轉(zhuǎn)FBP7::iaaM 基因陸地棉育種應(yīng)用初報

程成，李斌，王雅麗，趙楠，蘇瑩，聶虎帥，華金平

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花遺傳育種與基因組研究實驗室／作物遺傳改良北京市重點實驗室／雜種優(yōu)勢利用教育部重點實驗室，北京 100193）

陸地棉（Gossypium hirsutumL.）是重要的經(jīng)濟作物[1]。棉花新品種選育過程中，產(chǎn)量潛力與纖維品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，同步改良難度大[1-2]。 棉花纖維是一種高度伸長的細(xì)胞，由胚珠表皮細(xì)胞發(fā)育而來[3]。 棉纖維的發(fā)育包括4 個不同但又相互重疊的時期：起始期、伸長期、次生壁細(xì)胞積累期和成熟期。 纖維的起始和伸長對纖維的數(shù)量、長度和細(xì)度有很大的影響，是決定皮棉產(chǎn)量和品質(zhì)的主要階段[4]。

植物激素在棉花纖維發(fā)育過程中起重要作用。 生長素具有多方面生理效應(yīng)，是胚珠體外培養(yǎng)所必需的植物激素[5]。 外源施用吲哚-3- 乙酸（Indole-3-acetic acid,IAA）可以促進(jìn)纖維的起始[6]，增加胚珠表皮纖維數(shù)量[7]。研究發(fā)現(xiàn)，來源于根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）以及假單孢菌（Pseudomonas savastanai）的iaaM基因[8]，編 碼色氨酸單加氧酶 （Tryptophan mono-oxygenase），參與由色氨酸產(chǎn)生IAA 的生物合成途徑[9]。iaaM基因在E6 啟動子的驅(qū)動下在陸地棉D(zhuǎn)P50 中高效表達(dá)，可顯著增加內(nèi)源IAA 含量，但對纖維品質(zhì)無明顯影響[10]。 將由矮牽牛種子表皮特異啟動子FBP7 啟動的植物生長素受體iaaM基因轉(zhuǎn)入棉花品種冀棉14 中育成的轉(zhuǎn)基因棉新種質(zhì)IF1-1， 棉花胚珠纖維起始期表皮細(xì)胞IAA 水平提高，種子短絨減少，皮棉產(chǎn)量和纖維細(xì)度顯著提高[1]。

關(guān)于棉花種質(zhì)IF1-1 育種應(yīng)用已有一系列報道。 以IF1-1 為父本，將iaaM基因轉(zhuǎn)育到9 個綜合性狀優(yōu)良的棉花品種中，證明該基因能顯著改良棉花F1和F2的衣分和馬克隆值，并且對籽指、鈴重、單株結(jié)鈴數(shù)等產(chǎn)量性狀和纖維長度、強度等品質(zhì)性狀無負(fù)效應(yīng)[11]。 以IF1-1 為父本，通過回交育種將iaaM基因?qū)氲鸵路帧?高馬克隆值的短季棉晉棉11，回交后代衣分提高，馬克隆值降低，早熟性好[12]。 以IF1-1 為父本配制6 個雜交組合， 發(fā)現(xiàn)iaaM基因可顯著提高纖維上半部平均長度、長度整齊度指數(shù)和斷裂比強度，降低籽指，且6 個組合的籽指與衣分、纖維上半部平均長度均呈負(fù)相關(guān)[13]。 以IF1-1 為供體將iaaM基因轉(zhuǎn)育到86 個衣分和纖維細(xì)度有待改良的棉花品系（種）中，可顯著改良馬克隆值，且對其他性狀無不利影響[14]。 以IF1-1 為父本與鄂贛棉29 等13份母本材料雜交，以贛棉雜1 號為對照，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)雜交組合的鈴重、籽指等表現(xiàn)為正向競爭優(yōu)勢，部分組合纖維品質(zhì)有顯著競爭優(yōu)勢[15]。 以IF1-1 與鄂抗棉10 號選、TM-1、冀棉14、優(yōu)質(zhì)-1等材料分別進(jìn)行正反交， 分析F1主要農(nóng)藝性狀，發(fā)現(xiàn)：多數(shù)組合鈴重增加，衣分提高，馬克隆值改良[16]。通過雜交將父本IF1-1 中的iaaM基因轉(zhuǎn)入母本N027、N028、N106、N030，結(jié)果發(fā)現(xiàn)iaaM基因與衣分弱正相關(guān)， 與纖維上半部平均長度、長度整齊度指數(shù)、斷裂比強度顯著正相關(guān)，與馬克隆值顯著負(fù)相關(guān)，與斷裂伸長率負(fù)相關(guān)[17]。 上述研究未對雜交后代進(jìn)行分子檢測， 影響結(jié)果的可靠性。

