基于石蒜屬轉(zhuǎn)錄組序列的SSR分子標(biāo)記開發(fā)應(yīng)用

李青竹 蔡友銘 張永春 許俊旭 楊柳燕 孫 翊

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所/上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室，上海 201106)

石蒜屬(Lycorisspp.)是原產(chǎn)我國的藥用和觀賞植物，其花色、花型多變，觀賞性強[1－3]，且鱗莖中含有石蒜堿、加蘭他敏等多種生物堿[2，4－6]，具有治療重癥肌無力、老年癡呆癥(阿爾茨海默癥)，抗腫瘤和抗癌等重要功能，經(jīng)濟(jì)價值極高[7－9]。石蒜屬植物不僅種內(nèi)和種間的變異多，而且部分二倍體材料種間雜交親和性高，雜交后代表型多變，因此產(chǎn)生了豐富多樣的石蒜屬種質(zhì)資源[10－12]。石蒜屬植物現(xiàn)有的分類依據(jù)主要包括花部性狀(如花色、花型、雄蕊相對于花被的長度)、出葉類型(春出葉、秋出葉)和鱗莖形狀(卵形、球形)[13]，但僅憑外觀對資源進(jìn)行鑒定會出現(xiàn)混淆和無法判斷的情況，且雜交后代從種子生長到開花球的時間較長，一般為4～5年，因此生產(chǎn)上需要對石蒜屬植物進(jìn)行早期鑒定。

目前石蒜屬中常用于資源鑒定的DNA 分子標(biāo)記主要有隨機擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA，RAPD)[14－15]、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified Fragment length polymorphism，AFLP)[16]、簡單重復(fù)序列區(qū)間( inter-simple sequence repeat，ISSR)[14]、簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)[4，17]和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)[15]等，RAPD 和AFLP 等傳統(tǒng)的標(biāo)記技術(shù)在多態(tài)性信息含量及技術(shù)重復(fù)性上有所缺陷。SSR 標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于生物學(xué)研究與鑒定中，例如石蒜等物種的遺傳圖譜創(chuàng)建[17－18]、雜交種類鑒定[19]、遺傳多樣性研究[20－23]等。從來源進(jìn)行分析，SSR 標(biāo)記包括以下兩大類:一是在基因組基礎(chǔ)上實現(xiàn)的SSR 標(biāo)記；二是在轉(zhuǎn)錄組表達(dá)基礎(chǔ)上實現(xiàn)的序列標(biāo)簽簡單重復(fù)序列標(biāo)記。前者在標(biāo)記時需先創(chuàng)建DNA 文庫，流程復(fù)雜，成本較高；基于轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)序列標(biāo)簽SSR 標(biāo)記，具有不同物種間通用性高、與功能基因連鎖緊密的優(yōu)勢[24－25]，在換錦花(Lycons sprengeri)[26]、胡枝子(Lespedoza bicolor)[27]、大麥(Hordeum vulgare)[28]、山桐子(Idesia polycorpa)[29]、玉米(Zea mays)[30]、苷蔗(Saccharus officinarum)[31]等多種植物中已得到開發(fā)利用。將熒光標(biāo)記應(yīng)用于SSR 分子標(biāo)記系統(tǒng)，利用毛細(xì)管電泳技術(shù)獲取譜帶信息，是對現(xiàn)有SSR 技術(shù)體系的優(yōu)化完善，相比銀染檢測和瓊脂糖凝聚檢測，自動熒光檢測具有高通量、自動化操作的特點，針對種類數(shù)量繁多的植物分類鑒定，無論是速度還是效果都更佳[32－34]。石蒜屬基于轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)序列標(biāo)簽SSR 標(biāo)記開發(fā)滯后，目前已報道換錦花利用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測的研究[26]，但標(biāo)記數(shù)量不足，限制了石蒜屬的資源鑒定和分子遺傳學(xué)研究。因此，迫切需要獲取更多有效的SSR 標(biāo)記。

本研究利用Illumina NextSeqTM500 測序平臺對石蒜、忽地笑、中國石蒜、長筒石蒜、換錦花、香石蒜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析，開發(fā)SSR 分子標(biāo)記，構(gòu)建資源的指紋圖譜，并對雜交后代進(jìn)行鑒定，以期為石蒜屬資源的分類鑒定和品種選育等工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

