不同存儲(chǔ)溫度的huMSC-exo對(duì)UVB輻照HaCaT細(xì)胞的修復(fù)作用研究

章毅，陳侃俊，伍婷，李品宙，胡肖希，孔凡瑞，祁成，陳亮

·論著·

不同存儲(chǔ)溫度的huMSC-exo對(duì)UVB輻照HaCaT細(xì)胞的修復(fù)作用研究

章毅*，陳侃俊*，伍婷，李品宙，胡肖希，孔凡瑞，祁成，陳亮

200051 上海，中國(guó)干細(xì)胞集團(tuán)有限公司/中國(guó)干細(xì)胞集團(tuán)上海生物科技有限公司/中國(guó)干細(xì)胞集團(tuán)海南博鰲附屬干細(xì)胞醫(yī)院有限公司/上海市臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)/上海市干細(xì)胞技術(shù)有限公司

探究了不同存儲(chǔ)溫度的 huMSC-exo 對(duì) UVB 輻照 HaCaT 細(xì)胞的修復(fù)作用，為外泌體存儲(chǔ)選擇適宜的溫度條件提供理論依據(jù)。采用超速離心法從 huMSC 培養(yǎng)基上清中提取外泌體，用 Western blot、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)和透射電鏡技術(shù)進(jìn)行表征，并置于–80、–20、4、25 和 45 ℃存儲(chǔ) 1、3、7、14、30、50、100 和 150 d。構(gòu)建 UVB 輻照 HaCaT光老化細(xì)胞模型，用 huMSC-exo 處理 24 h 后觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞存活率、SA-β-gal 活性、T-SOD 活性、MDA 和 LDH 含量。huMSC-exo 呈具有清晰膜的茶托樣結(jié)構(gòu)，尺寸中位數(shù)為 114 nm，30 ～ 150 nm 囊泡數(shù)量占比約61.42%，表達(dá)外泌體表面標(biāo)記蛋白 CD9、CD63 和 CD81。–80 ℃和25 ℃存儲(chǔ) 1 ～ 150 d 的 huMSC-exo 能顯著提高 UVB 輻照 HaCaT 細(xì)胞存活率、恢復(fù)細(xì)胞形態(tài)、降低 SA-β-gal 活性、部分恢復(fù)細(xì)胞 T-SOD、MDA 和 LDH 水平；–20 ℃存儲(chǔ)的 huMSC-exo 對(duì) HaCaT 的增殖活性、細(xì)胞形態(tài)和SA-β-gal 活性有恢復(fù)作用；4 ℃存儲(chǔ)的 huMSC-exo 能減輕細(xì)胞老化水平；45 ℃存儲(chǔ)的 huMSC-exo 無(wú)顯著修復(fù)作用。–80 ℃、25 ℃存儲(chǔ)的 huMSC-exo 能夠顯著恢復(fù) UVB 輻照引起的 HaCaT 損傷，–20 ℃、4 ℃ huMSC-exo 作用效果次之，45 ℃的 huMSC-exo 無(wú)顯著影響，提示–80 ℃和 25 ℃能夠較好地維持huMSC-exo 的生物學(xué)功能。

外泌體； 間充質(zhì)干細(xì)胞； HaCaT 細(xì)胞； UVB 輻照

皮膚老化可以分為內(nèi)在老化和外在老化兩種類(lèi)型，后者又稱光老化。陽(yáng)光照射，尤其是暴露于紫外線 B（ultraviolet B，UVB）是導(dǎo)致皮膚光老化的主要因素，其還會(huì)引起機(jī)體活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）積聚、TNF-α、IL-1α、IL-16、IL-10 和 IL-8 等炎癥因子激活及皮膚慢性炎癥[1]。外泌體是細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）的主要類(lèi)型之一，直徑 30 ～ 150 nm，含有多種生物大分子，包括編碼 RNA、非編碼 RNA、DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，可由幾乎所有類(lèi)型的細(xì)胞分泌。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）或皮膚細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠延緩皮膚光老化[2]、加速創(chuàng)傷皮膚愈合[3]、激活角質(zhì)細(xì)胞并提升皮膚防御能力[4-7]，是皮膚老化及創(chuàng)傷修復(fù)的極具潛力的無(wú)細(xì)胞活性組分。

