溶磷復(fù)合菌劑篩選及其對(duì)山核桃幼苗的生物學(xué)效應(yīng)

蕭利珠 鄭文秀 陳銘炯 褚鑫健 李財(cái)運(yùn) 倪鐘濤 王正加 周 湘

(浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 311300)

山核桃(Carya cathayensisSarg.) 是胡桃科(Judlandaceae)山核桃屬(CaryaNutt.)植物，是我國(guó)特有的一種木本油料和干果經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[1]。山核桃主要分布于浙皖交界的天目山區(qū)，該地區(qū)的石灰性土壤會(huì)引起有效磷的流失，從而導(dǎo)致山核桃植株果實(shí)發(fā)育受阻，影響品質(zhì)與產(chǎn)量[2]。施加磷肥可短期補(bǔ)充有效磷，但會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)，不利于可持續(xù)經(jīng)營(yíng)[3－4]，且磷素沉降流失不僅會(huì)引發(fā)環(huán)境污染，還可能危害人體健康[5]。因此，如何有效利用土壤中難溶的磷素，更好地促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，是目前山核桃栽培中亟需解決的問(wèn)題。有報(bào)道指出，土壤中存在廣泛的溶磷微生物，如假單胞菌(Pseudomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)、曲霉(Aspergillus)和青霉(Penicillium)屬[6－7]等。這些微生物制成的菌劑可顯著促進(jìn)草本植物的生長(zhǎng)，如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)對(duì)玉米(Zea maysL.)[8]具有增產(chǎn)作用，某些假單胞菌和芽孢桿菌菌株對(duì)福鼎大白茶(Camellia sinensis.cv.Fuding-dabaicha)[9]、楓香(Liquidambar formosanaHance)[10]等均有促生作用。另有報(bào)道指出，土壤溶磷菌與其他生態(tài)功能菌如固氮菌的互作可顯著提高溶磷效率，有利于植株苗高、地徑、生物量等指標(biāo)的增長(zhǎng)[11]，說(shuō)明溶磷菌與固氮菌的互作關(guān)系對(duì)植物具有增效促生作用?；诖?，本研究將在山核桃根際土壤中分離獲得3 種溶磷菌株和4 種固氮菌株，按不同比例配制成4 種復(fù)合菌劑，接種于山核桃根部土壤，通過(guò)測(cè)定山核桃幼苗生長(zhǎng)和生理生化等指標(biāo)，比較菌劑對(duì)山核桃幼苗的影響，篩選出對(duì)山核桃具有良好促生效果的菌劑，以期為山核桃的栽培提質(zhì)增效和可持續(xù)經(jīng)營(yíng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2019年6月9日在浙江農(nóng)林大學(xué)果木園(30°15′N(xiāo)，119°43′E)簡(jiǎn)易大棚內(nèi)進(jìn)行。選用浙江省杭州臨安區(qū)山核桃試驗(yàn)地的根際土，篩選溶磷菌株和固氮菌株，制備混合菌劑；山核桃種子來(lái)源于果木園15年生的山核桃樹(shù)，種子催芽播種后于溫室大棚內(nèi)培養(yǎng)，待幼苗生長(zhǎng)半年后收獲得到半年生山核桃幼苗45株。將幼苗移栽到大小為50 cm×40 cm×295 cm(外口直徑×內(nèi)口直徑×高)的塑料花盆內(nèi)(每盆3 株)，緩苗一個(gè)月后用于接種試驗(yàn)。所用土壤均為低磷土，有效磷含量為4.73 mg·kg－1，pH 值5.5。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 菌種分離與鑒定 稱取10.0 g 山核桃根際土壤，分離純化各菌株借鑒孫亞凱[12]的方法，再將純化后的各菌株利用通用引物27F 和1492R 擴(kuò)增16SrDNA序列，經(jīng)與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)序列同源性比對(duì)確定其種屬。同時(shí)，將菌株用甘油管保藏于超低溫冰箱。

