丹皮酚軟膏微生物限度檢查方法適用性研究

夏新生，陳扣寶，呂小燕

·論著·

丹皮酚軟膏微生物限度檢查方法適用性研究

夏新生，陳扣寶，呂小燕

230088 安徽，合肥市食品藥品檢驗中心微生物科

根據(jù)《中國藥典》（2020 年版）最新規(guī)定，對丹皮酚軟膏微生物限度檢查方法適用性進行研究，建立該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法。利用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌和黑曲霉菌 5 種代表菌進行試驗，選用 1:10、1:20、1:50 供試液的平皿傾注法，以及 1:10 供試液分別沖洗 320 ml/膜、560 ml/膜的薄膜過濾法，分別進行消除樣品抑菌活性篩查試驗。采用薄膜過濾法（沖洗 560 ml/膜），金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌試驗回收比值達到要求；采用增加供試品稀釋（1:20）后，白色念珠菌的回收比值也達到要求。丹皮酚軟膏微生物限度檢查，需氧菌總數(shù)可采用薄膜過濾法（沖洗 560 ml/膜）測定，霉菌和酵母菌總數(shù)可按供試品稀釋（1:20）傾注法測定，控制菌中金黃色葡萄球菌可采用稀釋法（400 ml）、銅綠假單胞菌可采用常規(guī)法測定，結(jié)果符合要求。

丹皮酚軟膏； 微生物限度檢查； 適用性研究； 薄膜過濾法

丹皮酚是中藥丹皮的主要有效成分之一[1]，具有廣泛的生物學(xué)活性[2]，有鎮(zhèn)靜[3]、催眠、抗感染[4]、抗炎[5]、抗氧化、降血壓[6]和抑制變態(tài)反應(yīng)[7]的作用。大量研究表明：丹皮酚這種有效成分在防治心血管疾病方面具有較大潛力[8]，但由于該成分存在易揮發(fā)[9]、易分解和難溶性等不足，其臨床應(yīng)用在一定程度上受到限制[10]。

丹皮酚軟膏[11]是通過將丹皮酚、丁香油[12]兩種原料藥，加入適宜基質(zhì)而制成的中藥類外用膏劑，它具有消炎、止癢作用[13]，臨床可用于濕疹、皮炎、蚊蟲叮咬、皮膚瘙癢等[14]，對防治過敏性鼻炎和感冒也有一定療效[15]?！吨袊幍洹罚?020 年版）于 2020 年 12 月 30 日正式實施，然而歷版《中國藥典》中，均無藥品品種項下微生物限度檢查的具體方法，所以每次新版藥典實施前，都需要開展相關(guān)藥品微生物限度檢查的方法研究，以確保該檢查方法的適用性，從而達到所采用方法的有效、可行[16]。因此，該文依據(jù)新版藥典對丹皮酚軟膏，按照皮膚給藥制劑要求，進行了需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌測定方法的適用性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗儀器 IPP260 生化培養(yǎng)箱購自德國美墨爾特公司；MJX-160B-Z 型霉菌培養(yǎng)箱和立式壓力蒸汽滅菌器購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HTY-305SP 型微生物限度檢測儀、勻漿儀和開放式薄膜過濾器均購自杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司；生物安全柜購自上海振梓創(chuàng)空氣凈化設(shè)備有限公司；顯微鏡購自萊卡顯微系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司。

1.1.2 試驗樣品 丹皮酚軟膏，購買市售三批樣品（批號為 20190714、20190719、20191202），規(guī)格為 20 g（批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字Z34020837），購自安徽立方制藥有限公司。

1.1.3 試驗用培養(yǎng)基 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板均為北京三藥股份有限公司產(chǎn)品，且經(jīng)適用性檢查合格。

1.1.4 試驗用稀釋劑 使用的稀釋劑主要有北京三藥股份有限公司生產(chǎn)的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，自制的 0.9% 無菌氯化鈉溶液和 0.1% 聚山梨酯 80 溶液，均質(zhì)控合格。