研究指出，外泌體的物理性質(zhì)因存儲(chǔ)條件的不同而改變，如尺寸減小、膜電位升高、蛋白質(zhì)含量降低等，其中存儲(chǔ)溫度是影響外泌體物理性質(zhì)的關(guān)鍵因素[8]。然而，目前關(guān)于存儲(chǔ)條件對(duì)外泌體生物學(xué)活性和穩(wěn)定性的影響鮮有報(bào)道。探究?jī)?yōu)化外泌體存儲(chǔ)條件以維持其在存儲(chǔ)過(guò)程中的生物活性，是保障外泌體臨床前研究結(jié)果的可重復(fù)性、臨床應(yīng)用的有效性、建立標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；耐饷隗w制備、存儲(chǔ)及應(yīng)用產(chǎn)業(yè)鏈的重要前提和關(guān)鍵。

本研究通過(guò) UVB 輻照 HaCaT 細(xì)胞構(gòu)建了人表皮光老化損傷模型，探究并比較不同存儲(chǔ)溫度條件下人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體（human umbilical cord MSC-derived exosome，huMSC-exo）對(duì) HaCaT 的潛在修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 采集足月產(chǎn)健康新生兒臍帶，經(jīng)產(chǎn)婦或家屬簽署知情同意書(shū)后獲得，符合國(guó)家相關(guān)法律和倫理委員會(huì)規(guī)定。CCK8 試劑盒購(gòu)自碧云天公司；BCA 檢測(cè)試劑盒、β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；CD9、CD63、CD81 抗體購(gòu)自 Abcam 公司；FBS、DMEM、0.25% Typsin-EDTA、L-谷氨酰胺購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自德國(guó) PAN-biotech 公司；0.22 μm 無(wú)菌濾器、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、24 孔板購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成公司。

1.1.2 儀器 Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀、ST-16R 低溫離心機(jī)、MTX 150 超速離心機(jī)、ULTS1368 低溫冰箱購(gòu)自美國(guó) Thermo 公司；1800 系列-190 氣相液氮罐購(gòu)自美國(guó) MVE 公司；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；預(yù)制膠凝膠蛋白電泳系統(tǒng)、iblot2 干式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)等購(gòu)自美國(guó) Life 公司；ChemiDoc 化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司；FYL-YS-150L 溫控干燥孵育箱購(gòu)自福意公司；TS100 倒置相差顯微鏡、DS-U3 顯微鏡相機(jī)控制器購(gòu)自日本 Nikon 公司；納米顆粒跟蹤分析儀 ZetaView PMX 110 購(gòu)自德國(guó) Particle Metrix 公司；透射電子顯微鏡購(gòu)自德國(guó) Leica 公司。

1.2 方法

1.2.1 huMSC 的分離培養(yǎng)與上清收集 取臍帶華通膠剪碎成約 2 mm3的組織塊，加入 II 型膠原酶 37 ℃恒溫消化 1.5 h，收集濾液室溫 2000 r/min 離心 10 min，收集細(xì)胞沉淀加入含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基重懸，置于 37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到 85% ～ 90% 時(shí)，用 0.25% 胰酶消化傳代，接種密度為 5 × 104/ml，每 2 天為細(xì)胞全量換液，每 3 ～ 4 天傳代 1 次。取 P3 ～ P6 代次 huMSC，接種 24 h 后換無(wú)血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到 85% ～ 90% 時(shí)，用無(wú)菌瓶收集細(xì)胞上清。