石蒜屬(Lycorisspp.)種質(zhì)資源共17 份(表1)，取自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院石蒜種質(zhì)資源圃(31.23°N，121.10°E)，2018年10月至2019年3月，采集每份種質(zhì)的新鮮嫩葉，立即液氮冷凍后，－70℃冰箱保存，用于后續(xù)分子標(biāo)記驗證。2019年3月，采集處于營養(yǎng)生長期的石蒜、忽地笑、中國石蒜、長筒石蒜、換錦花、香石蒜6 個種質(zhì)的植株，去掉根和葉片后取鱗莖，液氮冷凍30 min，放入－70℃冰箱保存，用于轉(zhuǎn)錄組測序。設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

表1 供試石蒜屬資源的基本情況Table 1 The basic information of Lycoris spp.

表1(續(xù))

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA 的提取與轉(zhuǎn)錄組測序 采用RNA 提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)提取RNA。采用Nanodrop 核酸檢測儀(美國Thermo Scientific 公司)及瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA 的質(zhì)量。將RNA 送上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。cDNA 文庫構(gòu)建利用TruSeq RNA Sample Preparation Kits v2(Illumina)。采用Illumina NextSeq500 系統(tǒng)對cDNA 文庫進(jìn)行雙末端測序。篩選測得的初始數(shù)據(jù)，并對整個序列進(jìn)行拼接處理，即為轉(zhuǎn)錄本序列，應(yīng)用2014 版Trinity 程序完成拼接和de novo組裝，得到轉(zhuǎn)錄組測序文檔。

1.2.2 序列注釋功能分類和生物學(xué)通路分析 基于BLAST 系統(tǒng)將轉(zhuǎn)錄本序列和RefSeq、NR 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，將與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)重合的轉(zhuǎn)錄本序列歸為一類，并設(shè)長度最大的轉(zhuǎn)錄本為Unigene，而接下來的GO、eggNOG 分析(E<10－5)均是在Unigene 基礎(chǔ)上實現(xiàn)的。

1.2.3 SSR 位點預(yù)測和引物設(shè)計 拼接獲得Unigene，并查找SSR 簡單重復(fù)序列，利用MISA 程序搜尋SSR 位點，對于1～6 核苷酸，最低的重復(fù)次數(shù)是10、6、5、5、5、5，在最少重復(fù)次數(shù)上，單核苷酸重復(fù)是10 次，二至三核苷酸重復(fù)是6 次，四至六核苷酸重復(fù)是5 次。通過與Primer 3.0 結(jié)合，對SSR 引物實行批量設(shè)計，擴(kuò)增片段的長度是80～300 bp，每個SSR 位點設(shè)計3 對引物，隨機選取合成200 對SSR 引物(生工生物工程上海股份有限公司)，用于引物的通用性和多態(tài)性篩選，最后選擇擴(kuò)增效果好的8 對引物(表2)，分別利用六氯－6－甲基熒光素(hexachloro fluorescein，HEX)、6－羧基熒光素(6-carboxy-fluorescein，F(xiàn)AM)熒光標(biāo)記，合成熒光標(biāo)記引物(生工生物工程上海股份有限公司)，擴(kuò)增后得到的引物用于后續(xù)毛細(xì)管電泳檢測。

表2 8 對SSR 引物信息Table 2 Information of eight SSR primers

1.2.4 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增程序及毛細(xì)管電泳檢測 采用德國QIAGEN 公司試劑盒提取基因組DNA，采用1%瓊脂糖電泳與NaroDrop 2000 微量紫外分光光度計(美國Thermo scientific)檢測DNA 的濃度與質(zhì)量，將DNA 的濃度稀釋到25 ng·μL－1，并保存于－20℃冰箱。將提取的DNA 與熒光標(biāo)記引物對進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其反應(yīng)體系為25 μL，包括:基因組DNA 1 μL，10 mmol·L－1dNTP 0.5 μL，3.2 pmol·L－1正、反向引物各0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol·L－1MgCl22 μL，5 U·μL－1Taq 酶0.2 μL，加ddH2O 補足25 μL。PCR 程序:95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，20 個循環(huán)；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，10 個循環(huán)，72℃延伸6 min，4℃保存，PCR 產(chǎn)物送生工生物工程上海股份有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(3730XL 型儀器，美國ABI 公司)，利用Cervus 3.0 軟件計算SSR 引物的多態(tài)性信息含量和多態(tài)性位點數(shù)。