1.1.5 試驗用菌株[17]枯草芽孢桿菌（）[CMCC(B)63501]、金黃色葡萄球菌（）[CMCC(B)26003][18]、銅綠假單胞菌（）[CMCC(B) 10104]、白色念珠菌（）[CMCC(F) 98001]、黑曲霉（）[CMCC(F) 98003]，這 5 種試驗標(biāo)準(zhǔn)菌均由中國食品藥品檢定研究院提供，經(jīng)復(fù)蘇、傳代后使用第四代工作菌懸液。

1.2 方法

1.2.1 工作菌液制備[19]

1.2.1.1 制備枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的工作菌懸液[20]分別取1 ml經(jīng) 33 ℃培養(yǎng) 22 h 的枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的液體培養(yǎng)物，加到 9 ml 無菌氯化鈉溶液（0.9%）中，分別 10 倍稀釋至 10-7不大于 100 CFU/ml 菌懸液，備用。

1.2.1.2 制備白色念珠菌的工作菌懸液[20]取1 ml 經(jīng) 22 ℃培養(yǎng) 46 h 的白色念珠菌的液體培養(yǎng)物，加到 9 ml 無菌氯化鈉溶液（0.9%）中，再10 倍稀釋至 10-6不大于 100 CFU/ml 菌懸液，備用。

1.2.1.3 制備黑曲霉的工作菌懸液[20]取經(jīng) 22 ℃在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng) 6 d 的黑曲霉菌斜面培養(yǎng)物，加入 6 ml 0.9% 無菌氯化鈉溶液（含 0.05% 聚山梨酯 80）洗下黑曲霉孢子，經(jīng)無菌脫脂棉濾過吸出，作為原菌液，再用 0.9% 無菌氯化鈉溶液（含 0.05% 聚山梨酯 80）10 倍稀釋至 10-6不大于 100 CFU/ml 菌懸液，備用。

1.2.2 工作菌液計數(shù)[19]

1.2.2.1 對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌計數(shù) 分別取 1 ml 枯草芽孢桿菌 10-7、金黃色葡萄球菌 10-7、銅綠假單胞菌 10-7的稀釋液，再依次加入 25 ml 44 ℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基到無菌平皿中，每種菌測定 2 皿，33 ℃培養(yǎng)46 h，計數(shù)，3 次平行測定，結(jié)果不大于 100 CFU/ml，可以使用。結(jié)果見表 1。

1.2.2.2 對白色念珠菌和黑曲霉菌計數(shù) 分別取 1 ml 白色念珠菌 10-6、黑曲霉菌 10-6的稀釋液，再依次加入 25 ml 44 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基到無菌平皿中，每種菌測定 2 皿，22 ℃培養(yǎng)96 h，計數(shù)，3 次平行測定，結(jié)果不大于100 CFU/ml，可以使用。結(jié)果見表 1。

1.2.3 供試液制備 取丹皮酚軟膏內(nèi)容物 10 g，加入 45 ℃含 1% 聚山梨酯 80 無菌 pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100 ml，用勻漿儀充分混勻，靜置 10 min，取上清液作為 1:10 供試液，備用。再取 1:10 供試液稀釋制成 1:20 和 1:50 的供試液，作為篩選有效消除抑菌活性方法的樣品。