1.2.2 huMSC-exo 的制備、存儲(chǔ)與復(fù)溫 取 P3 ～ P6 代 huMSC 培養(yǎng)基上清，分裝于 50 ml 離心管中，室溫 2500 r/min 離心 10 min，去除細(xì)胞碎片；收集上清，置于新的 50 ml 離心管中，室溫10 000 r/min 離心 20 min；收集上清，過(guò) 0.22 μm 無(wú)菌濾器，濾液置于超速離心管中，4 ℃ 100 000 ×離心 270 min；離心結(jié)束后，用少量 PBS（3 ～ 5 ml）輕輕沖洗沉淀 1 次，最后用 PBS（約 2 ml，pH = 7.4）溶解、混勻沉淀，得到 huMSC-exo。按照 BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定總蛋白濃度。外泌體分裝后置于–80、–20、4、25 和 45 ℃冰箱或孵育箱中存儲(chǔ)。同時(shí)，應(yīng)按照 1 ～ 150 d 的凍存時(shí)長(zhǎng)間隔，取同一個(gè)體來(lái)源的 P3 ～ P6 代次 huMSC 上清進(jìn)行 huMSC-exo 制備，并確保各存儲(chǔ)溫度、同一存儲(chǔ)時(shí)長(zhǎng)的 huMSC-exo 均制備來(lái)自同一批次、同一代次 huMSC 上清。復(fù)溫時(shí)，將 huMSC-exo 從冰箱或孵育箱中取出，室溫靜置，待完全溶解后，用無(wú)血清 DMEM 配制成 huMSC-exo 終濃度為 44 μg/ml的培養(yǎng)體系，可避免 huMSC-exo 反復(fù)凍融。

1.2.3 HaCaT UVB 輻照損傷模型的建立與huMSC-exo 處理 將 HaCaT 細(xì)胞接種于 24 孔板中，接種密度為 1 × 105/ml，待細(xì)胞融合度達(dá)到 30%，換成無(wú)血清 DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 50%，棄去 DMEM 培養(yǎng)基，每孔加入 500 μl PBS，將 UVB 輻照組、huMSC-exo 組置于 UVB 光源正下方 6 cm 處，輻照強(qiáng)度為 2.85 μW/cm2，輻照時(shí)間 30 s，累計(jì)輻照劑量 8.55 mJ/cm2。隨后，立即棄去 PBS，加入含不同存儲(chǔ)條件 huMSC-exo 的培養(yǎng)基，對(duì)照組和 UVB 輻照組添加等體積 PBS。

1.2.4 納米顆粒跟蹤分析技術(shù)檢測(cè) huMSC-exo 粒徑 取 PBS 稀釋的 huMSC-exo，根據(jù)操作手冊(cè)檢測(cè)樣本粒徑大小及分布，使用 110 nm 聚苯乙烯顆粒進(jìn)行校準(zhǔn)，測(cè)定溫度為25 ℃。

1.2.5 Western blot 檢測(cè) huMSC-exo 表面標(biāo)志性蛋白 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞裂解和總蛋白抽提，BCA 法測(cè)定總蛋白濃度。huMSC-exo 樣本上樣量為 10 μg，經(jīng)過(guò) 12% SDS-PAGE 凝膠電泳后通過(guò) iblot2 干式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上，封閉液封閉 1 h，采用 ECL 法進(jìn)行抗體孵育和顯色，孵育條件為CD9（1:1000）、CD63（1:1000）和CD81（1:1000）4 ℃搖床孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后 PBS 漂洗 2 次，加入 HRP 工作液，室溫振蕩孵育 10 min，PBS 漂洗 2 次，加入檢測(cè)液孵育 5 min，通過(guò) ChemiDoc 化學(xué)發(fā)光成像分析儀進(jìn)行顯影分析。

1.2.6 透射電鏡鑒定 huMSC-exo 形態(tài) 取 PBS 重懸的 huMSC-exo 100 μl，室溫靜置 5 min，加入染色劑醋酸鈾水溶液（2%，pH = 4.0）進(jìn)行陰性染色，混勻后用移液槍將樣本滴加到 200 目復(fù)膜銅網(wǎng)上，自然干燥后置于透射電子顯微鏡下觀察，拍攝 huMSC-exo 電鏡照片。

