棉花光敏雄性不育系psm5 的培育及其育性轉(zhuǎn)變規(guī)律

茍浩琦，馬常凱，張遷，范術(shù)麗，馬啟峰，張朝軍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽(yáng) 455000）

雄性不育在植物界中較為普遍，可遺傳的雄性不育分為染色體型和基因型。 染色體型主要是由遠(yuǎn)緣雜交引起，導(dǎo)致子代表現(xiàn)出雄性不育的性狀?；蛐托坌圆挥挚煞譃楹速|(zhì)互作雄性不育型和細(xì)胞核雄性不育型[1]，在棉花中均有發(fā)現(xiàn)。棉花細(xì)胞質(zhì)不育系主要有哈克尼西棉胞質(zhì)不育系[2-3]、亞洲棉胞質(zhì)不育系、異常棉胞質(zhì)不育系[4-5]、三裂棉胞質(zhì)不育系[6]、陸地棉胞質(zhì)不育系和海島棉胞質(zhì)不育系，我國(guó)雜交棉育種中應(yīng)用較多的是哈克尼西棉胞質(zhì)不育系。 由于應(yīng)用不育系的強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合選配困難， 雖然有品種審定， 如中棉所99[7]，但未在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用。 已報(bào)道的棉花核不育系有17 個(gè)不同類型， 包括9 個(gè)隱性核不育系，分別是ms1、ms2、ms3、ms5ms6、ms8ms9、ms13、ms14、ms15和ms16[8-9]；8 個(gè) 顯 性 核 不 育 系，分 別 是Ms4、Ms7、Ms10、Ms11、Ms12、Ms17、Ms18以及Ms19[10]。棉花隱性核不育系在制種應(yīng)用中要拔除50%的可育株，嚴(yán)重影響制種效率，因此在生產(chǎn)上應(yīng)用較少。

環(huán)境敏感型核不育（Environment-sensitive genic male sterile，EGMS）是一種特殊的核不育系類型，參與植物的光形態(tài)建成、 開花和晝夜節(jié)律調(diào)控等[11]。 20 世紀(jì)70 年代我國(guó)首先發(fā)現(xiàn)了光溫敏感型水稻不育材料[12]，開啟了兩系雜交稻的生產(chǎn)應(yīng)用。 水稻中曾發(fā)現(xiàn)多種溫敏核雄性不育材料，如安農(nóng)S-1、廣占63S 等，已發(fā)現(xiàn)的基因主要有tsm1、tsm2、tsm3、tsm4、tsm5、tsm6等[13-14]。光敏雄性不育水稻主要有農(nóng)墾58S、培矮64S，主要光敏不育基因有pms1、pms2、pms3、pms5等[15]；另外，還發(fā)現(xiàn)了反式光敏不育系、反式溫敏不育系等材料[16-17]。 此后，由溫度、光周期調(diào)控的雄性不育材料在大麥、玉米、高梁、油菜等作物中被發(fā)現(xiàn)。 在玉米中報(bào)道了光敏、溫敏不育系[18]；小麥中報(bào)道了光敏[19]、溫敏[20]、光溫敏[21]核不育系；大麥中發(fā)現(xiàn)光溫敏核雄性不育系[22]；在谷子[23]、高粱[24]、油菜[25]等作物中也發(fā)現(xiàn)了光溫敏雄性不育系；茄子有反向熱敏感雄性不育系[26]。 分子研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA （Long non-coding RNAs，lncRNA）、 小RNA 和功能基因參與了環(huán)境敏感型育性調(diào)控[27]。

棉花環(huán)境敏感型核不育系的研究剛起步，還未在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用。 在我國(guó)的主要棉區(qū)，棉花在花期和花鈴期容易受到極端高溫天氣的影響，引起棉花花粉敗育，不能正常授粉，從而造成蕾鈴脫落[28]。 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)培育出棉花溫敏雄性不育系特棉S-1，在日平均溫度高于27 ℃時(shí)表現(xiàn)為不育[29]。 還有諸多棉花溫敏不育系已被發(fā)現(xiàn)，如TMS-2[30]、48043[31]、洞A[32]，此外還選育了對(duì)光溫敏感的雄性不育系如光溫A[33]和湘QB[34]。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所（簡(jiǎn)稱：中棉所）喻樹迅院士團(tuán)隊(duì)利用航天誘變育種技術(shù)，培育新型的棉花芽黃光敏雄性不育突變體中9106。 馬建輝等[35]研究發(fā)現(xiàn)，中9106 在光照時(shí)間為13～14.5 h 的長(zhǎng)日照條件下花粉敗育，能配制雜交組合，生產(chǎn)雜交種； 在光照時(shí)間為11～12.5 h 的短日照，且日平均溫度大于等于21.5 ℃的條件下可育，可在短日照高溫地區(qū)自交繁殖。 張朝軍通過(guò)棉花組織培養(yǎng)體系利用陸地棉W10 創(chuàng)制了棉花光敏雄性不育突變體psm4[36]，遮光試驗(yàn)表明其在日照時(shí)間大于12.5 h 條件下表現(xiàn)為花藥不開裂、花粉發(fā)育正常的雄性不育性狀；小于11.5 h 表現(xiàn)為花藥可以開裂、能正常散粉的雄性可育性狀，是典型的棉花孢子體光敏不育系。以psm4 為母本，W10 為父本，得到具有光敏不育特性，但是有正常的花粉壁、花粉活力正常的光敏不育系psm5。 本研究將結(jié)合親本的特性詳細(xì)介紹psm5的特性及其育性的轉(zhuǎn)變規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與地點(diǎn)

