之M1組降低（P＜0.05），而NTS2組較之M2組差異不顯著。小鼠肺組織HE、Masson染色結(jié)果（圖3）顯示，NTS1和NTS2均有降低M1和M2炎性評(píng)分的趨勢(shì)；NTS1組較之M1模型組可顯著降低CVF（P＜0.01），NTS2組較之M2模型組亦可明顯降低CVF，但由于數(shù)據(jù)離散度大而無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從α-SMA和TGF-β蛋白表達(dá)（圖4）來(lái)看，NTS可顯著降低M1或M2模型組的α-SMA表達(dá)（P＜0.01、0.05），但是對(duì)TGF-β影響不大。

4 討 論

肺組織損傷后如果不能正常修復(fù)，就會(huì)引起成纖維細(xì)胞的異常大量增殖并轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，后者分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（膠原蛋白）而導(dǎo)致肺纖維化發(fā)生［7］。羥脯氨酸（HYP）是膠原中特有的氨基酸［21］，其含量可間接反映膠原蛋白的沉積程度；α-SMA蛋白是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白［22］，可反映成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的程度；而TGFβ是公認(rèn)的最強(qiáng)促纖維化因子，能夠直接誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［23］。因此，本實(shí)驗(yàn)選用以上常用指標(biāo)和組織病理切片（結(jié)合半定量分析）對(duì)肺纖維化模型和藥效進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

Table 3 Preparation of pulmonary fibrosis model and dosage regimen of NTS

Figure 2 Effect of NTS on body weight and lung coefficient in mice with pulmonary fibrosis(xˉ±s,n=9-11)1.5 U/kg BLM was intratracheally given to mice on day 0,and 5 mg/kg PM2.5 was intratracheally given on days 1,8,15(M1 model)or on days 1,4,8,11,15,18(M2 model).NTS and Nib(positive drug)were orally given to mice from day 8 to day 21A:Changes of body weight;B:Lung coefficient**P＜0.01,***P＜0.001 vs sham group;#P＜0.05 vs M1 group;Tamhane′s T2 test for B

Figure 3 Effect of NTS on histopathological changes of lung tissue in mice with pulmonary fibrosisA:HE staining lung section(×100);B:Masson staining lung section(×100,collagen stained in blue);C:inflammatory score(xˉ±s,n=5);D:colla‐gen volume fraction(CVF%=collagen area/total tissue area×100%,xˉ±s,n=5)*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs sham group;++P＜0.01,+++P＜0.001 v s BLM group;##P＜0.01 vs M1 group;Tamhane′s T2 test for C and D

Figure 4 Effects of NTS onα-SMA and TGF-βlevels in mice with pulmonary fibrosisα-SMA and TGF-βlevels were evaluated by Western blot(xˉ±s,n=3)*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 vs sham group;#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001 v s M1 group;×P＜0.05 vs M2 group;LSD-test

我國(guó)2012年發(fā)布的《環(huán)境空氣質(zhì)量指數(shù)（AQI）技術(shù)規(guī)定（試行）》和《環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》［13-14］，根據(jù)24 h PM2.5的平均值規(guī)定了0~500μg/m38個(gè)濃度限值，PM2.5與空氣質(zhì)量的關(guān)系為：0~35μg/m3為優(yōu)，35~75μg/m3為良，75~115μg/m3為輕度污染，115~150μg/m3為中度污染，150~250μg/m3為重度污染，大于250μg/m3為嚴(yán)重污染。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，成年人的呼吸速率約為16.5 m3/d，進(jìn)入肺部的空氣為呼吸速率的0.75（氣體交換比）［24］，因此一個(gè)成年人24 h吸入的空氣量約為12.4 m3。如果PM2.5的平均濃度為250μg/m3，則24 h吸入的PM2.5為3.09 mg，按60 kg體重計(jì)，每千克體重為0.052 mg，折算成小鼠給藥劑量為0.465≈0.50 mg/kg。因此，小鼠給藥5 mg/kg是0.5 mg/kg（250μg/m3）的10倍，即相當(dāng)于PM2.5濃度為2 500μg/m3。

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BLM與PM2.5混合后滴注（第0天），小鼠纖維化程度明顯小于非混合式的聯(lián)合滴注（BLM第0天、PM2.5第1天）；5、10 mg/kg的PM2.5與BLM聯(lián)合給藥均能明顯加重BLM引起的肺纖維化，但高劑量時(shí)小鼠病死率高。因此本實(shí)驗(yàn)采用了5 mg/kg PM2.5、非混合式的聯(lián)合給藥方法，并采用析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化BLM劑量和PM2.5給藥次數(shù)。結(jié)果顯示，單獨(dú)的PM2.5滴注3次只有HE評(píng)分較之假手術(shù)組明顯升高，滴注6次時(shí)HYP和HE評(píng)分顯著增加但膠原容積分?jǐn)?shù)CVF無(wú)顯著升高，表明PM2.5即使多次給藥引起肺纖維化的可能性也較小。但也有研究顯示，雖然PM2.5短期暴露（5.4 mg/kg、每3天1次、共10次）不會(huì)立即導(dǎo)致肺纖維化，但停止暴露后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)可能會(huì)逐漸發(fā)展為肺纖維化［25］。但是，PM2.5與BLM聯(lián)合造模各組小鼠的膠原容積分?jǐn)?shù)CVF大大增加，說(shuō)明二者的相互作用對(duì)膠原沉積影響顯著，即PM2.5可大大加重BLM引起的肺纖維化。NTS對(duì)于PM2.5和BLM聯(lián)合造成的肺纖維化具有較好的修復(fù)作用。

關(guān)于PM2.5對(duì)肺纖維化的影響，臨床流行病學(xué)調(diào)查研究的結(jié)果并不一致［26-27］。從病理學(xué)研究結(jié)果來(lái)看，造模方法有PM2.5+BLM聯(lián)合造模［9-10］和PM2.5單獨(dú)造模［11-12］，基本都認(rèn)同PM2.5對(duì)于肺纖維化具有促進(jìn)作用。從PM2.5的滴注劑量來(lái)看，與BLM聯(lián)合造模周期為21 d，PM2.5劑量為單次滴注3.75 mg/kg（大鼠，約相當(dāng)于小鼠5.6 mg/kg）［9］或100 mg/kg［10］；PM2.5獨(dú)立造模周期為28 d，PM2.5劑量為每小鼠每d0.1 mg（0.1 mg/25 g=4 mg/kg）［11］或50 mg/kg、每周2次（大鼠，約相當(dāng)于小鼠75 mg/kg）［12］。按照給藥劑量與PM2.5濃度的換算，小鼠給藥劑量75~100 mg/kg相當(dāng)于大氣PM2.5濃度37 500~50 000μg/m3，估計(jì)這樣的濃度在自然狀態(tài)下極難達(dá)到。

本研究結(jié)果顯示，單純的PM2.5對(duì)正常人的影響主要是引發(fā)肺部炎癥，如果濃度低或持續(xù)時(shí)間短則能夠自愈，不會(huì)發(fā)展成肺纖維化；但是對(duì)于有肺纖維化疾?。ɑ蚱渌粑阑蚍尾考膊。┑娜藙t影響較大，會(huì)極大地加速或加重原有疾病的發(fā)展。NTS對(duì)實(shí)驗(yàn)性肺纖維化具有較好的療效。