1.2.7 CCK8 法檢測(cè) HaCaT 細(xì)胞增殖 按照 1.2.3 所述方法于 24 孔板培養(yǎng)和處理HaCaT 細(xì)胞。huMSC-exo 處理 24 h 后，每孔加入 100 μlCCK8 工作液，37 ℃孵育 3 h，酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm吸光值。

1.2.8 SA-β-gal活性檢測(cè) 按照 1.2.3 所述方法培養(yǎng)和處理 HaCaT 細(xì)胞。huMSC-exo 處理 24 h 后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞 SA-β-gal 活性，倒置相差顯微鏡下隨機(jī)選取 10 個(gè)視野，每個(gè)視野細(xì)胞數(shù)約 100 個(gè)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)。

1.2.9 T-SOD、MDA 和 LDH 含量檢測(cè) 按照 1.2.3 所述方法培養(yǎng)和處理 HaCaT 細(xì)胞，24 h 后收集培養(yǎng)基上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè) T-SOD、MDA 和 LDH 水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 huMSC-exo 鑒定結(jié)果

本研究制備的 huMSC-exo 具有清晰膜輪廓，呈茶托樣結(jié)構(gòu)（圖 1A），粒徑分布范圍 30 ～ 590 nm，中位數(shù) 114 nm，30 ～ 150 nm的囊泡數(shù)量占比約 61.42 %（圖 1B），表達(dá) CD9、CD63 和 CD81（圖 1C）。根據(jù)國(guó)際細(xì)胞外囊泡協(xié)會(huì)對(duì)外泌體的判定標(biāo)準(zhǔn)[9]，本研究huMSC-exo 是以外泌體為主的細(xì)胞外囊泡。

2.2 huMSC-exo 對(duì) UVB 輻照 HaCaT 增殖與形態(tài)的影響

未經(jīng) UVB 輻照的 HaCaT 細(xì)胞聯(lián)結(jié)成片，呈扁平鋪路石狀排列，UVB 輻照后細(xì)胞貼壁能力降低，呈梭形或不規(guī)則形狀，細(xì)胞間隙增加（圖 2A），細(xì)胞存活率降低至對(duì)照組的 0.31倍（圖 2B，< 0.001）。25 ℃和–80 ℃存儲(chǔ) 1 ～ 150 d 的 huMSC-exo 處理均能顯著提高輻照后 HaCaT 細(xì)胞存活率，改善細(xì)胞形態(tài)和貼壁能力；–20 ℃存儲(chǔ)的huMSC-exo 恢復(fù)作用次之，4 ℃和45 ℃huMSC-exo 處理對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)顯著影響，提示存儲(chǔ)溫度是huMSC-exo 的活性和生物學(xué)功能的影響因素（圖 2C）。不同溫度下存儲(chǔ) 150 d 的存活率結(jié)果顯示，–80 ℃、–20 ℃和25 ℃ huMSC-exo 處理組 HaCaT 細(xì)胞存活率分別顯著提高至 UVB 輻照組的 1.17 倍（< 0.001）、1.10 倍（< 0.05）和 1.21 倍（< 0.001）（圖 2D），與形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果一致。

圖1 huMSC-exo 鑒定結(jié)果（A：形態(tài)觀察；B：粒徑分布；C：標(biāo)志性蛋白表達(dá)）

Figure 1 Characteristics of huMSC-exo (A: Morphology; B: Particle size distribution; C: Expression of CD9, CD63 and CD81)

圖2 huMSC-exo 對(duì) UVB 輻照 HaCaT 存活率的影響（A：不同溫度存儲(chǔ) 150 d 的 huMSC-exo 對(duì) HaCaT 形態(tài)的影響，40 ×，其中，a：采用 UVB 輻照，b ～ f：在接受輻照后分別用–80 ℃、–20 ℃、4 ℃、25 ℃和 45 ℃存儲(chǔ)的 huMSC-exo 處理；B：UVB 輻照顯著降低 HaCaT 存活率；C：不同溫度存儲(chǔ) 1 ～ 150 d的 huMSC-exo 對(duì) HaCaT 存活率的影響；D：不同溫度下存儲(chǔ) 150 d 的 huMSC-exo 對(duì) HaCaT 存活率的影響；*P < 0.05，***P < 0.001）