1.2.4 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的適用性試驗

1.2.4.1 采用平皿法（傾注法）計數(shù) 1:10、1:20、1:50 供試液的需氧菌總數(shù)與 1:10、1:20 供試液的霉菌和酵母菌總數(shù) 試驗組：①分別取 9 ml 1:10、1:20、1:50 的供試液和 1 ml 已制備好枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的菌液（不大于 1000 CFU/ml），混合均勻，再分別取上述混合溶液 1 ml 注入平皿，迅速倒入 15 ～20 ml 不超過 45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，待凝，每個菌株制備 2 個平皿，在 33 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 ～ 120 h，觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)，取均值。②分別取 1:10、1:20 供試液 9 ml和 1 ml 已制備好的白色念珠菌、黑曲霉（不大于 1000 CFU/ml），混合均勻，再分別取上述混合溶液 1 ml 注入平皿，迅速倒入 15 ～ 20 ml 不超過 45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，待凝，每個菌株制備2 個平皿，在 22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 120 ～ 168 h，觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)，取均值。菌液組：用無菌氯化鈉溶液（0.9%）代替供試液，分別取9 ml 和 1 ml 已制備好的 5種菌液（同試驗組中菌液），混合均勻，再分別取 1 ml 注入平皿內(nèi)，每種菌平行制備 2 個平皿，測定所加的試驗菌數(shù)（培養(yǎng)基與培養(yǎng)時間同試驗組）。供試品對照組：按試驗組方法，不加試驗菌，直接取制備好的供試液試驗，測定供試品菌數(shù)（本底菌）。稀釋劑對照組：取與供試液等量的稀釋劑代替供試液試驗，其余按試驗組方法進行，平行做2 份，培養(yǎng)計數(shù)。

1.2.4.2 薄膜過濾法計數(shù) 1:10 供試液的需氧菌總數(shù)計數(shù)方法試驗[20]試驗組：分別取 9 ml1:10 的供試液和 1 ml 已制備好枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的菌液（不大于1000 CFU/ml），混合均勻，分別取上述混合溶液1 ml 注入 100 ml 含 1% 聚山梨酯 80 無菌pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混合均勻后全部濾過薄膜過濾器（濾器先用約 50 ml 的無菌 pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液潤濕），再用 pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分次沖洗，分別共用 320 ml/膜、560 ml/膜，按80 ml/次進行，沖洗完畢后，濾干濾膜，最后將濾干的濾膜輕輕貼于制備好的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng) 72 ～ 120 h，觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)。菌液組：用無菌氯化鈉溶液（0.9%）代替供試液，分別取 9 ml 和 1 ml 已制備好的 5 種菌液（同試驗組中菌液），混合均勻，其余同試驗組方法。供試品對照組：按試驗組方法，不加試驗菌，直接取制備好的供試液試驗，測定供試品菌數(shù)（本底菌）。稀釋劑對照組：取與供試液等量的稀釋劑代替供試液試驗，其余按試驗組方法進行。

1.2.4.3 加菌回收比值的計算公式

整個方法適用性試驗中，只有使試驗組加菌回收比值與稀釋劑對照組加菌回收比值均在 0.5 ～ 2 范圍內(nèi)[16]，整個試驗方法才能有效，否則需要調(diào)整方法重新試驗。

1.2.5 控制菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌）檢查方法的適用性試驗 丹皮酚軟膏作為以皮膚給藥為主的一種外用制劑，按照 2020 年版《中國藥典》四部通則 1107 的要求[16]，其控制菌主要檢查金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，因此針對該2 種菌進行方法適用性試驗。

1.2.5.1 供試液的制備 同“1.2.3”項下 1:10 供試液的制備。

1.2.5.2 試驗組 ①常規(guī)法：取 1:10 的供試液 10 ml 和金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌的菌懸液 1 ml（同 1.2.1.1 法制備，不大于 100 CFU/ml）接種至 100 ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置于 33 ℃培養(yǎng) 22 h，再取上述培養(yǎng)物 0.1 ml，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂（金黃色葡萄球菌）或溴化十六烷基三甲銨瓊脂（銅綠假單胞菌）平板上，33 ℃培養(yǎng) 22 ～ 70 h，觀察菌落生長特性。有可疑菌落時進行分離、純化和鑒定試驗，以確證是否為金黃色葡萄球菌或銅綠假單胞菌。②培養(yǎng)基稀釋法：取 1:10 的供試液 10 ml 和金黃色葡萄球菌的菌懸液 1 ml （同 1.2.1.1 法制備，不大于 100 CFU/ml）接種至 400 ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，置于 33 ℃培養(yǎng) 22 h，再取上述培養(yǎng)物 0.1 ml，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng) 22 ～ 70 h，觀察菌落生長特性。有可疑菌落時進行分離、分純和鑒定試驗，以確證是否為金黃色葡萄球菌。