本研究以IF1-1 為父本， 與不同遺傳背景的棉花品種組配，結(jié)合分子檢測確定雜交種，通過對雜種F1的衣分、 籽指和纖維品質(zhì)性狀分析，研究IF1-1 在棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)改良中的作用，分析FBP7::iaaM基因是否對種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)FBP7::iaaM基因的陸地棉種質(zhì)系IF1-1[1]，由西南大學(xué)裴炎教授、侯磊教授研究團隊提供。

母本材料包括中棉所12 及其系譜涉及的材料共7 份[18]（包括中棉所12 及親本烏干達(dá)4 號、邢臺6871；親本系譜涉及的早代親本品種：魯棉研16、豫棉11、晉棉33、晉棉20，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所葉武威研究員團隊提供）；鄂抗棉9 號及其骨干親本共16 份材料[19]（包括中棉所2 號、陜棉7 號、陜棉3 號、鄂抗棉9 號、岱字棉15、徐州1818、鄂荊1 號、錦育3 號、中7263、MO-3、錦棉2 號、荊棉4 號、安通SP21、隆字棉、錦3-34-3、川57-681，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所楊代剛研究員、馬雄風(fēng)研究員團隊提供）。

1.2 IF1-1 陽性材料鑒定

2018 年冬在海南三亞種植IF1-1 材料，分單株提取植株葉片DNA，提取方法是改良的CTAB法[20]。 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction,PCR）檢測陽性植株，使用的引物見表1。使用2 對引物組合（IF_up/IF_dn1，IF_up/IF_dn2）擴增結(jié)果均為陽性，則認(rèn)為植株攜帶iaaM基因。

表1 IF1-1 的陽性植株分子鑒定引物序列Table 1 The primers used in FBP7::iaaM gene detection

1.3 配組F1 材料及鑒定

以陽性IF1-1 為父本，2018 年冬在海南與23份不同遺傳背景的棉花品種雜交。F1與親本材料于2019 年夏季在河北省河間市國欣總會試驗基地種植2 行區(qū)（行長5 m）。 取部分植株樣品進(jìn)行檢測。F1陽性植株鑒定使用的引物和基因檢測方法同1.2。

1.4 考種和纖維品質(zhì)檢測

F1陽性植株和23 份棉花品種各收20 個鈴，用于考種。 考種指標(biāo)為小樣衣分和籽指。 軋花考種后，取15 g 纖維樣品寄送中國彩棉（集團）股份有限公司測試中心（烏魯木齊）使用USTERRHVI 棉纖維測試系統(tǒng)完成纖維品質(zhì)檢測。 纖維品質(zhì)測定指標(biāo)包括纖維上半部平均長度、長度整齊度指數(shù)、斷裂比強度、斷裂伸長率和馬克隆值。

1.5 種子發(fā)芽試驗

F1與母本棉籽脫絨， 用于種子發(fā)芽試驗，試驗采用濾紙卷直立法[21]。選取50 粒發(fā)育正常的種子用蒸餾水浸種8 h，種子露白后，珠孔朝下均勻地擺放在濾紙上，用濾紙卷好，垂直放入大燒杯中，加入適量蒸餾水使濾紙保持濕潤，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。 3 d 后統(tǒng)計種子發(fā)芽勢（Germination potential，GP），7 d 后統(tǒng)計種子發(fā)芽率（Germination rate，GR）。 試驗設(shè)3 次重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用IBM SPSS Statistics 21.0 完成性狀數(shù)據(jù)的方差分析和相關(guān)性分析。 相關(guān)性的顯著性分析采用雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 IF1-1 和F1 陽性植株的分子鑒定