1.2.5 石蒜雜交苗培養(yǎng) 石蒜屬資源的雜交采用常規(guī)授粉方式，選擇花被片未展開且花瓣露色的花朵，用酒精消毒后用鑷子剝開花被片，小心去除花藥，不傷雌蕊，去雄后分別給母本套袋，待花被展開，雌蕊柱頭分泌較多粘液時，進(jìn)行授粉。采集干燥且散開的花粉，均勻涂抹在柱頭上，授粉后套袋，結(jié)實后收取種子，隨采隨播，常規(guī)管理，待長出3 片葉子后，取嫩葉立即放入液氮中30 min，然后放入－70℃冰箱保存，用于雜種真實性鑒定。隨機選擇共50 棵苗進(jìn)行檢測，其中1～15為中國石蒜(♀)和換錦花(♂)的雜交F1 代，16～30為換錦花(♀)和中國石蒜(♂)的雜交F1 代，31～40為換錦花(♀)和忽地笑(♂)的雜交F1 代，41～46 為換錦花(♀)和黃長筒石蒜(♂)的雜交F1 代，47 為換錦花親本自交苗，48 為中國石蒜親本自交苗，49 為忽地笑親本自交苗，50 為黃長筒石蒜親本自交苗。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA-Seq 測序及質(zhì)量評估

利用石蒜屬6 個種的鱗莖提取RNA，借助紫外分光光度計進(jìn)行檢測，A260/A280數(shù)值范圍1.90～1.98，表示RNA 樣本質(zhì)量良好，滿足測序的要求，能夠用來檢測RNA-Seq 序列。總共獲得264 325 602 條reads，總測序長度達(dá)到39 695 938 848(39.69 G)堿基。堿基質(zhì)量值Q20 堿基識別準(zhǔn)確率超過95.59%，而Q30(堿基識別準(zhǔn)確率在99.9%以上)大于90.02%，說明本研究測序質(zhì)量良好，其數(shù)據(jù)能夠用于開展進(jìn)一步分析。

2.2 轉(zhuǎn)錄組組裝與分析

通過過濾，將低質(zhì)量、帶接頭的數(shù)據(jù)剔除，共得到260 567 150 個干凈數(shù)據(jù)(clean read)，長度為38 204 141 866 bp，clean reads 的比例達(dá)98.05%以上，所有測序原始數(shù)據(jù)上傳 NCBI 數(shù)據(jù)庫，石蒜(登錄號PRJNA637448)、換錦花(登錄號PRJNA637456)、中國石蒜(登錄號PRJNA637473)、長筒石蒜(登錄號PRJNA637832)、忽地笑(登錄號PRJNA637967)和香石蒜(登錄號PRJNA639315)。

采用軟件Trinity 分析上述clean reads，并開展de novo組裝，獲得1 035 562 條片段重疊群(contigs)，接著再次組裝得到404 481 條非重復(fù)序列基因(Unigenes)，N50 長度是425 bp，從長至短將所有序列依次排列，并按序相加，當(dāng)長度達(dá)到總長度50%，則最后一條序列其長度即N50，在100 ～ 800 bp 范圍，Unigene 與轉(zhuǎn)錄本(Transcript)的數(shù)量相對較多，且二者具有相似分布，隨著序列長度增加，則序列的數(shù)量相應(yīng)減少，詳見圖1。

2.3 Unigene 基因功能注釋

表3 列出了5 個數(shù)據(jù)庫的條目占比，占比最多的為NR 和eggNOG，分別占比31.85%、30.24%，運用Nr進(jìn)行比對，對比閾值為E-value 小于10－5，注釋基因中95.78%都在該數(shù)據(jù)庫獲得注釋。41.72%以上序列具有較高同源性，小于1.0 e－30，以及58.28%處于1.0 e－30～1.0 e－5(圖2)。對比NR 庫，得到本物種和近緣物種在基因序列上具有相似性的信息，如圖3 所示，物種基因序列相似度最高的為油棕(Elaeis guineensis)。