1.2.5.3 供試品組 取供試液 10 ml，不加菌，其余按試驗組檢驗。

1.2.5.4 陽性對照組 不加供試液，其余按試驗組檢驗。

1.2.5.5 陰性對照組 取制備供試液的稀釋劑 10 ml 取代供試液，不加菌，其余同試驗組。

2 結(jié)果

2.1 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的適用性試驗結(jié)果

由于本品具有較強抑菌性，在采用平皿法（傾注法）對 1:10、1:20、1:50 供試液的需氧菌總數(shù)計數(shù)方法試驗中，雖然銅綠假單胞菌在 1:50 供試液試驗中加菌回收比值達到 0.5 ～ 2 范圍，但金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的試驗組加菌回收比值均為 0，因此不能采用平皿法（傾注法）進行本品需氧菌總數(shù)計數(shù)檢查。結(jié)果數(shù)據(jù)見表 2 ～ 4。

在對 1:10 供試液的需氧菌總數(shù)計數(shù)試驗時，采用薄膜過濾法（分別沖洗 320 ml/膜、560 ml/膜）。當(dāng)沖洗 320 ml/膜時，只有枯草芽孢桿菌與銅綠假單胞菌加菌回收比值均達到了 0.5 ～ 2 范圍，而當(dāng)沖洗 560 ml/膜時，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌的試驗組加菌回收比值均達到了 0.5 ～ 2 范圍，符合《中國藥典》（2020 年版）的規(guī)定，因此可以采用薄膜過濾法（沖洗 560 ml/膜）進行本品需氧菌總數(shù)計數(shù)檢查。結(jié)果數(shù)據(jù)見表5、表 6。

在采用平皿法（傾注法）對 1:10、1:20 供試液的霉菌和酵母菌總數(shù)的計數(shù)方法試驗中，白色念珠菌和黑曲霉在 1:20 供試液試驗中加菌回收比值達到 0.5 ～ 2 范圍，符合《中國藥典》（2020 年版）的規(guī)定，因此可以采用平皿法（傾注法）1:20供試液進行本品霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)檢查。結(jié)果數(shù)據(jù)見表 2、表 3。

表 3 1:20 供試液平皿傾注法測定試驗組結(jié)果

表 4 1:50 供試液平皿傾注法測定試驗組結(jié)果

2.2 控制菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌）檢查方法的適用性試驗結(jié)果

由于本品對金黃色葡萄球菌具有較強抑制性，在采用常規(guī)法對取 1:10 供試液 10 ml 時，加入 100 ml 增菌培養(yǎng)基的金黃色葡萄球菌檢查時，與陽性對照組比較菌的生長不好，因此調(diào)整試驗方法，改為采用培養(yǎng)基稀釋法（400 ml）對金黃色葡萄球菌進行控制菌檢查，結(jié)果達到了要求。而銅綠假單胞菌采用常規(guī)法即達到了試驗要求。所以，從表 7、表 8 可得出，金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法（400 ml）、銅綠假單胞菌采用常規(guī)法，陰性對照組、供試品組均未檢出試驗菌，陽性對照檢出試驗菌，試驗組也檢出試驗菌，該法對兩種控制菌檢查可行、有效。

表 5 1:10 供試液薄膜過濾法（沖洗 320 ml/膜）測定試驗組結(jié)果

表 6 1:10 供試液薄膜過濾法（沖洗 560 ml/膜）測定試驗組結(jié)果

表 7 金黃色葡萄球菌控制菌檢查試驗結(jié)果

注：“+”表示檢出金黃色葡萄球菌，“-”表示未檢出金黃色葡萄球菌。

Note: “+”was detected，“-”was not detected.

