無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗中百日咳毒素活性測(cè)定分析

譚亞軍，衛(wèi)辰，董國(guó)霞，李喆，王麗嬋，馬霄

·綜述·

無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗中百日咳毒素活性測(cè)定分析

譚亞軍，衛(wèi)辰，董國(guó)霞，李喆，王麗嬋，馬霄

102629 北京，中國(guó)食品藥品檢定研究院百白破疫苗和毒素室/衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

百日咳毒素（pertussis toxin，PTx）是鮑特氏菌屬百日咳桿菌產(chǎn)生的一種主要毒力因子，具有多種生物學(xué)活性，如淋巴細(xì)胞增多促進(jìn)活性、組胺致敏活性、中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）簇集作用、胰島激活作用、T 細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)作用、紅細(xì)胞凝集活性等[1-4]，是引起百日咳眾多臨床癥狀的原因，同時(shí)也是無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine，APV）的主要保護(hù)性抗原組分[5]。

PTx 為 A-B 型毒素，由一具有酶活性的 A 亞基與 B 寡聚體組成。A 亞基為單一的 S1 亞單位，具有二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，）-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide hydrate，NAD+）存在時(shí)，可催化抑制性鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白（guanine nucleotide binding protein-inhabitant，Gi）α 亞基上半胱氨酸的 ADP 核糖化，阻止 Gi α 亞基與（guanosinetriphosphate，GTP）結(jié)合，使 Gi 不能活化，從而失去對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的抑制作用，喪失調(diào)節(jié)效能，引起靶細(xì)胞中cAMP 濃度增加，A 亞基是引起 PTx 毒性作用的部分。B 寡聚體是由 S2、S3、S4、S5 以 1:1:2:1 組成的五聚體，其功能是結(jié)合于真核細(xì)胞表面受體，促使毒性亞單位 S1 穿過(guò)細(xì)胞膜達(dá)到靶位，導(dǎo)致生物學(xué)活性作用。另外，PTx 的T 細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)作用和紅細(xì)胞凝集活性也是由 B 寡聚體引起[6-8]。

PTx 因毒性太強(qiáng)，需采用化學(xué)脫毒，如甲醛脫毒、戊二醛脫毒、過(guò)氧化氫脫毒，或采用基因突變進(jìn)行脫毒處理制成類毒素，既嚴(yán)格保證失去毒性，又保留免疫原性，方可作為疫苗使用[9-14]。PTx 的殘留毒性被認(rèn)為是 APV 接種不良反應(yīng)的一個(gè)主要原因，因此對(duì)殘留的 PTx 毒性和在儲(chǔ)存過(guò)程中可能發(fā)生的毒性逆轉(zhuǎn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)是疫苗安全性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，并要求將其毒性控制在一個(gè)較低水平。目前根據(jù) PTx 的生物學(xué)活性建立了很多特異性檢測(cè)方法，包括體內(nèi)法和體外法兩類。體內(nèi)法主要包括組胺致敏（histamine sensitizing toxicity，HIST）試驗(yàn)和白細(xì)胞增多（leukocyte promoting toxicity，LP）試驗(yàn)；體外法主要包括 CHO 簇集試驗(yàn)、ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性檢測(cè)、碳水化合物結(jié)合試驗(yàn)以及其他基于細(xì)胞的分析方法。

1 HIST 試驗(yàn)

日本于 1981 年首次生產(chǎn)和使用 APV[15]，目前加拿大、歐洲和中國(guó)也生產(chǎn)APV，同時(shí)向世界其他地區(qū)逐步推廣。對(duì)APV 的質(zhì)量控制，小鼠體內(nèi) HIST 試驗(yàn)長(zhǎng)期以來(lái)是檢測(cè)百日咳疫苗中 PTx 殘留毒性的唯一手段。它最初用于檢測(cè)全細(xì)胞百日咳疫苗（whole cell pertussis vaccine，WPV）中的 PTx 活性，隨后在日本、美國(guó)和歐洲用于 APV 產(chǎn)品檢測(cè)。其原理是 PTx 可以增加小鼠對(duì)組胺的敏感性[16-20]。