IF1-1 材料分單株提取葉片DNA， 使用表1的引物進(jìn)行PCR 檢測。 結(jié)果在檢測的23 個單株中，18 株為轉(zhuǎn)基因陽性株 （圖1）， 陽性株率為78.26%。

F1種子于2019 年在河北省河間市種植，每個材料取10 株 （單行不足10 株的取全部單株）掛牌、取樣、提取DNA，共鑒定222 株。23 個組合F1經(jīng)PCR 檢測得到69 株陽性株， 陽性株率為31.08%。其中，邢臺6871、陜棉7 號、鄂抗棉9 號、鄂荊1 號、 川57-681 的F1僅檢測到1 株陽性株（表2）。

表2 IF1-1 配組雜交F1 材料植株陽性檢測Table 2 Detection of positive individuals of F1 with FBP7::iaaM gene

2.2 F1 與母本衣分差異比較

IF1-1 攜帶的FBP7::iaaM基因轉(zhuǎn)入不同品系后，大部分F1衣分顯著提高。本研究檢測了23 份F1材料的衣分， 其中21 個雜交組合F1較對照母本提高1.73～11.82 百分點（表3），平均提高6.60百分點。 其中，魯棉研16 的F1衣分增幅最大。 例外的是， 晉棉20、 鄂抗棉9 號的衣分分別為44.91%、42.69%， 相應(yīng)的F1衣分分別降低為43.87%、42.25%（仍為高衣分材料）。

表3 雜種F1 與母本的衣分比較Table 3 Difference analysis on lint percentage of F1 hybrids and female parents %

中棉所12 及其系譜材料：中棉所12 衣分為41.58%，中棉所12 的F1提高了2.81 百分點。 衣分高于中棉所12 的系譜材料， 其F1衣分增幅均低于中棉所12 的F1； 衣分低于中棉所12 的，其F1衣分增幅反而高于中棉所12 的F1。

鄂抗棉9 號及其骨干親本：鄂抗棉9 號衣分為42.69%， 其F1衣分為42.25%（降低了0.44 百分點）；鄂荊1 號衣分為44.30%，其F1衣分提高7.37 百分點，為51.67%。 一些衣分低的材料其F1衣分顯著提高。

2.3 雜種F1 與母本籽指、發(fā)芽勢、發(fā)芽率的差異

相對于各母本，22 個F1的籽指降低0.2～5.3 g，平均降低1.8 g；岱字棉15/IF1-1 的F1籽指降幅最大；僅晉棉20/IF1-1 的F1籽指比母本提高0.9 g（表4）。

中棉所12 籽指11.6 g， 對應(yīng)的F1籽指降低了0.8 g。 親本烏干達(dá)4 號和邢臺6871 的籽指分別為14.6 g、11.6 g， 相應(yīng)的F1籽指分別為11.2 g、9.6 g，其F1籽指降幅均高于中棉所12 的F1。

鄂抗棉9 號籽指為10.7 g，相應(yīng)F1的籽指為9.9 g，降低0.8 g；骨干親本中7263、陜棉7 號、錦棉2 號、鄂荊1 號籽指分別為14.2 g、13.7 g、13.0 g、12.7 g， 相應(yīng)的F1籽指分別為13.2 g、10.4 g、10.6 g、9.5 g， 較各自母本分別降低1.0 g、3.3 g、2.4 g、3.2 g（表4）。

20 份F1材料種子發(fā)芽試驗結(jié)果表明， 有10份材料F1的發(fā)芽勢高于或等于其母本發(fā)芽勢。方差分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1的發(fā)芽率和發(fā)芽勢與相應(yīng)母本的發(fā)芽率和發(fā)芽勢差異均不顯著（表4）。

表4 F1 與母本籽指、發(fā)芽勢與發(fā)芽率比較分析Table 4 Difference between F1 and female parent in seed index, seed germination potential and seed germination rate

2.4 材料的纖維品質(zhì)表現(xiàn)