表 8 銅綠假單胞菌控制菌檢查試驗結(jié)果

注：“+”表示檢出銅綠假單胞菌，“-”表示未檢出銅綠假單胞菌。

Note: “+”was detected，“-”Nowas detected.

2.3 試驗結(jié)論

丹皮酚軟膏微生物限度檢查：取本品內(nèi)容物 10 g，加入 45 ℃含 1% 聚山梨酯 80 無菌 pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液至 100 ml，用勻漿儀充分混勻，靜置 10 min，取上清液作為 1:10 供試液，再稀釋為 1:20 供試液，備用。需氧菌總數(shù)采用薄膜過濾法（沖洗 560 ml/膜）測定，霉菌和酵母菌總數(shù)采用 1:20 稀釋供試品的平皿傾注法測定；控制菌中金黃色葡萄球菌采用稀釋法（400 ml）測定，銅綠假單胞菌采用常規(guī)法（100 ml）測定。

3 討論

從 2015 年起《中國藥典》就對微生物限度檢查方法適用性中試驗接種和稀釋步驟進行了調(diào)整，需將供試液和試驗菌混勻后，再加入到平皿中或者進行薄膜過濾的操作，這樣更能真實地反映藥品被微生物污染的情況，更加科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)[21]。

通過此次試驗，在需氧菌總數(shù)計數(shù)試驗中，丹皮酚軟膏對三種典型代表陽性菌（枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌）都有明顯抑制作用，特別是對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制更為強烈；而在霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)試驗中，僅僅是對白色念珠菌有一定的抑菌作用?？梢娫囼炛斜酒穼Φ湫途淖饔门c其臨床應(yīng)用于皮膚類細菌、真菌感染治療具有一致性[22]。

此次試驗中所采用薄膜過濾法涉及的沖洗次數(shù)，結(jié)果顯示選擇沖洗量為 80 ml/次比 100 ml/次的效果更好，即當(dāng)沖洗次數(shù)增加時，特別是金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收比值有顯著提升，可見其對樣品抑菌性消除有很好的促進作用，因此最終選擇沖洗 7 次[20]。

根據(jù) 2020 年版《中國藥典》新要求與實際工作經(jīng)驗，作者認為在整個試驗中還需要充分考慮菌液制備時間與供試液制備后加入培養(yǎng)基的時間，既要符合要求，也要考慮試驗組中供試液和菌液的混合接觸時間不宜太短，否則就會影響后期方法重現(xiàn)性，甚至出現(xiàn)方法的重大偏差，因此需要特別關(guān)注與重視。

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Study on the applicability of microbial limit test method for paeonol ointment

XIA Xin-sheng, CHEN Kou-bao, LYU Xiao-yan

Author Affiliation: Department of Microbiology, Hefei Food and Drug Inspection Center, Anhui 230088, China

We aim to study the applicability of microbial limit test method of paeonol ointment according to the latest regulations of Chinese Pharmacopoeia (2020 edition), was studied, and establish the microbial limit test method of paeonol ointment.Five representative bacteria were tested, including,,,and. The plate pouring method of 1:10, 1:20 and 1:50 test solution and the membrane filtration method of 1:10 test solution rinsing 320 ml/membrane and 560 ml/membrane were used to screen the bacteriostatic activity of eliminating samples.Using membrane filtration method (flushing 560 ml/membrane), the recovery ratio ofandmet the requirements. After dilution (1:20), the recovery ratio ofalso met the requirements.In the microbial limit test of paeonol ointment, the total number of aerobic bacteria can be determined by membrane filtration method (flushing 560 ml/film); the total number of mold and yeast can be determined by dilution (1:20) pouring method;can be determined by dilution method (400 ml) andcan be determined by conventional method. All results meet the requirements.

paeonol ointment; microbial limit test; applicability study; membrane filtration

CHEN Kou-bao, Email: chyjcqb@163.com

陳扣寶，Email：chyjcqb@163.com

2021-02-01

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.007