Figure 2 Effects of huMSC-exo treatment on UVB irradiated HaCaT cells (A: Effects of huMSC-exo stored at different temperature for 150 days on HaCaT cell morphology, 40 ×, a: cells were treated with equal volume of PBS after UVB irradiation, b - f: cells were treated with huMSC-exo stored at –80 ℃, –20 ℃, 4 ℃, 25 ℃and 45 ℃ after UVB irradiation; B: UVB irradiation significantly reduced cell viability; C: Effects of huMSC-exo stored at different temperature for 1 to 150 days on HaCaT cell viability; D: Effects of huMSC-exo stored at different temperature for 150 days on HaCaT cell viability;*< 0.05,***< 0.001)

2.3 huMSC-exo 對(duì) UVB 輻照 HaCaT 細(xì)胞衰老的影響

SA-β-gal 是反映細(xì)胞衰老水平的重要指標(biāo)，其活性隨著細(xì)胞衰老而增加。本研究檢測(cè)了不同溫度下存儲(chǔ) 1、7、50 和 150 d 的 huMSC-exo 對(duì) UVB 輻照 HaCaT 細(xì)胞 SA-β-gal活性的影響（圖 3）。UVB 對(duì)照組的陽(yáng)性染色面積為 41%，各存儲(chǔ)時(shí)長(zhǎng)條件下–80 ℃、–20 ℃、4 ℃、25 ℃和 45 ℃ huMSC-exo 處理組的平均陽(yáng)性染色面積分別為8%、16%、29%、11% 和 43%，–80、25 和–20 ℃存儲(chǔ)的 huMSC-exo 能顯著降低 UVB 輻照引起的細(xì)胞 SA-β-gal 活性升高，4 ℃存儲(chǔ) huMSC-exo 作用效果次之，45 ℃存儲(chǔ) huMSC-exo 對(duì)SA-β-gal活性無(wú)影響，表明在適宜溫度條件下存儲(chǔ)的 huMSC-exo 具有光老化修復(fù)作用。

圖3 huMSC-exo 對(duì) UVB 輻照 HaCaT 細(xì)胞 SA-β-gal 活性的影響（A：SA-β-gal 染色情況；B：計(jì)算隨機(jī)視野下 100 個(gè)細(xì)胞著色情況，估算 SA-β-gal 染色陽(yáng)性面積百分比）

Figure 3 SA-β-gal activity of HaCaT treated with huMSC-exo (A: SA-β-gal staining in the different groups; B: Estimation of positive area percentage of SA-β-gal staining by analyzing random 100 cells in each group)

圖4 不同溫度存儲(chǔ) 150 d huMSC-exo 對(duì) UVB 輻照 HaCaT T-SOD（A）、MDA（B）和 LDH（C）的影響（*P < 0.05，**P < 0.01）

Figure 4 Effects of huMSC-exo stored at different temperatures for 150 d on T-SOD (A), MDA (B) and LDH (C) levels of UVB irradiated HaCaT cells (*< 0.05,**< 0.01)

2.4 huMSC-exo 對(duì) UVB 輻照HaCaT T-SOD、MDA 和 LDH 水平的影響

–80 ℃和 25 ℃存儲(chǔ)的 huMSC-exo 處理能不同程度地提高 UVB 輻照 HaCaT 細(xì)胞 T-SOD 活力、降低 MDA 和 LDH 分泌量（< 0.05 或< 0.01）；–20 ℃和 4 ℃存儲(chǔ)的 huMSC-exo 也具有降低細(xì)胞 LDH 分泌的作用（< 0.05），對(duì) T-SOD 活性和 MDA 含量無(wú)顯著影響；45 ℃存儲(chǔ)的huMSC-exo 對(duì) UVB 輻照后 HaCaT T-SOD、MDA 和 LDH 都無(wú)顯著影響（圖 4）。這些結(jié)果與細(xì)胞存活率及 SA-β-gal 活性檢測(cè)結(jié)果一致，提示huMSC-exo 對(duì) UVB 輻照損傷的修復(fù)作用可能與修復(fù)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)并降低細(xì)胞毒性損傷有關(guān)。