W10 和psm4[31]來(lái)源于中棉所轉(zhuǎn)基因創(chuàng)新小組。psm4是W10 無(wú)菌苗下胚軸組織培養(yǎng)獲得的突變體。 利用psm4與W10 雜交，在127 株F2后代中發(fā)現(xiàn)12 株生長(zhǎng)健壯的雄性不育植株。 將不育株的果枝嫁接到W10 砧木上， 移入安陽(yáng)工學(xué)院人工氣候室， 在光周期為11.5 h（光）/12.5 h（暗）、 晝夜溫度為35 ℃/20 ℃的條件下生長(zhǎng)結(jié)鈴。 同年將種子在海南三亞中棉所南繁基地?cái)U(kuò)繁。次年3 月底分單株收獲自交種。一部分種子在河南省安陽(yáng)縣中棉所試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)種植， 與正常棉花同樣種植管理，觀察育性。一部分種子繼續(xù)南繁種植，在后代植株中選出結(jié)鈴性好、花粉量接近W10的株系，命名為psm5。 在安陽(yáng)市中棉所試驗(yàn)田和安陽(yáng)工學(xué)院人工氣候室對(duì)psm5進(jìn)行系統(tǒng)研究。

1.2 育性穩(wěn)定性試驗(yàn)

2018―2019 年分別在安陽(yáng)大田進(jìn)行psm5、psm4育性穩(wěn)定性試驗(yàn)，以W10 為對(duì)照，每個(gè)處理1 行，行長(zhǎng)8 m，行距0.8 m，株距0.25 m，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，管理同大田正常管理模式。 7 月20 日至9 月10 日進(jìn)行自交，10 月5 日調(diào)查自交結(jié)鈴數(shù)。

1.3 花藥散粉觀察、花藥石蠟切片觀察及花粉活力檢測(cè)

在大田選取當(dāng)天盛開的花朵，用鑷子剝?nèi)セò?，暴露出花藥與柱頭，用體式顯微鏡Olympus BX51TF 進(jìn)行觀察并拍照。

在大田取W10 開花當(dāng)天待散粉但仍未散粉的花藥，取psm4、psm5開花當(dāng)天的花藥，用甲醛-乙酸-乙醇（FAA）固定液固定24 h，再用體積分?jǐn)?shù)分別為70%、85%、95%、100%的乙醇依次脫水，用二甲苯透明，然后經(jīng)滲蠟、包埋，最后進(jìn)行切片（厚度為8 μm），經(jīng)番紅-固綠染色，中性樹膠封片，制成永久切片。用Olympus BX51 顯微鏡觀察并拍照。

在大田取樣， 分別取W10、psm4及psm5植株開花當(dāng)天的花藥。 W10 植株的花藥此時(shí)已開裂，可以直接用鑷子夾取花藥將花粉抖落到載玻片上，吸取100 μL 亞歷山大染色劑，滴至載玻片上， 然后蓋上蓋玻片。 一般1～2 h 后即可用Olympus BX51 光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。 由于psm4和psm5植株開花當(dāng)天的花藥不開裂，需要用雙面刀片將花藥切開，以便花粉散出。 切開后，后續(xù)步驟同W10 植株的花藥處理。

1.4 花粉萌發(fā)試驗(yàn)

在大田選取W10 和psm5當(dāng)天開放的花蕾，利用固體培養(yǎng)基進(jìn)行花粉萌發(fā)試驗(yàn)，具體參考梁滿中等[37]的方法。

1.5 光溫響應(yīng)試驗(yàn)