表3 Unigenes 的注釋統(tǒng)計Table 3 The statistics analysis of the Unigenes annotation

2.4 Unigenes 功能分類

2.4.1 GO 分類 GO 分類法將基因歸類為生物學(xué)過程、細(xì)胞組分和分子功能等類別，并利用標(biāo)準(zhǔn)詞匯來描述其屬性。把GO 的注釋結(jié)果對應(yīng)至GOTerm，統(tǒng)計在第二級分類中在Unigenes 上的注釋條目(圖4)，發(fā)現(xiàn)233 260 個序列與51 560 個Unigenes 匹配，有88 122個序列在生物學(xué)過程中發(fā)揮作用，占比達(dá)到37.78%，其中參與最多的為單器官過程和細(xì)胞過程及代謝過程，這可能預(yù)示著器官正經(jīng)歷快速的生長和代謝過程；參與細(xì)胞組分的序列有86 444 個，占序列總數(shù)37.06%，最多參與的序列類別是膜、細(xì)胞及細(xì)胞部分；參與分子功能的序列有58 694 個，占序列總數(shù)的25.16%，結(jié)合、催化活性和轉(zhuǎn)運活性是參與序列最多的3 個分類。以上序列均能夠細(xì)分至67 個功能群。而且不少序列均可同時被細(xì)分至不同GoTerm，并參與不同的調(diào)試過程，所以在數(shù)目上，GoTerm 超過Unigene。

2.4.2 eggNOG 分類 通過eggNOG 分析，推測出每個Unigene 編碼其蛋白的功能。使用BLAST 軟件對Unigene 進(jìn)行eggNOG 注釋，其功能的判別規(guī)則是Evalue<1.0e－5，122 317 個被注釋至26 個eggNOG。除了功能未知(function unknown)的序列之外，注釋到Unigenes 最多的5 個eggNOG 如表4 所示。

表4 Unigenes 的部分eggNOG 分類Table 4 Part of the eggNOG classification of Unigenes

2.5 SSR 數(shù)據(jù)分析

SSR 轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)重復(fù)具有豐富類型，從單核苷酸到六核苷酸均有各種重復(fù)基元。單核苷酸最低重復(fù)數(shù)小于10 次時不計算，二核苷酸最低重復(fù)數(shù)小于6 次時不計數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在404 481 條Unigene 中共檢測到59 612 個SSR 位點，其中8 645 條Unigene 包括1個以上的SSR 位點。SSR 的重復(fù)單元主要是1～3 個核苷酸(表5)，其最多重復(fù)的為單核苷酸，占比62.88%，其次為二核苷酸、三核苷酸，分別占比20.06%、14.66%，而四核苷酸及其以上的重復(fù)單元較少。堿基重復(fù)次數(shù)分布為5～90 次，其中，重復(fù)次數(shù)最多的在5～10 次之間，有33 508 個，約占56.21%；11～20 次之間的有23 304 個，約占39.09%；大于20 次的最少，有2 800 個，約占4.70%(表5)。在轉(zhuǎn)錄組的SSR 位點上，數(shù)量相對較多的是單核苷酸、二核苷酸及三核苷酸，其中單核苷酸中重復(fù)最多的基元種類為A/T(35 318； 59.25%)；二核苷酸最多的為AG/CT(5 743； 9.63%)；三核苷酸最多的為AAG/CTT(2 242；3.76%)；四核苷酸中最多的為AAAT/ATTT(766；1.28%)，五、六核苷酸基元種類所占比例較小(表6)。

表5 SSR 的數(shù)量和頻率分布Table 5 The type，number and frequency of SSR in Lycoris spp.