IF1-1 對纖維品質(zhì)性狀尤其是馬克隆值的影響值得關(guān)注。 其中，鄂荊1 號的F1的纖維品質(zhì)數(shù)據(jù)缺失。 其余22 份F1的纖維品質(zhì)檢測結(jié)果（表5）表明，馬克隆值處于A 檔的F1材料相應(yīng)母本為邢臺6871、中棉所12、魯棉研16、豫棉11、晉棉20、鄂抗棉9 號、MO-3、錦棉2 號、荊棉4 號這9 份；處于C 檔的材料母本為陜棉7 號、岱字棉15、安通SP21、錦3-34-3、川57-681；其余8 份材料均為B 檔。 相應(yīng)地，22 份母本材料馬克隆值處于A 檔的有：陜棉7 號、鄂抗棉9 號、錦育3 號、安通SP21、錦3-34-3、川57-681；處于C 檔的材料有：豫棉11、陜棉3 號、岱字棉15、中7263、隆字棉；其余11 份材料均為B 檔。 因此，11 份材料馬克隆值等級得到提升。 中棉所12 及其系譜材料的F1馬克隆值等級提升的有：邢臺6871、中棉所12、魯棉研16、豫棉11、晉棉20；鄂抗棉9 號及其骨干親本的F1馬克隆值等級提升的有：陜棉3 號、中7263、MO-3、錦棉2 號、荊棉4 號、隆字棉。 5 份材料F1的馬克隆值等級下降，其余6 份材料F1的馬克隆值等級不變（表5）。

22 份母本材料的纖維上半部平均長度范圍為26.05～31.82 mm，平均為29.07 mm，其中陜棉7 號最長，錦棉2 號最短；相應(yīng)的F1纖維上半部平均長度范圍為27.40～32.25 mm， 平均為30.40 mm，其中魯棉研16 的F1最長，安通SP21的F1最短。 與母本相比，有17 個F1纖維上半部平均長度增加，平均增加2.0 mm。中棉所12 纖維上半部平均長度為29.44 mm， 對應(yīng)的F1增加2.50 mm，是中棉所12 系譜材料中增幅最高的。鄂抗棉9 號纖維上半部平均長度為29.16 mm，對應(yīng)的F1增加了1.87 mm；纖維上半部平均長度大于鄂抗棉9 號的骨干親本，其F1纖維上半部平均長度增幅均小于鄂抗棉9 號F1的增幅（表5）。

表5 F1 與母本材料纖維品質(zhì)性狀表現(xiàn)Table 5 The comparison on fiber quality traits between F1 and its female parents

22 份母本材料的長度整齊度指數(shù)為82.10%～87.65%，平均為84.57%，其中中棉所12 長度整齊度指數(shù)最高，錦育3 號的最低。22 個F1的長度整齊度指數(shù)為80.80%～88.75%，平均為85.21%，中7263 的F1最高， 陜棉3 號的F1最低；13 份材料F1的長度整齊度指數(shù)較母本提高， 平均提高1.93 百分點（表5）。

22 份母本材料的斷裂比強度為24.52～35.38 cN·tex－1，平均為28.74 cN·tex－1，其中陜棉7 號最高，陜棉3 號最低。 22 個F1的斷裂比強度為27.13～33.21 cN·tex－1， 平均為30.24 cN·tex－1，其中中7263 相應(yīng)的F1最高， 豫棉11 相應(yīng)的F1最低。 14 份材料的斷裂比強度提高（平均提高3.79 cN·tex－1）。 中 棉 所12 的 斷 裂 比 強 度 為28.01 cN·tex－1， 對應(yīng)的F1增加至31.46 cN·tex－1；鄂抗棉9 號纖維斷裂比強度為27.34 cN·tex－1，對應(yīng)的F1增加了5.34 cN·tex－1；斷裂比強度高于鄂抗棉9 號的骨干親本的F1斷裂比強度增幅均小于鄂抗棉9 號的F1（表5）。