將psm4、psm5和W10 種植在培養(yǎng)缽中，在中棉所露天生長(zhǎng)到開花期，各取5 株移入人工氣候室進(jìn)行觀察。 2 個(gè)人工氣候室光周期分別設(shè)為12.5 h（光）/11.5 h（暗）、11.5 h（光）/12.5 h（暗），每30 d 轉(zhuǎn)換1 次光周期， 光/暗處理溫度分別為35 ℃/20 ℃、25 ℃/15 ℃兩個(gè)處理，溫度誤差為±2 ℃。 記錄不同溫度下育性轉(zhuǎn)變所需時(shí)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 psm5 的育性穩(wěn)定性

大田取樣觀察發(fā)現(xiàn)：W10 花藥正常開裂，有大量花粉散出；psm5和psm4花藥不開裂， 無(wú)花粉散出（圖1）。可見(jiàn)，psm5保持了psm4在安陽(yáng)花藥不開裂的特性。2018―2019 年連續(xù)2 年在安陽(yáng)自交， 均未得到psm5的自交鈴， 說(shuō)明psm5與psm4一樣具有穩(wěn)定的雄性不育特性。

2.2 psm5 與psm4 花藥及花粉的區(qū)別

在開花當(dāng)天取花藥做石蠟切片，觀察成熟的花粉狀態(tài)及花藥裂口組織狀況。W10 花藥壁箭頭部位可見(jiàn)即將開裂的花藥裂口組織， 而psm5和psm4的裂口組織無(wú)開裂的跡象。psm5和W10 的花粉粒上可見(jiàn)正常的刺凸， 花粉發(fā)育正常；psm4的花粉粒上無(wú)刺凸，畸形花粉較多，其可能是由于花粉粒無(wú)包被保護(hù)，在固定液浸泡過(guò)程中內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)從裸露的萌發(fā)孔滲出導(dǎo)致的（圖2A～C）。染色結(jié)果表明， 與W10 花粉相比，psm4和psm5的花粉染色略淺，活力稍低，且psm4存在畸形的花粉粒（圖2D～F）。 由此可知，psm5的花藥具有花粉粒包被， 但同樣呈現(xiàn)出與psm4相同的花藥不開裂特性。

2.3 psm5 與W10 的離體花粉萌發(fā)活力分析

psm5與W10 的花粉萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果表明：psm5的花粉萌發(fā)率（34.48%）與W10 的花粉萌發(fā)率（45.79%）存在顯著差異；與W10 相比，psm5花粉活力較弱，但仍有一定的活力。

2.4 psm5 與psm4 育性轉(zhuǎn)變規(guī)律

從4 月28 日出苗至7 月上旬開花， 安陽(yáng)的光照時(shí)間為13.5～14.5 h。 將開花期的psm5、psm4植株移入晝夜溫度為35 ℃/20 ℃的人工氣候室， 在12.5 h/11.5 h 光周期條件下培養(yǎng)30 d。W10 的花藥正常開裂散粉，能自交結(jié)鈴；psm5和psm4的花藥不開裂，保持雄性不育性狀，自交不結(jié)鈴。 光周期轉(zhuǎn)變?yōu)?1.5 h/12.5 h 時(shí)，W10 的花藥仍正常開裂散粉；10 d 后，psm5和psm4個(gè)別單株花朵中少量花藥開裂、 散粉； 到15 d 時(shí)，psm4、psm5所有單株均表現(xiàn)為花藥開裂、正常散粉。 到第30 天將光周期重新調(diào)回12.5 h/11.5 h，12～16 d 后，2 個(gè)不育系植株花藥由開裂狀態(tài)重新轉(zhuǎn)化為不開裂狀態(tài)。 30 d 后重新調(diào)整回11.5 h/12.5 h，12 d 后psm5、psm4逐漸開裂散粉（表1）。W10 的花藥在轉(zhuǎn)換期間始終保持正常散粉狀態(tài)。psm4和psm5在花粉開裂散粉期間均能自交結(jié)鈴。

表1 不同溫度和光周期條件下psm4 與psm5 育性轉(zhuǎn)變規(guī)律Table 1 The fertility transition characiers of psm4 and psm5 under different temperature and photoperiod conditions

將開花期的psm5、psm4植株移入25 ℃/15 ℃條件下的人工氣候室， 在12.5 h/11.5 h 光周期條件下培育30 d，2 個(gè)材料花藥均不開裂，保持雄性不育性狀，與在35 ℃/20 ℃條件下的人工氣候室表現(xiàn)相同。當(dāng)光周期轉(zhuǎn)變?yōu)?1.5 h/12.5 h 的第15天，有的單株花藥開始開裂、散粉。 第22 天，所有單株均表現(xiàn)為花藥開裂、正常散粉。 第30 天，將光 周 期 重 新 調(diào) 回12.5 h/11.5 h，15 ～23 d 后，psm4、psm5的花藥重新轉(zhuǎn)化為不開裂、不散粉狀態(tài)。 30 d 后重新調(diào)整光周期為11.5 h/12.5 h，15 d后psm5、psm4逐漸恢復(fù)花藥開裂、 散粉狀態(tài)（表1）。W10 的花藥始終正常開裂并散粉。在花粉開裂散粉期間，psm4和psm5仍能自交結(jié)鈴。