表6 SSR 重復(fù)基元類型及數(shù)量Table 6 Type and number of repeat motif in SSRs

2.6 毛細(xì)管電泳結(jié)果

使用微衛(wèi)星識別工具(microsatellite identification tool，MISA)獲得SSR 位點的信息，并與Primer3.0 相結(jié)合，實現(xiàn)對SSR 引物的批量設(shè)計。將擴(kuò)增效果好、有清晰條帶的引物，合成熒光標(biāo)記SSR 引物，在不同種間進(jìn)行多態(tài)性分析。采用8 對SSR 熒光引物，對石蒜屬17 個種(變種)的樣品進(jìn)行分析，優(yōu)化后的退火溫度和擴(kuò)增片段見表7。引物QZ157 擴(kuò)增片段變化范圍最大，達(dá)到248～298 bp，而引物QZ177 的擴(kuò)增片段變化范圍最小，為269～270 bp。8 對引物在17 個種(變種)擴(kuò)增的多態(tài)位點為60 個，這些引物的多態(tài)條帶在數(shù)量上存在較大差異，變化范圍為2～15，每對引物平均擴(kuò)增7.50 個片段，引物QZ155 和QZ209 的多態(tài)性較高，分別獲得15 個和14 個多態(tài)位點。17 個種(變種)的8 個SSR 位點的多態(tài)性信息含量的變化范圍為0.148 0～0.940 8，平均值分別為0.593 0，其中QZ209 多態(tài)性信息含量最高，QZ207 最低。

表6(續(xù))

表7 8 對SSR 引物位點多態(tài)性和遺傳多樣性分析Table 7 Polymorphism and genetic diversity of 8 SSR primers

圖5 展示了3 個石蒜種經(jīng)QZ209 引物擴(kuò)增的檢測結(jié)果，換錦花在215 bp 處為單峰擴(kuò)增片段，擴(kuò)增DNA產(chǎn)物的相對數(shù)量為3 064；黃長筒石蒜在221 bp 和224 bp 處有雙峰擴(kuò)增片段，擴(kuò)增DNA 產(chǎn)物的相對數(shù)量分別為1 504 和1 638；石蒜在206、212 和218 bp 為三峰擴(kuò)增片段，擴(kuò)增DNA 產(chǎn)物的相對數(shù)量為2 206、1 020和840。

2.7 17 個石蒜屬資源的指紋圖譜分析

通過篩選得到8 對SSR 引物，將其用于17 個石蒜種的擴(kuò)增，得到不同材料在各個位點其等位基因片段大小，如表8 所示。結(jié)合8 對核心引物的擴(kuò)增結(jié)果其峰圖，得到條帶大小，引物可以有效區(qū)分各個種，最少可用1 對引物(QZ209)就可以將17 個種(變種)完全區(qū)分。17 個石蒜種(變種)其SSR 指紋圖譜存在一定差異，能夠用于特定圖譜，為鑒別種質(zhì)提供參考。

表8 17 個石蒜種(變種)的指紋圖譜Table 8 Fingerprints of 17 Lycoris spp. resources

2.8 雜交F1 代真實性鑒定

采用篩選出的特異性引物QZ209 對46 株雜交后代和4 株親本的自交后代進(jìn)行鑒定，46 株雜交后代中鑒定出44 株雜交植株，2 株假雜交植株，真實雜種率為95.65%。除了2 株假雜交植株(11 和18)只有母本的位點外，其余44 株真實雜交后代中均表現(xiàn)出雙親互補的雜合位點(表9)，其中有代表性的7 個雜交后代采用QZ209 引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的毛細(xì)管電泳檢測如圖6 所示。4 株親本的自交后代采用QZ209 引物中的毛細(xì)管電泳檢測圖見圖7，帶型也與預(yù)期相符合，因此所開發(fā)的引物能夠用于雜交后代的早期鑒定。

表9 基于SSR 分子標(biāo)記的后代鑒定表Table 9 Hybrids identification table based on SSR marker

表9(續(xù))

3 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)，長筒石蒜、石蒜、換錦花、香石蒜、忽地笑和中國石蒜這6 個種是石蒜屬內(nèi)觀賞性、適應(yīng)性和藥用價值綜合評價較好的種[35]。本研究利用Illumina NextSeqTM500 測序平臺對這6 個石蒜屬進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)據(jù)分析，總測序長度達(dá)到39.69 G 堿基，Q30 (堿基識別準(zhǔn)確率在99.9% 以上) 大于90.02%，得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)( clean reads) 有260 567 150條，組裝后獲得404 481 條Unigenes，并將香石蒜的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫，這些數(shù)據(jù)為石蒜屬不同種的基因功能研究提供了豐富的序列信息。

