花粉塊內(nèi)花粉粒形態(tài)觀察的掃描電鏡樣品制備方法

陸 敏 李西林 陸 雄*

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心，上海 201203；2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203）

花粉是攜帶遺傳信息的雄性生殖細(xì)胞，具有很強(qiáng)的遺傳保守性和穩(wěn)定性，許多細(xì)微的形態(tài)特征能明顯體現(xiàn)出種間的差異和生存信息，在遺傳學(xué)和分類學(xué)中具有重要的科學(xué)價(jià)值［1］。掃描電鏡由于分辨率高，立體感強(qiáng)，圖像直觀，已被廣泛運(yùn)用于植物孢粉學(xué)形態(tài)的研究。

植物花粉可分為：①單?；ǚ?；②2 個以上的花粉粒集合在一起形成的復(fù)合花粉，包括2 合、4合、16 合、32 合花粉等，其中以4 合花粉最常見，以及許多花粉粒集合在一起形成的花粉塊，如蘭科和蘿藤科植物［2］。由于花粉塊表面具有粘膠物質(zhì)，被包裹在內(nèi)的帶有粘性的花粉粒緊密粘合在一起，不易分散，難以被直接觀察［3］。因此在掃描電鏡下花粉塊的形態(tài)以及花粉塊表面的花粉粒形態(tài)的研究報(bào)道較多，而對花粉塊內(nèi)部的花粉粒的形態(tài)鮮見報(bào)道［4～8］。解決花粉塊內(nèi)花粉粒的掃描電鏡觀察樣品制備方法這一技術(shù)難題，將大大促進(jìn)植物花粉形態(tài)的研究，進(jìn)一步為植物的分類和鑒定等研究提供科學(xué)依據(jù)。本研究在常規(guī)掃描電鏡樣品制備的基礎(chǔ)上，采用導(dǎo)電雙面膠拉斷暴露出花粉粒的方法，成功觀察到了花粉塊內(nèi)的花粉粒的形態(tài)，取得了令人滿意的結(jié)果。

1 材料和方法

1.1 材料

蘭科（Orchidaceae）石斛組（Sect. Dendrobium）翅萼石斛（Dendrobium cariniferumRchb.f.）來自于上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院李西林教授提供，并經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所徐紅研究員鑒定。

1.2 方法

1.2.1 花粉粒的制備

從自然盛開的新鮮花朵上采集花粉塊，立即投入2.5%的戊二醛固定液（pH7.2），4℃，固定2 h以上；用0.1 mol·L-1PBS（pH7.2）洗3 次，每次10 min；1%餓酸后固定3 h；再用PBS 洗3 次，每次10 min；用30%、50%、70%、90%和100%酒精進(jìn)行梯度脫水后，放入Leica EM CPD300全自動臨界點(diǎn)干燥儀中干燥。干燥后的樣品用導(dǎo)電雙面膠固定在樣品托上，在真空下（1×10-6kPa）干燥0.5 h，以增加樣品與導(dǎo)電膠的粘合度。用鑷子輕輕夾住樣品，向上拉，拉斷的組織一部分粘在導(dǎo)電膠上，另一部分在解剖鏡下使斷裂面向上，粘貼在導(dǎo)電膠上。樣品粘貼好后，在Leica EM ACE600離子濺射鍍膜儀中噴金，鍍膜厚度為22 nm，使用Quanta 250 FEG場發(fā)射掃描電鏡對樣品進(jìn)行觀察并拍照，加速電壓為10 kV。

1.2.2 花粉塊的制備

從自然盛開的新鮮花朵上采集花粉塊，在解剖鏡下將花粉塊不同的面粘貼在導(dǎo)電膠上，立即在離子濺射鍍膜儀中鍍膜后在掃描電鏡下對樣品進(jìn)行觀察和拍照。

1.2.3 花粉塊的大小測量

在100 倍的放大倍率下測量4 個花粉小塊的極軸（P）和赤道軸（E）的長度。

1.2.4 花粉粒的大小測量

在1 000 倍的放大倍率下選取20 粒花粉粒進(jìn)行極軸和赤道軸長度的測量，P/E 表示花粉粒形狀：P/E 在2～1.14 為長球形；P/E＜1.14 為近球形；P/E＜0.88為扁球形；P/E＜0.5為超扁球形［9～10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 翅萼石斛花粉塊形態(tài)