3 討論

紫外線，尤其是 UVB（290 ～ 320 nm）輻照是引起皮膚光老化的主要原因，會(huì)導(dǎo)致皮膚細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），包括單線態(tài)氧、超氧陰離子和過(guò)氧化氫，并引起皮膚細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的異常合成與降解，最終導(dǎo)致皮膚老化[10]。

研究發(fā)現(xiàn)，以往被認(rèn)為是“細(xì)胞排泄物”的外泌體不僅在細(xì)胞及組織間通訊中扮演關(guān)鍵角色[11]，_ENREF_3_ENREF_7 具有免疫調(diào)節(jié)作用[12]和為難治性疾病提供早期診斷生物標(biāo)志物的潛力[13]，在皮膚學(xué)領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用前景，例如：能夠調(diào)控細(xì)胞衰老并減輕皮膚老化[14]、促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷修復(fù)[15]、緩解皮膚炎癥[16]、減少皮膚瘢痕形成[17]等。人真皮細(xì)胞來(lái)源 EVs 能夠向人表皮細(xì)胞遷移并促進(jìn)細(xì)胞劃痕愈合，通過(guò) miR-23a-3p 改善皮膚細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型[18]。Deng 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，huMSC-exo 預(yù)處理能夠顯著降低 UVB 輻照人真皮成纖維細(xì)胞的 ROS 水平，提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 1（glutathione peroxidase 1，GPX-1）、T-SOD 和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）的活性及 mRNA 表達(dá)水平，預(yù)防人真皮成纖維細(xì)胞光老化。本研究用 huMSC-exo 處理 UVB 輻照后的 HaCaT 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能夠顯著改善其細(xì)胞形態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞 T-SOD 活力，降低 SA-β-gal 水平和 MDA、LDH 含量，與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致，提示 huMSC-exo可能通過(guò)調(diào)節(jié)皮膚細(xì)胞氧化還原狀態(tài)發(fā)揮光老化修復(fù)作用。

盡管外泌體的生物學(xué)作用外沿被不斷拓寬，但人們對(duì)如何保存外泌體以最大程度維持其活性功能卻并未十分明確。研究指出，制備后的外泌體在保存過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)囊泡粒徑縮小、囊泡數(shù)量增加、膜電位降低、完整性破壞和內(nèi)容物析出等改變，影響外泌體的生物學(xué)功能[19]，但 Bosch 等[20]卻發(fā)現(xiàn)隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)，囊泡會(huì)發(fā)生聚集，從而引起數(shù)量減少。影響外泌體存儲(chǔ)活性、尺寸及亞型濃度的可能因素眾多，包括：存儲(chǔ)溫度、時(shí)長(zhǎng)、溶劑及其 pH、外泌體來(lái)源及樣本新鮮程度、制備方法等，其中溫度被認(rèn)為是影響外泌體尺寸、形態(tài)和內(nèi)容物完整性的關(guān)鍵因素[21-23]。

在本研究中，–80 ℃和 25 ℃存儲(chǔ)的 huMSC-exo 均能顯著修復(fù) UVB 輻照引起的HaCaT 損傷，表明深低溫和常溫保存均能較好地維持外泌體的光老化修復(fù)活性。有趣的是，–20 ℃和 4 ℃存儲(chǔ)的 huMSC-exo 的恢復(fù)作用不及–80 ℃或 25 ℃存儲(chǔ)的 huMSC-exo，提示這并不是維持 huMSC-exo 生物學(xué)功能的最佳存儲(chǔ)溫度。盡管本研究用于處理細(xì)胞的 huMSC-exo 不存在反復(fù)凍融情況，但–20 ℃和–80 ℃均不可避免地存在一次 huMSC-exo 凍融，4 ℃存儲(chǔ)雖然未經(jīng)凍融但降溫幅度較大，提示外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等內(nèi)容物在該溫度下并不穩(wěn)定，25 ℃則是最接近 huMSC-exo 原料收集、制備和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的操作溫度。這些結(jié)果提示降溫、凍融和凍存后應(yīng)用狀態(tài)等復(fù)合因素都可能影響 huMSC-exo 的生物學(xué)活性，對(duì)于 huMSC-exo 存儲(chǔ)應(yīng)盡可能減少制備到應(yīng)用全過(guò)程的溫度變化，選擇能夠較好地維持其膜結(jié)構(gòu)和內(nèi)容物完整性及穩(wěn)定性的存儲(chǔ)溫度以幫助維持其功能活性。Oosthuyzen 等[24]在常溫儲(chǔ)存 28 h 的血清