石蒜屬植物基因組較大、雜合度高、測序成本高，目前鮮見其基因組測序的相關(guān)報道[36－38]。轉(zhuǎn)錄組測序能夠快速、準(zhǔn)確地獲得物種全轉(zhuǎn)錄本序列信息，不依賴于物種的全基因組信息，且價格低廉，在不同物種的分子標(biāo)記開發(fā)中已被廣泛應(yīng)用[24－31]。本研究從石蒜屬6 個種的轉(zhuǎn)錄組測序得到的404 481 個Unigenes 中得到59 612 個SSR 位點數(shù)，位點的發(fā)生頻率為14.74%，低于換錦花(18.59%)[26]，但高于忽地笑(6.90%)[39]，單核苷酸重復(fù)最多的基元種類是A/T，而二核苷酸重復(fù)最多的是AG/CT，三核苷酸重復(fù)最多的為AAG/CTT，四核苷酸重復(fù)類型中最多的是AAAT/ATTT，這與在忽地笑的轉(zhuǎn)錄組測序中發(fā)現(xiàn)的三核苷酸重復(fù)占例最高的結(jié)論有較大不同[39]，也與在換錦花轉(zhuǎn)錄組中不同核苷酸重復(fù)類型有區(qū)別[26]，表明石蒜屬不同種存在明顯差異，采用通用SSR 引物對不同種擴(kuò)增，可對其進(jìn)行有效區(qū)分，這將為以后的分子育種奠定基礎(chǔ)。

有研究利用長筒石蒜的表達(dá)序列標(biāo)簽(express sequence tag，EST)表達(dá)序列標(biāo)簽，開發(fā)出16 對具有多態(tài)性的SSR 標(biāo)記[40]；從石蒜中開發(fā)的10 對SSR 標(biāo)記，也可以用于區(qū)分石蒜屬的換錦花、安徽石蒜、乳白石蒜、長筒石蒜和中國石蒜[41]，但上述引物無法用于石蒜的分析鑒定[42]，對換錦花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，選擇出的分子標(biāo)記在石蒜屬7 個種中具有通用性，可用于石蒜屬資源的遺傳多樣性分析[26]。本研究設(shè)計的8對SSR 熒光引物，在石蒜屬17 個種(變種)中均具有多態(tài)性，共擴(kuò)增出60 個多態(tài)位點，引物多態(tài)率高于換錦花EST- SSR (89.09%)[26]，引物QZ209 的多態(tài)性較高，多態(tài)性信息含量為0.940 8，利用熒光標(biāo)記結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測，成功構(gòu)建了不同資源的指紋圖譜，并檢測了46 個雜交后代的真實性，這表明本研究開發(fā)的引物多態(tài)性豐富，應(yīng)用價值較高。前人研究發(fā)現(xiàn)，石蒜屬資源類型豐富，屬內(nèi)同一種的不同種群之間也存在豐富的多態(tài)性[4，14，17，26]，因此后續(xù)研究將繼續(xù)進(jìn)行不同SSR 標(biāo)記的開發(fā)驗證。

4 結(jié)論

本研究基于石蒜屬6 個種的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，將8 對SSR 熒光標(biāo)記與毛細(xì)管電泳發(fā)光檢測系統(tǒng)相結(jié)合，建立了石蒜屬的17 份資源其指紋圖譜，并對雜交后代的真實性進(jìn)行了檢測。8 對熒光引物共檢測到60個多態(tài)位點，多態(tài)位點數(shù)平均為7.50，多態(tài)性信息含量平均為0.593 0。其中QZ209 的多態(tài)位點數(shù)達(dá)14個，多態(tài)性信息含量為0.940 8，該引物可將17 份資源材料完全區(qū)分，還可以用于對雜交后代真實性進(jìn)行早期檢測，是優(yōu)良的SSR 分子標(biāo)記，可以用于石蒜屬資源分類鑒定。