目前 HIST 試驗(yàn)包括兩種模型。一種是以小鼠死亡作為判定終點(diǎn)。小鼠按設(shè)定數(shù)量分組，一組接種儲(chǔ)存在 2 ～8 ℃一人份劑量疫苗以檢查殘留毒性，一組接種 37 ℃孵育 4 周的疫苗以檢測(cè)毒性逆轉(zhuǎn)。該試驗(yàn)還包括陽(yáng)性對(duì)照組，接種可引起一定數(shù)量小鼠死亡的 PTx，以確保試驗(yàn)小鼠對(duì)組胺刺激的敏感性。另外可設(shè)立具有確定臨床安全性的參比疫苗作為對(duì)照。4 ～ 5 d 后，小鼠用組胺攻擊，監(jiān)測(cè) 24 h，記錄各組死亡數(shù)目。各國(guó)藥典規(guī)定的試驗(yàn)有效性標(biāo)準(zhǔn)和疫苗合格標(biāo)準(zhǔn)有一定區(qū)別（表 1）[21-22]?？傮w上陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠死亡數(shù)目應(yīng)能證明小鼠對(duì)組胺攻擊的敏感性，疫苗組的PTx 殘留毒性應(yīng)相當(dāng)于或低于可接受水平或參比疫苗水平。

HIST 試驗(yàn)的另一種模型是以測(cè)量小鼠體溫作為終點(diǎn)。該方法由日本、中國(guó)等亞洲國(guó)家對(duì)致死 HIST 檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)，并成功地用于檢測(cè) APV。它是基于 PTx 接種小鼠后經(jīng)組胺攻擊可引起體溫降低而建立的。試驗(yàn)是將毒性參考品以適宜倍數(shù)系列稀釋成 3 ～ 4 個(gè)稀釋度，待檢疫苗成品不作稀釋或原液樣品稀釋至成品相同濃度注射小鼠，于第 5 天用組胺對(duì)各組免疫注射后的小鼠進(jìn)行腹腔攻擊，30 min 后測(cè)量小鼠體溫作為終點(diǎn)[23]，可以通過(guò)測(cè)量直腸或皮膚溫度進(jìn)行檢測(cè)。該方法根據(jù)毒性參考品的組胺致敏單位（histamine sensitization units，HSU）來(lái)定量檢測(cè)疫苗的 PTx 殘留毒性?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)也因地區(qū)而異，日本為 0.4 HSU/ml，中國(guó)為 0.8 HSU/ml[21, 24]。

表1 WHO 和各國(guó)藥典對(duì) HIST 的試驗(yàn)要求

兩種 HIST 檢測(cè)方法都可用于測(cè)量樣品中 PTx 殘留毒性水平[25-26]，小鼠死亡率和體溫變化都具有劑量反應(yīng)關(guān)系，但作用方式可能不相同[21]。HIST 試驗(yàn)有許多優(yōu)點(diǎn)。首先 HIST 可反映 PTx 在體內(nèi)與細(xì)胞膜結(jié)合、細(xì)胞易位和酶活性的所有活動(dòng)，具有特異性[27-28]；其次，它對(duì)檢測(cè) PTx 活性非常敏感；第三，其他疫苗成分如鋁佐劑，對(duì)檢測(cè)沒(méi)有干擾。HIST 試驗(yàn)也存在一些缺點(diǎn)，首先對(duì)這兩種模式的機(jī)制了解甚少，并且這兩種方法的作用方式可能沒(méi)有聯(lián)系[16]；其次，動(dòng)物法檢測(cè)變異系數(shù)較大，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間的變異性。表 1 列舉了全球使用 HIST 檢測(cè)的各種形式，具有區(qū)域性特點(diǎn)，其中小鼠規(guī)格（品系、性別、年齡等）、陽(yáng)性和（或）陰性對(duì)照組的納入、試驗(yàn)組的規(guī)模、接種疫苗和攻毒之間的時(shí)間間隔、攻毒和檢測(cè)結(jié)果讀取之間的時(shí)間間隔和組胺攻毒劑量等存在差異，難以標(biāo)準(zhǔn)化。此外，動(dòng)物使用量較大，據(jù)估計(jì)全球每年約有 65 000 只小鼠被用于 HIST 試驗(yàn)[21]。因此需要研究更易標(biāo)準(zhǔn)化、更具可比性的新方法用于 APV 中 PTx 殘留毒性檢測(cè)。歐洲藥典第 10 版已規(guī)定使用標(biāo)準(zhǔn)化的CHO細(xì)胞簇集試驗(yàn)方法替換現(xiàn)有的小鼠組胺致敏試驗(yàn)[22]。

2 LP 試驗(yàn)

LP 試驗(yàn)和 HIST 試驗(yàn)是由日本科學(xué)家在提純 PTx 和絲狀血凝素，并對(duì) PTx 進(jìn)行生物學(xué)特性研究時(shí)介紹的兩種動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)法[29-30]，之后由日本國(guó)立預(yù)防衛(wèi)生研究所改進(jìn)并建立為 APV 毒性檢測(cè)方法，納入日本生物制品規(guī)程。我國(guó)藥典也明確規(guī)定該兩項(xiàng)試驗(yàn)為 APV 原液和成品的特異性毒性檢查項(xiàng)目[31]。