外泌體中檢測(cè)發(fā)現(xiàn) CD63 和 TSG101 表達(dá)不變；Jin 等[25]發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體在常溫儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)（0 ～ 48 h）RNA 含量不變，然而，尿液常溫儲(chǔ)存1 周，外泌體產(chǎn)量隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低[26]，表明外泌體經(jīng)過(guò)制備及其來(lái)源的不同在常溫條件下的存儲(chǔ)穩(wěn)定性可能存在差異。目前，外泌體通常于–80 ℃存儲(chǔ)，盡管對(duì)外泌體存儲(chǔ)的最適溫度依然缺乏足夠證據(jù)支持，但苛刻的深低溫存儲(chǔ)無(wú)疑也成為限制外泌體應(yīng)用的重要因素。本研究結(jié)果支持了 huMSC-exo 常溫存儲(chǔ)、運(yùn)輸和應(yīng)用的可行性。

本研究結(jié)果也表明，huMSC-exo 不適宜在高溫條件下存儲(chǔ)。Schulz 等[27]提取了 B 淋巴細(xì)胞源 EV 并測(cè)試其在 37 ℃、50 ℃、70 ℃、100 ℃和高壓蒸汽處理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)隨著高溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，EV 粒徑尺寸和顆粒濃度降低、蛋白濃度升高，100 ℃ EV的粒徑比 37 ℃ EV 更小，表明高溫會(huì)造成囊泡縮小或裂解。Park 等[8]通過(guò)蛋白免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，外泌體在 4 ℃、–20 ℃和–70 ℃保存 25 d 依然表達(dá)外泌體標(biāo)志性蛋白 CD63 和CD81，37 ℃條件下保存 16 d 開(kāi)始不表達(dá) CD63 和 CD81。本研究中，45 ℃存儲(chǔ) 1 ～ 150 d 的 huMSC-exo 對(duì) UVB 輻照 HaCaT 的細(xì)胞形態(tài)、增殖活性、老化水平等均沒(méi)有明顯修復(fù)作用，表明即使是短時(shí)間較高溫存儲(chǔ)也會(huì)破壞 huMSC-exo 的生物學(xué)活性，如對(duì)表皮細(xì)胞的光老化修復(fù)作用，提示在外泌體的存儲(chǔ)、運(yùn)輸、應(yīng)用制劑制備等環(huán)節(jié)均應(yīng)避免高溫。