翅萼石斛花粉塊由4 個花粉小塊組成，離生，每2個一對，沿縱軸左右對稱。正面觀和背面觀均呈有弧度的香蕉形（見圖1：A～B），側(cè)面觀，一端膨大圓鈍，一端尖銳，酷似太極圖中的陰陽魚形狀（見圖1：C）。花粉小塊極軸長約為2 mm，中間的花粉小塊略長于兩邊的花粉小塊。正面觀中間的花粉小塊赤道軸長約為600 μm，兩邊的花粉小塊赤道軸長約為400 μm，反面觀則相反。放大后觀察到翅萼石斛花粉小塊表面的花粉粒排列緊密，表面平整，Ⅰ級紋飾呈不規(guī)則的多邊形，Ⅱ級紋飾為皺痕和類似于毛孔一樣的小細(xì)孔，推斷花粉塊表面覆蓋有粘膠樣物質(zhì)，相鄰花粉粒間的接縫處也可見到明顯的粘膠物質(zhì)（見圖1：D）。

2.2 翅萼石斛花粉粒形態(tài)

翅萼石斛花粉小塊的斷裂面上可見密密麻麻的花粉粒（見圖2：A～B），放大后顯示這些花粉粒是由4個單粒花粉形成的四合體結(jié)構(gòu)，四合體間結(jié)合緊密，不易分開，表面具有較淺的腦紋狀雕紋，未見萌發(fā)孔。四合花粉近似于左右對稱，極面觀赤道軸長分別約為25 和20 μm，赤道面觀極軸長約為10 μm，形態(tài)為超扁球形（見圖2：C～D）。

3 討論

目前花粉塊內(nèi)花粉粒的觀察通常使用化學(xué)試劑醋酸酐或檸檬酸將花粉塊上的花粉粒分解下來，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察［11～12］。此方法由于放大倍數(shù)的局限，僅可對花粉粒的形態(tài)的進(jìn)行初步觀察。趙昕梅等報(bào)道采用化學(xué)試劑分解花粉粒后，再按照掃描電鏡的樣品制備要求進(jìn)行脫水、干燥等處理，由于花粉粒體積過小在制備過程中遺失，并未觀察到花粉粒［13］，表明此方法并不適合掃描電鏡下花粉塊中花粉粒的觀察。孫崇波等人報(bào)道通過鐵骨素蘭花花粉塊中散落出來的花粉粒，觀察到了類似四分體的結(jié)構(gòu)［14］，但這種觀察是由于操作中的偶然性出現(xiàn)的，并沒有形成系統(tǒng)的方法。

對于組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察，掃描電鏡通常的制備方法有：①內(nèi)部結(jié)構(gòu)剖出法，包括刀片切斷法、鑷子掰開法、雙面膠帶拉斷法、環(huán)氧樹脂割斷法以及冷凍割斷法；②管道鑄型法；③離子蝕刻法［15］。植物花粉掃描電鏡樣品制備方法的報(bào)道多集中于單?；ǚ?，既有花粉粒表面形態(tài)觀察的制樣方法［16～17］，也有花粉粒內(nèi)層結(jié)構(gòu)觀察的制樣法，例如花粉粒冷凍斷裂法、花粉粒冰凍蝕刻法、花粉粒樹脂斷裂法等［18～19］，但目前尚無針對花粉塊內(nèi)花粉粒制備方法的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以石斛屬植物中花粉塊體積相對較大的翅萼石斛為材料，采用導(dǎo)電雙面膠帶拉斷花粉塊的方法，暴露出花粉塊中的花粉粒，在掃描電鏡下清晰觀察到了翅萼石斛花粉粒的立體形態(tài)與其上的紋飾，并在掃描電鏡下首次證實(shí)了翅萼石斛的花粉塊是由單?！暮象w→花粉小塊→花粉塊的形式組成的。此方法簡單易行，操作方便，不需要額外的試劑和儀器，再進(jìn)行一定的優(yōu)化后，可作為掃描電鏡下觀察花粉塊中花粉粒形態(tài)的一種通用方法，將有助于對蘭科、蘿藤科植物的花粉形態(tài)進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。