我國(guó)藥典規(guī)定 LP 試驗(yàn)是將毒性參考品以適宜倍數(shù)系列稀釋成 3 ～ 4 個(gè)稀釋度，待檢疫苗成品不作稀釋或原液樣品稀釋至成品相同濃度。動(dòng)物選用體重為 14 ～ 16 g NIH（或 RIVM 等）品系雌性或雌雄各半健康小鼠，參考品的各個(gè)稀釋度和待檢品每組 10 只，每只小鼠腹腔注射 0.5 ml。3 d 后取小鼠外周血 20 μl，測(cè)量前在每份血樣內(nèi)加入 2 ～ 3 滴溶血?jiǎng)?，進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。LP 活性是通過(guò) PTx 劑量和白細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)曲線計(jì)算得出，以白細(xì)胞增多 10 000/mm3的 PTx 劑量定為 1 個(gè) LP 單位[32]。

該方法可用于檢測(cè)百日咳疫苗的 PTx 活性，一項(xiàng)多實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，LP 試驗(yàn)在識(shí)別三種高毒性 WPV 產(chǎn)物方面優(yōu)于 HIST 和 CHO 細(xì)胞簇集試驗(yàn)[33]。但這種方法與 HIST 試驗(yàn)一樣也存在幾個(gè)缺點(diǎn)，PTx 引起白細(xì)胞增加的確切機(jī)制尚不清楚；方法存在許多可變參數(shù)，如給藥途徑（皮下、腹腔或靜脈注射）、注射后的采血時(shí)間（通常為 3 ～ 6 d）和每組小鼠的數(shù)量，由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，實(shí)驗(yàn)室間存在較大的差異[33-34]。

3 CHO 細(xì)胞簇集試驗(yàn)

PTx 具有引起 CHO 細(xì)胞簇集生長(zhǎng)的特性，Gillenius 等[35]據(jù)此建立了體外檢測(cè) PTx 活性的 CHO 細(xì)胞檢測(cè)法。該方法是將 PTx 參考品和待檢樣品進(jìn)行適當(dāng)預(yù)稀釋，在 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的 2 ～ 12 列中每孔加入 25 μl RPMI 培養(yǎng)基，每行 1、2 列加入?yún)⒖计坊虼龣z品 25 μl/孔，從第2 列開(kāi)始進(jìn)行 2 倍系列稀釋。將培養(yǎng) 3 d 的 CHO 細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，稀釋至2 × 104個(gè)/ml，以每孔 200 μl 加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 d 后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，分別記錄參考品和待檢品引起細(xì)胞聚集的最高稀釋度，計(jì)算結(jié)果。該方法可用于監(jiān)測(cè)上游疫苗組分（如 PTx 和脫毒后無(wú)佐劑樣品）的 PTx 活性。還可用于中和抗體測(cè)定，將待測(cè)的抗-PTx 血清系列稀釋，與 PTx 等量混合 37 ℃結(jié)合 30 min 后，加入 CHO 細(xì)胞，放置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育 2 d，同樣用顯微鏡觀察細(xì)胞簇集反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

CHO 細(xì)胞簇集試驗(yàn)采用的細(xì)胞是從特定來(lái)源獲得的 CHO-K1 細(xì)胞，該方法易于標(biāo)準(zhǔn)化，具有良好的實(shí)驗(yàn)室間重現(xiàn)性和可轉(zhuǎn)移性[36]。但它不適合測(cè)試最終疫苗成品中的PTx 殘留毒性，因?yàn)橐呙绲哪承┏煞秩玟X佐劑，被證明對(duì) CHO 細(xì)胞具有細(xì)胞毒性[26, 37]。最近已開(kāi)發(fā)出兩種改良的試驗(yàn)方法，試圖通過(guò)克服這些細(xì)胞毒性反應(yīng)以用于疫苗成品測(cè)定，包括直接法和間接法。直接法是對(duì)疫苗制劑進(jìn)行足夠的稀釋以抵消疫苗成分的毒性影響，稀釋樣品可直接添加到細(xì)胞。間接法是將疫苗離心，棄去上清，沉淀用培養(yǎng)基重懸，重懸物加入帶有半透膜的微孔板中，這個(gè)半透膜在 CHO 細(xì)胞上方，防止細(xì)胞與疫苗佐劑接觸[36]。這兩種改良方法在檢測(cè)疫苗成品時(shí)常采用內(nèi)標(biāo)法，通過(guò)加入已知濃度的 PTx 來(lái)測(cè)定。