22 份母本材料的纖維斷裂伸長率為4.91%～8.21%，平均為5.98%，其中荊棉4 號的斷裂伸長率為8.21%，隆字棉的為4.91%。 22 個F1的斷裂′伸長率為5.61%～8.22%，平均為6.79%，其中晉棉33 的F1斷裂伸長率為8.22%， 錦棉2 號的F1斷裂伸長率為5.61%；18 個F1的斷裂伸長率增加，平均增加1.14 百分點（表5）。

對F1和母本的纖維品質(zhì)進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)：與相應(yīng)母本比較，F(xiàn)1的纖維上半部平均長度和斷裂伸長率差異極顯著， 斷裂比強度差異顯著，長度整齊度指數(shù)和馬克隆值差異不顯著。

2.5 F1 和母本的衣分與籽指相關(guān)性分析

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1的衣分和母本的衣分的相關(guān)系數(shù)為0.569，達(dá)到極顯著水平；F1的籽指和母本的籽指的相關(guān)系數(shù)為0.481， 顯著正相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

本研究通過PCR 分子檢測證明，F(xiàn)BP7::iaaM基因可在IF1-1 自交后代及雜種F1中穩(wěn)定遺傳，能夠提高衣分。FBP7::iaaM基因轉(zhuǎn)入冀棉14 后，受體衣分從40.6%提高至48.0%以上、 馬克隆值從5.2 降低至4.5[1]。 肖欽之[16]研究發(fā)現(xiàn)FBP7::iaaM基因可以提高低衣分品種的衣分。 本研究以FBP7::iaaM轉(zhuǎn)基因材料IF1-1 為供體親本， 與不同遺傳背景的棉花品種進(jìn)行雜交， 其中21 個雜交組合的衣分不同程度地提高， 但是FBP7::iaaM基因在不同遺傳背景的棉花材料中的表現(xiàn)存在差異，這與已有報道結(jié)果[1,11-13]吻合。 中棉所12 的系譜材料中，衣分比中棉所12 高的材料，其F1增幅均低于中棉所12 的F1。 鄂抗棉9 號及其骨干親本的大多數(shù)材料也有類似趨勢。 晉棉20和鄂抗棉9 號衣分分別為44.91%和42.69%，轉(zhuǎn)入FBP7::iaaM基因后，其F1衣分反而略有降低；鄂荊1 號衣分為44.30%，其F1衣分明顯提高，說明利用FBP7::iaaM基因提高衣分還是需要對受體材料進(jìn)行選擇。 此外，母本材料和相應(yīng)的F1纖維品質(zhì)分析結(jié)果表明，部分材料F1的纖維品質(zhì)指標(biāo)不同程度地提高。 這說明結(jié)合有效的育種選擇， 利用FBP7::iaaM基因提高衣分同步改良品質(zhì)是可能的[11,16]。

衣分和籽指可能存在負(fù)相關(guān)，F(xiàn)BP7::iaaM基因會使棉花種子質(zhì)量變小，籽指下降。季靈艷[22]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)iaaM基因材料IF1-1 的種仁棉酚含量顯著低于對照材料。 陳旭升等[23]研究表明，轉(zhuǎn)iaaM種質(zhì)的籽指偏小，種子空癟率上升。 本研究發(fā)現(xiàn)，23 份F1材料中僅晉棉20 的F1籽指較母本有所提高， 原因是晉棉20 籽指較低僅為9.73 g。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1籽指與母本籽指呈顯著正相關(guān)；因此，在利用FBP7::iaaM基因時應(yīng)選擇籽指較高的材料作為母本。

發(fā)芽試驗結(jié)果顯示，F(xiàn)1的發(fā)芽率和發(fā)芽勢與母本的無顯著差異，說明一定范圍內(nèi)籽指降低不影響種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢。FBP7::iaaM基因的轉(zhuǎn)入是否會影響棉鈴種子數(shù)和不孕籽率有待于后續(xù)試驗驗證。

綜上所述，轉(zhuǎn)FBP7::iaaM基因的IF1-1 種質(zhì)系可提高部分雜種后代的纖維品質(zhì)和產(chǎn)量性狀，在同步改良棉花纖維品質(zhì)和產(chǎn)量方面有重要的利用價值。