我們?cè)谥苽?huMSC-exo 后 1 ～ 150 d 的存儲(chǔ)周期內(nèi)選取了多個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行研究，存活率檢測(cè)結(jié)果顯示，各相同存儲(chǔ)溫度下 huMSC-exo 對(duì) HaCaT 存活率的促進(jìn)作用均隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)先下降后升高，這可能是由于同一存儲(chǔ)時(shí)長(zhǎng)的 huMSC-exo 均同時(shí)制備自同一代次huMSC，而存儲(chǔ) 150 d 的 huMSC-exo 來(lái)源 huMSC代次最低，提示huMSC-exo 的功能和來(lái)源細(xì)胞的代次有關(guān)。HuMSC-exo 對(duì) SA-β-gal 活性的影響則未隨著存儲(chǔ)時(shí)間延長(zhǎng)顯示出明顯規(guī)律。這些結(jié)果提示在外泌體相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)注重來(lái)源質(zhì)量、制備工藝及批次一致性，以保障功效穩(wěn)定性[8]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn) huMSC-exo 在 –80 ℃、25 ℃存儲(chǔ)長(zhǎng)達(dá) 150 d 后對(duì) HaCaT 細(xì)胞依然具有 UVB 損傷修復(fù)功能，–20 ℃保存的 huMSC-exo 作用效果次之，45 ℃ huMSC-exo 無(wú)修復(fù)作用，提示外泌體制備、存儲(chǔ)和應(yīng)用各環(huán)節(jié)應(yīng)避免高溫，同時(shí)，在適宜的溫度條件下 huMSC-exo 或可長(zhǎng)期存儲(chǔ)并維持其功能活性。然而，我們從功效角度探究了不同存儲(chǔ)溫度 huMSC-exo 的光老化修復(fù)作用，未明確相應(yīng)條件下其內(nèi)容物組成及含量、囊泡結(jié)構(gòu)等改變。接下來(lái)，我們將利用熒光標(biāo)記、RNA 測(cè)序等技術(shù)進(jìn)一步分析不同存儲(chǔ)條件下 huMSC-exo 的改變及光老化修復(fù)作用機(jī)制，為 huMSC-exo 的存儲(chǔ)、運(yùn)輸和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論支持。

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The recovery effects of huMSC-exo stored at different temperatures on UVB irradiated HaCaT cells

ZHANG Yi, CHEN Kan-jun, WU Ting, LI Pin-zhou, HU Xiao-xi, KONG Fan-rui, QI Cheng, CHEN Liang

Author Affiliation: China Stem Cell Group Co., Ltd. / China Stem Cell Group Shanghai Biotechnology Co., Ltd. / China Stem Cell Group Affiliated Stem Cell Hospital Boao Hainan Co., Ltd. / Shanghai Cord Blood Bank/Shanghai Stem Cell Technology Co., Ltd, 200051 Shanghai, China

To investigate the recovery effects of huMSC-exo stored at different temperatures on UVB irradiated HaCaT cells.Exosomes were extracted from the medium supernatant of huMSC by ultracentrifugation and characterized by Western blot, nanoparticle tracking analysis and transmission electron microscopy. huMSC-exo were separated and stored at –80 ℃, –20 ℃,4 ℃, 25 ℃ and 45 ℃ for 1 day, 3 days, 7 days, 14 days, 30 days, 50 days, 100 days and 150 days. huMSC-exo was then added to UVB irradiated HaCaT cells. After 24 h incubation, cell viability of haCaT was measured by CCK8 assay and cell morphology was photographed. The activities of SA-β-gal and T-SOD, the contents of MDA and LDH were detected by commercial kit.The huMSC-exo showed a typical saucer-like structure with clear membrane. The median particle size was 114 nm, and the proportion of vesicles within the size range of 30 - 150 nm was about 61.42%. Besides, huMSC-exo expressed marker proteins CD9, CD63 and CD81. huMSC-exo stored at –80 ℃ and 25 ℃ for 1 - 150 d significantly improved the cell viability of UVB irradiated HaCaT cells, reduced the activity of SA-β-gal, and restored cell morphology, T-SOD, MDA and LDH levels. huMSC-exo stored at –20 ℃ also showed beneficial effects on the cell proliferation, morphology and cell aging of HaCaT cells. huMSC-exo stored at 4 ℃ decreased SA-β-gal activity. However, huMSC-exo stored at 45 ℃ could not recover UVB induced damage of HaCaT cells.huMSC-exo stored at –80 ℃ and 25 ℃ shows a significant repair effect on UVB irradiated HaCaT cells, followed by huMSC-exo stored at –20 ℃ and 4 ℃, while huMSC-exo stored at 45 ℃ exerts no significant recovery effect on HaCaT cells. These results suggests that the biological functions of huMSC-exo can be relatively well maintained at –80 ℃ and 25 ℃.

exosome; mesenchymal stem cells; HaCaT cells; UVB irradiation

WU Ting, Email: wuting@shanghaicordblood.org

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.004

伍婷，Email：wuting@shanghaicordblood.org

2020-12-24

*同為第一作者