CHO 細(xì)胞簇集試驗(yàn)方法的主要優(yōu)勢(shì)是它捕獲了 PTx 的細(xì)胞結(jié)合、易位和酶活性，與 HIST 功能相當(dāng)，并且檢測(cè)靈敏度高。但也存在一些缺點(diǎn)，首先觀察細(xì)胞的聚類形態(tài)和讀取滴度具有主觀性，另外半透膜間接法不能檢測(cè)樣品上清中的殘余 PTx 活性，需采用其他體外檢測(cè)方法來(lái)監(jiān)測(cè)[37-39]。此外，也有報(bào)道存在采用 HIST 檢測(cè)出 APV 的部分毒性或毒性逆轉(zhuǎn)，而 CHO 細(xì)胞簇集試驗(yàn)未能檢測(cè)到毒性的情況[40]。在 WHO 的 PTx 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定試驗(yàn)中也出現(xiàn)CHO 細(xì)胞簇集試驗(yàn)與 HIST 測(cè)定的活性不完全對(duì)應(yīng)的情況。說(shuō)明 HIST 和 CHO 測(cè)定法之間由于測(cè)試系統(tǒng)不同而造成的差異是存在的。

4 生物化學(xué)方法

Cyr 等[41]于 2001 年首先開(kāi)發(fā)了一種測(cè)定 PTx A 亞基ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的方法。該實(shí)驗(yàn)是通過(guò)設(shè)計(jì)合成與 Gi3 蛋白 α 亞基的 C 末端 20 個(gè)氨基酸的序列相似的熒光標(biāo)記肽，作為 PTx 核糖基化的底物。在 NAD 存在的情況下，PTx 催化 ADP 核糖從 NAD 轉(zhuǎn)移到底物的半胱氨酸上，使用反相高效液相色譜和熒光檢測(cè)器將 ADP 核糖基化產(chǎn)物從底物中分離和檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，PTx 在 0.0625 ～ 4.0 μg/ml 范圍內(nèi)呈線性濃度-反應(yīng)關(guān)系。具體方法是將 PTx 參考品用卵清蛋白系列稀釋，比如 500、250、125 ng/ml 等，待檢樣品進(jìn)行適當(dāng)預(yù)稀釋，分別加入二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、ADP 核糖基化試劑—— βNAD + 三磷酸腺苷（ATP）+ 溶血磷脂膽堿 + 蛋白酶抑制劑 4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽（AEBSF）以及反應(yīng)底物，混勻，避光放置于 22 ℃ 6 h，之后加入 0.25 mol/L 氨水-50% 二甲基亞砜緩沖液終止反應(yīng)。此反應(yīng)混合物可保存在–20 ℃，在 24 ～ 48 h 內(nèi)完成 HPLC 分析。采用 C18 反向柱對(duì) ADP-核糖基化產(chǎn)物進(jìn)行分離和定量分析，樣品在注入前進(jìn)行離心，除去明礬或其他不溶解的物質(zhì)。HPLC 條件如下：C18 反向柱（5 μm，4.6 × 250 mm）；流動(dòng)相：溶劑 A 為 10 mmol/L 醋酸銨，80% 的乙腈，pH 8.5，溶劑 B 為10 mmol/L 醋酸銨，pH 8.5；流速：0.8 ml/min；洗脫方式：25% A 1 min，25% ～ 30% A 梯度 1 min，30% ～ 32% A 梯度 4 min，32% ～ 100% A 梯度 2 min，100% A 1 min；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng) 495 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 515 nm；樣品注入：10 μl 反應(yīng)混合物。HPLC 分析也可采用其他適宜的實(shí)驗(yàn)條件和方法。對(duì) PTx 參考品濃度-酶活性建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待檢樣品的酶活性單位。該實(shí)驗(yàn)以 1 μg PTx 的酶活性作為 1 個(gè) EU 單位。目前也開(kāi)發(fā)出操作更簡(jiǎn)便、效率更高的采用 96 孔板檢測(cè) ADP-核糖基化產(chǎn)物的方法[42]。