3 討論

psm4與姊妹系W10 雜交， 獲得了psm5光敏不育系。psm5不育系花粉粒有發(fā)育正常的花粉包被， 說(shuō)明psm4光敏不育性狀與無(wú)花粉包被無(wú)關(guān)。 在不同溫度條件下進(jìn)行光周期轉(zhuǎn)換試驗(yàn)，說(shuō)明psm5、psm4光敏不育特性不受溫度影響。在低溫下育性轉(zhuǎn)換時(shí)間延長(zhǎng)，可能與低溫下蕾發(fā)育變慢有關(guān)。 在安陽(yáng)大田連續(xù)2 年種植psm4和psm5， 直到霜降后也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)花藥開裂的現(xiàn)象；在三亞大茅溫室中和氣溫達(dá)到40 ℃以上的夏季大田，psm5和psm4均保持雄性不育特性。 結(jié)合人工氣候室育性轉(zhuǎn)換試驗(yàn)， 可以認(rèn)定psm4和psm5的花藥不開裂性狀不受溫度影響， 僅受光周期誘導(dǎo)，是典型的光敏不育系。 同時(shí)，也首次證明了光周期對(duì)棉花花藥開裂有調(diào)控作用。

由于我國(guó)各主要植棉區(qū)棉花正常生長(zhǎng)階段日照時(shí)間均大于12 h，psm5在這些棉區(qū)均表現(xiàn)為雄性不育。 本研究中對(duì)于2 個(gè)光照時(shí)間節(jié)點(diǎn)（12.5 h 和11.5 h）的選擇，主要基于三亞光周期的限制。 因?yàn)?0 月份三亞光照時(shí)間從12 h 轉(zhuǎn)變?yōu)?1.5 h，此時(shí)棉花正值苗期；2 月中旬到3 月中旬棉花吐絮期， 光照時(shí)間從11.5 h 轉(zhuǎn)變?yōu)?2 h。3－10 月份，psm4、psm5在三亞田間均表現(xiàn)為雄性不育。 關(guān)于psm4與psm5在11.5～12.5 h 光照條件下的育性及其具體響應(yīng)周期還應(yīng)深入研究。加強(qiáng)對(duì)這2 種光敏不育材料的分子試驗(yàn)，探討光周期與花藥開裂之間的調(diào)控機(jī)制，為光敏雄性不育系的應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

psm5作為棉花光敏雄性核不育材料， 與之前報(bào)道的光敏不育材料中9106 在表型及光敏特性方面均有明顯的不同。 中9106 的雄性不育表型為花藥不開裂，花粉無(wú)活力[35]；而psm5花藥不開裂， 其花粉活力與野生型花粉相比較弱，但仍可萌發(fā)。 在光敏特性方面，中9106 在長(zhǎng)日照條件（13～14.5 h）下花粉敗育；在短日照（11～12.5 h），且日平均溫度大于等于21.5 ℃的條件下可育[35]。而psm5在日照時(shí)間大于12.5 h 時(shí)不育， 在日照時(shí)間小于11.5 h 時(shí)可育，且不受溫度影響。 因此，psm5作為兩系法制種材料具有更大的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

棉花光敏不育系psm4的育性是由花藥不能正常開裂引起的， 與花粉粒外包被發(fā)育缺陷無(wú)關(guān)。psm4棉花花藥不開裂性狀受光周期控制，與溫度無(wú)明顯關(guān)系。 在低溫下花藥開裂性狀轉(zhuǎn)變所需時(shí)間較長(zhǎng)，推斷是低溫下花蕾發(fā)育進(jìn)程變慢所致。從psm4和psm5育性轉(zhuǎn)變時(shí)間推斷其花藥在長(zhǎng)日照條件下不開裂的性狀，是在棉蕾發(fā)育中后期形成的，與蕾前期發(fā)育和花粉發(fā)育無(wú)關(guān)。 本研究證明psm4花粉粒包被缺失與花藥不開裂的光敏不育性狀是2 個(gè)獨(dú)立遺傳性狀。 利用雜交技術(shù)可以將2 個(gè)性狀分離，培養(yǎng)花粉粒正常的光敏不育系psm5。psm4和psm5是典型的孢子體光敏不育系材料。psm5的創(chuàng)制對(duì)揭示棉花光敏不育機(jī)理和育種應(yīng)用具有重要意義。