研究發(fā)現(xiàn)不同的解毒方法以及不同的疫苗配方可能導(dǎo)致 ADP-核糖基化活性和 HIST 之間缺乏相關(guān)性。僅僅依賴 ADP-核糖基化活性檢測(cè)可能不能完全反映疫苗在 HIST 中觀察到的情況，因?yàn)楹罄m(xù) ADP-核糖基化的發(fā)生需要細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化[43]。為了克服這一局限性，根據(jù) PTx 的 B 亞單位與靶細(xì)胞上的碳水化合物結(jié)合的性質(zhì)，使用包含完整唾液酸化多聚糖結(jié)構(gòu)的胎球蛋白作為配體捕獲 PTx，建立了基于 ELISA 的碳水化合物結(jié)合試驗(yàn)，用于檢測(cè) B 亞單位的活性[44-45]。具體方法是將待檢疫苗用同體積的 6 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）-0.5 mol/L 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）溶液或其他解吸附劑進(jìn)行 37 ℃過(guò)夜解吸附處理，離心上清用于分析。預(yù)先用 10 μg/ml 的胎球蛋白 100 μl/孔包被 96 孔微孔板，室溫放置 16 ～ 24 h。3% 牛血清白蛋白-PBST 封閉 1 h。B ～ H 排加入稀釋液 100 μl/孔，A1 ～ A9 加入待檢樣品，A10 加入稀釋液，A11、A12 加入 250 ng/ml 的 PTx 參考品 200 μl/孔，從 A → H 進(jìn)行系列倍比稀釋，室溫放置 2 h。加入抗 PTx 抗體和酶標(biāo)二抗，分別室溫放置2 h 和 1.5 h。加入顯色液顯色，2 mol/L H2SO4終止，酶標(biāo)儀讀取值。采用平行線法計(jì)算待檢樣品中 PTx B 亞單位的結(jié)合活性。該實(shí)驗(yàn)以 1 μg PTx 的結(jié)合活性作為 1 個(gè) BU 單位。

ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性試驗(yàn)和碳水化合物結(jié)合試驗(yàn)單獨(dú)與 HIST 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，均不具有相關(guān)性。而將兩個(gè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，建立數(shù)學(xué)模型后推算的 HIST 活性結(jié)果與動(dòng)物試驗(yàn)測(cè)定的結(jié)果具有良好的相關(guān)性（= 0.896）。對(duì) 76 批 7 種不同的 APV 產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示 ADP-核糖基化檢測(cè)和碳水化合物結(jié)合檢測(cè)這一體外檢測(cè)系統(tǒng)與溫度 HIST 檢測(cè)結(jié)果具有相關(guān)性[46]。但該檢測(cè)系統(tǒng)不能測(cè)量 PTx 發(fā)揮毒性所需的所有機(jī)制，如跨細(xì)胞膜的易位，另外進(jìn)行 ADP-核糖基化檢測(cè)時(shí)，因某些 APV 產(chǎn)品的 ADP-核糖基化活性基線較高，導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度不夠理想[47]。通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒▋?yōu)化，該檢測(cè)系統(tǒng)的兩種方法都可以用于疫苗生產(chǎn)的過(guò)程控制和成品的一致性監(jiān)測(cè)[48]，并被 WHO 列為 HIST 的可能替代方法。

5 其他基于細(xì)胞的分析方法

由于 PTx 的 ADP-核糖基化活性使 CHO 細(xì)胞中 cAMP 增加而引起細(xì)胞聚集，因此可對(duì) cAMP 進(jìn)行檢測(cè)來(lái)定量評(píng)估 PTx 活性，以避免判斷細(xì)胞聚集形態(tài)的主觀性。Hoonakker 等[49]開(kāi)發(fā)了一種分析方法，最初他們使用 A10 細(xì)胞，通過(guò)測(cè)量細(xì)胞內(nèi) cAMP 水平來(lái)監(jiān)測(cè) PTx 對(duì)細(xì)胞的作用。該方法可以檢測(cè) PTx 活性，但缺乏靈敏度和穩(wěn)定性。他們又通過(guò)使用新型報(bào)告基因細(xì)胞系（CHO-CRE 和 A10-CRE）進(jìn)行改進(jìn)，這些細(xì)胞可穩(wěn)定地表達(dá)反應(yīng) cAMP 水平的報(bào)告基因。兩種細(xì)胞系在檢測(cè) PTx 時(shí)具有濃度效應(yīng)關(guān)系，但在檢測(cè)疫苗 PTx 活性時(shí)只有 CHO-CRE 細(xì)胞結(jié)果與 HIST 結(jié)果相當(dāng)[50]。WHO 第二代 PTx 標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定研究顯示該方法檢測(cè)結(jié)果與 CHO 簇集試驗(yàn)結(jié)果也相當(dāng)，但同樣可能還受疫苗佐劑毒性的影響。

PTx A 亞基的 ADP-核糖基化途徑很重要，但它可能不是 PTx 的唯一生理反應(yīng)，B 亞單位已被證明可以自行誘導(dǎo)另一個(gè) ADP-核糖體基化的獨(dú)立途徑。已有多項(xiàng)研究利用DNA 芯片對(duì)暴露于 PTx 的人和動(dòng)物細(xì)胞系的基因表達(dá)譜來(lái)確定 PTx 各個(gè)方面的活性，通過(guò)這些方法已經(jīng)鑒定出許多可能的毒素活性生物標(biāo)志物[51]。這些研究可進(jìn)一步提高對(duì) PTx 毒性的認(rèn)識(shí)，并開(kāi)發(fā)出更精確的測(cè)定方法。

6 小結(jié)

近年由于百日咳再現(xiàn)，人們迫切需要開(kāi)發(fā)新的和改進(jìn)的 APV 疫苗，以誘導(dǎo)更持久的保護(hù)力、更多的細(xì)胞免疫；也可開(kāi)發(fā)毒性減低的 WPV 疫苗。在新疫苗的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)中仍需要方法測(cè)量 PTx 活性以及對(duì)終產(chǎn)品進(jìn)行殘留毒性監(jiān)控。

HIST 是檢測(cè) APV 中百日咳毒素殘余毒性的特異敏感方法，得以廣泛使用。由于 HIST 的高變異性和動(dòng)物倫理問(wèn)題，目前已開(kāi)發(fā)出很多新的體外替代法來(lái)檢測(cè) PTx 活性。但新方法的建立和應(yīng)用還存在許多挑戰(zhàn)，包括疫苗制劑的多樣性、百日咳抗原組成的差異性、不同的純化工藝和脫毒方法、不同的制劑配方、佐劑或賦形劑的干擾等。不同檢測(cè)方法可能需要針對(duì)特定的疫苗產(chǎn)品進(jìn)行優(yōu)化，包括稀釋疫苗以克服佐劑的細(xì)胞毒性、只測(cè)試疫苗微球而不是完整的配方和（或）將抗原從佐劑上解吸附。每種檢測(cè)方法都有其各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。精確的定量測(cè)定比限值測(cè)定更可取。定量檢測(cè)方法應(yīng)確定方法特異性、靈敏度以及 PTx 殘留活性的上限，根據(jù)參考毒素的生物活性進(jìn)行疫苗相對(duì)活性計(jì)算，結(jié)果以 IU 值表示并具有溯源性。本文所述的所有方法都可以檢測(cè)與百日咳疫苗產(chǎn)品相關(guān)的 PTx 活性水平，經(jīng)過(guò)優(yōu)化和驗(yàn)證，可用于評(píng)估疫苗的毒性殘留和毒性逆轉(zhuǎn)。

[1] Tamura M, Nogimori K, Murai S, et al. Subunit structure of islet-activating protein, pertussis toxin, in conformity with the A-B model. Biochemistry, 1982, 21(22):5516-5522.

[2] Kaslow HR, Burns DL. Pertussis toxin and target eukaryotic cells: binding, entry, and activation. FASEB J, 1992, 6(9):2684-2690.

[3] Locht C, Coutte L, Mielcarek N. The ins and outs of pertussis toxin. FEBS J, 2011, 278(23):4668-4682.

[4] Sekura RD, Fish F, Manclark CR, et al. Pertussis toxin. Affinity purification of a new ADP-ribosyltransferase. J Biol Chem, 1983, 258(23):14647-14651.

[5] World Health Organization (WHO). Pertussis vaccines--WHO position paper. Wkly Epidemiol Rec, 2005, 80(4):31-39.

[6] Tamura M, Nogimori K, YajimaM, et al. A role of the B-oligomer moiety of islet-activating protein, pertussis toxin, in development of the biological effects on intact cells. J Biol Chem, 1983, 258(11): 6756-6761.

[7] Wong WS, Rosoff PM. Pharmacology of pertussis toxin B-oligomer. Can J Physiol Pharmacol, 1996, 74(5):559-564.

[8] Nencioni L, Pizza MG, Volpini G, et al. Properties of the B oligomer of pertussis toxin. Infect Immun, 1991, 59(12):4732-4734.

[9] Loosmore SM, Zealey GR, Boux HA, et al. Engineering of genetically detoxified pertussis toxin analogs for development of a recombinant whooping cough vaccine. Infect Immun, 1990, 58(11):3653-3662.

[10] Nencioni L, Pizza M, Bugnoli M, et al. Characterization of genetically inactivated pertussis toxin mutants: candidates for a new vaccine against whooping cough. Infect Immun, 1990, 58(5):1308-1315.

[11] Pizza M, Covacci A, Bartoloni A, et al. Mutants of pertussis toxin suitable for vaccine development. Science, 1989, 246(4929):497-500.

[12] Edwards KM, Meade BD, Decker MD, et al. Comparison of 13 acellular pertussis vaccines: overview and serologic response. Pediatrics, 1995, 96(3 Pt 2):548-557.

[13] Sekura RD, Zhang YL, Roberson R, et al. Clinical, metabolic, and antibody responses of adult volunteers to an investigational vaccine composed of pertussis toxin inactivated by hydrogen peroxide.J Pediatr, 1988, 113(5):806-813.

[14] Gupta RK, Sharma SB, Ahuja S, et al. Glutaraldehyde inactivated pertussis vaccine: a less histamine sensitizing vaccine. J Biol Stand, 1987, 15(2):159-164.

[15] Sato Y, Sato H. Development of acellular pertussis vaccines. Biologicals, 1999, 27(2):61-69.

[16] Arciniega J, Wagner L, Prymula R, et al. Alternatives to HIST for acellular pertussis vaccines: Progress and challenges in replacement. Pharmeur Bio Sci Notes, 2016, 2015:82-96.

[17] Ambrus JL, Packman EW, Rossi GV, et al. The antagonism and synergism ofhistamine and antihistamines in mice. J Pharm Pharmacol, 1952, 4(7):466-470.

[18] Kind LS. The altered reactivity of mice after inoculation with Bordetella pertussis vaccine. Bacteriol Rev, 1958, 22(3):173-182.

[19] Parfentjev IA, Goodline MA. Histamine shock in mice sensitized with Hemophilus pertussis vaccine. J Pharmacol Exp Ther, 1948, 92(4): 411-413.

[20] Pittman M. Determination of the histamine sensitizing unitage of pertussis vaccine. J Biol Stand, 1975, 3(2):185-191.

[21] Hoonakker M, Arciniega J, Hendriksen C. Safety testing of acellular pertussis vaccines: Use of animals and 3Rs alternatives. Hum Vaccin Immunother, 2017, 13(11):2522-2530.

[22] Markey K, Asokanathan C, Feavers I. Assays for determining pertussis toxin activity in acellular pertussis vaccines. Toxins (Basel), 2019, 11(7):417.

[23] Ochiai M, Yamamoto A, Kataoka M, et al. Highly sensitive histamine-sensitization test for residual activity of pertussis toxin in acellular pertussis vaccine. Biologicals, 2007, 35(4):259-264.

[24] Ishida S, Kurokawa M, Asakawa S, et al. A sensitive assay method for the histamine-sensitizing factor using change in rectal temperature of mice after histamine challenge as a response. J Biol Stand, 1979, 7(1):21-29.

[25] Markey K, Asokanathan C, Tierney S, et al. Collaborative study: evaluation of proposed second international standard for pertussis toxin code: 15/126. Geneva, Switzerland: World Health Organization, 2017.

[26] Xing D, Maes A, Behr-Gross ME, et al. Collaborative study for the standardisation of the histamine sensitizing test in mice and the CHO cell-based assay for the residual toxicity testing of acellular pertussis vaccines. Pharmeur Bio Sci Notes, 2010, 2010(1):51-63.

[27] Carbonetti NH. Pertussis toxin and adenylate cyclase toxin: Key virulence factors of Bordetella pertussis and cell biology tools. Future Microbiol, 2010, 5(3):455-469.

[28] Mangmool S, Kurose H. G(i/o) protein-dependent and -independent actions of Pertussis Toxin (PTX). Toxins (Basel), 2011, 3(7):884-899.

[29] Sato Y, Arai H. Leucocytosis-promoting factor of Bordetella pertussis. I. Purification and characterization. Infect Immun, 1972, 6(6):899-904.

[30] Arai H, Sato Y. Separation and characterization of two distinct hemagglutinins contained in purified leukocytosis-promoting factor from Bordetella pertussis. Biochim Biophys Acta, 1976, 444(3):765- 782.

[31] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. Volume 3, 2020. Beijing: China Medical Science Press, 2020:114-116. (in Chinese)

國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典2020年版三部. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2020:114-116.

[32] Sato Y, Cowell JL, Sato H, et al. Separation and purification of the hemagglutinins from Bordetella pertussis. Infect Immun, 1983, 41(1):313-320.

[33] van Straaten-van de Kappelle I, van der Gun JW, Marsman FR, et al. Collaborative study on test systems to assess toxicity of whole cell pertussis vaccine. Biologicals, 1997, 25(1):41-57.

[34] Carbonetti NH. Pertussis leukocytosis: Mechanisms, clinical relevance and treatment. Pathog Dis, 2016, 74(7):ftw087.

[35] Gillenius P, J??tmaa E, Askel?f P, et al. The standardization of an assay for pertussis toxin and antitoxin in microplate culture of Chinese hamster ovary cells. J Biol Stand, 1985, 13(1):61-66.

[36] Isbrucker R, Daas A, Wagner L, et al. Transferability study of CHO cell clustering assays for monitoring of pertussis toxin activity in acellular pertussis vaccines. Pharmeur Bio Sci Notes, 2016, 2015:97- 114.

[37] Wagner L, Isbrucker R, Locht C, et al. In search of acceptable alternatives to the murine histamine sensitization test (HIST): What is possible and practical? Pharmeur Bio Sci Notes, 2016, 2016:151-170.

[38] Wagner LD, Corvette LJ, Ngundi MM, et al. Towards replacement of the acellular pertussis vaccine safety test: Comparison of in vitro cytotoxic activity and in vivo activity in mice. Vaccine, 2017, 35(51): 7160-7165.

[39] Xing D, Das RG, Newland P, et al. Comparison of the bioactivity of reference preparations for assaying Bordetella pertussis toxin activity in vaccines by the histamine sensitisation and Chinese hamster ovary-cell tests: assessment of validity of expression of activity in terms of protein concentration. Vaccine, 2002, 20(29-30):3535-3542.

[40] Kataoka M, Toyoizumi H, Yamamoto A, et al. Chinese hamster ovary (CHO) cell clustering does not correlate with in vivo histamine- sensitization when measuring residual activity of aldehyde-treated pertussis toxin (PT). Biologicals, 2002, 30(4):297-302.

[41] Cyr T, Menzies AJ, Calver J, et al. A quantitative analysis for the ADP-ribosylation activity of pertussis toxin: an enzymatic-HPLC coupled assay applicable to formulated whole cell and acellular pertussis vaccine products. Biologicals, 2001, 29(2):81-95.

[42] Asokanathan C, Tierney S, Ball CR, et al. An ELISA method to estimate the mono ADP-ribosyltransferase activities: e.g in pertussis toxin and vaccines. Anal Biochem, 2018, 540-541:15-19.

[43] Gomez SR, Yuen CT, Asokanathan C, et al. ADP-ribosylation activity in pertussis vaccines and its relationship to the in vivo histamine-sensitisation test. Vaccine, 2007, 25(17):3311-3318.

[44] Gomez SR, Xing DK, Corbel MJ, et al. Development of a carbohydrate binding assay for the B-oligomer of pertussis toxin and toxoid. Anal Biochem, 2006, 356(2):244-253.

[45] Asokanathan C, Yuen CT, Lin N, et al. Investigation of effects of different commercial source of bovine serum albumin on the binding of pertussis toxin to the glycoprotein fetuin. Vaccine, 2011, 29(44): 7593-7594.

[46] Yuen CT, Horiuchi Y, Asokanathan C, et al. An in vitro assay system as a potential replacement for the histamine sensitisation test for acellular pertussis based combination vaccines. Vaccine, 2010, 28(21):3714-3721.

[47] Isbrucker R, Arciniega J, McFarland R, et al. Report on the international workshop on alternatives to the murine histamine sensitization test (HIST) for acellular pertussis vaccines: state of the science and the path forward. Biologicals, 2014, 42(2):114-122.

[48] Yuen CT, Asokanathan C, Cook S, et al. Effect of different detoxification procedures on the residual pertussis toxin activities in vaccines. Vaccine, 2016, 34(18):2129-2134.

[49] Hoonakker ME, Ruiterkamp N, Hendriksen CF, et al. The cAMP assay: a functional in vitro alternative to the in vivo Histamine Sensitization test. Vaccine, 2010, 28(5):1347-1352.

[50] Hoonakker ME, Verhagen LM, Van der Maas L, et al. Reporter cell lines for detection of pertussis toxin in acellular pertussis vaccines as a functional animal-free alternative to the in vivo histamine sensitization test. Vaccine, 2017, 35(8):1152-1160.

[51] Vaessen SF, Bruysters MW, Vandebriel RJ, et al. Toward a mechanism-based in vitro safety test for pertussis toxin. Hum Vaccin Immunother, 2014, 10(5):1391-1395.

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（81701978）；“重大新藥創(chuàng)制”國(guó)家科技重大專項(xiàng)（2018ZX09738-005）

馬霄，Email：maxiao421@sina.cn；王麗嬋，Email：leechan221@163.com

2021-01-12

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.009