1.2.2 復(fù)合菌劑篩選與配制 將分離的溶磷菌株搖菌培養(yǎng)后，各取1 μL 菌液滴加在蒙金娜無(wú)磷培養(yǎng)基(Pikovskaya，PVK)上，28℃條件下培養(yǎng)3 d 后比較溶磷圈大小。選取3 株溶磷圈較大的溶磷菌株:果膠桿菌Pectobacterium cypripedii(R7)、伯克霍爾德氏菌Burkholderiasp.(R8)和腸桿菌Enterobactersp.(R9)與4 株自生固氮菌:解聚糖類(lèi)芽孢桿菌Paenibacillus glycanilyticus(G2)、葡萄球菌Staphylococcussp.(G3)、假單胞菌Pseudomonassp.(G4)、芽孢桿菌Bacillussp.(G5)進(jìn)行兩兩組合(12 組)，2 種菌株分別等量(1 μL∶1 μL＝v ∶v)滴加在PVK 平板同一處，培養(yǎng)3 d 后量取溶磷圈直徑。試驗(yàn)重復(fù)3 次。選取溶磷圈直徑最大的4 組菌劑進(jìn)行溶磷量的定量分析。在5 mL PVK 液體培養(yǎng)基中各加入1 μL 的溶磷菌和固氮菌，28℃、125 r·min－1搖床培養(yǎng)5 d 后通過(guò)鉬銻抗比色法定量分析組合菌劑的溶磷含量[13]。

采用韓華雯等[14]的方法，將各單菌于28℃、125 r·min－1搖床培養(yǎng)3～5 d，再用無(wú)菌水懸浮制成菌懸液(OD600＝0.5)，稀釋涂板測(cè)定活菌量，確保每毫升活菌量≥2×108個(gè)。依據(jù)組合按1 ∶1的濃度制備4種混合菌劑:R7G5(果膠桿菌與副伯克霍爾德菌)、R8G4(伯克霍爾德氏菌與假單胞菌)、R8G5(伯克霍爾德氏菌與副伯克霍爾德菌)和R9G4(腸桿菌與假單胞菌)。

1.2.3 復(fù)合菌劑接種山核桃幼苗 2019年7月25日與8月25日進(jìn)行2 次相同的接種試驗(yàn)，以定植山核桃幼苗根系菌種。在山核桃幼苗根系附近選取4 個(gè)注射點(diǎn)，每點(diǎn)注射復(fù)合菌劑7.5 mL。山核桃試驗(yàn)為4 種復(fù)合菌劑處理(R7G5、R8G4、R8G5、R9G4)和對(duì)照處理(CK，無(wú)菌水)，每個(gè)處理9 株苗。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

分別于2019年7月25日(S1)、8月12日(S2)、8月30日(S3)、9月17日(S4)4 個(gè)時(shí)期測(cè)量生長(zhǎng)指標(biāo)，用卷尺和游標(biāo)卡尺測(cè)定每株的苗長(zhǎng)、地徑。后三期(S2、S3、S4)測(cè)量完后，分別減去S1 期的測(cè)量值，得到增量變化。

2019年9月16日，利用LI－6800 光合儀(美國(guó)Li-COR 公司)測(cè)定不同處理下全部植株頂端第3 片成熟葉片的光合參數(shù)。2019年9月17日，取植株頂端第3 和第4 片成熟葉片，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[15]，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定[16]，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用MDA測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所有限公司)的TBA法測(cè)定。2019年9月18日，將植株連根取出、洗凈，用EXPRESSION 1680 平板全彩影像掃描儀(Seiko Epson Corp，日本)進(jìn)行根系圖像掃描，采用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)(Regent Instruments Inc.，加拿大)分析根系形態(tài)指標(biāo)[17]；隨后將整株植株于105℃殺青30 min、80℃烘干至恒重后測(cè)量干重[18]，并采用鉬銻抗比色法測(cè)定植物全磷含量[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0 軟件分析數(shù)據(jù)，采用Excel 2007軟件作表，運(yùn)用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與復(fù)合菌劑篩選

從山核桃林區(qū)土樣中通過(guò)分離、純化、篩選后，得到3 株溶磷細(xì)菌(R7、R8、R9)和4 株固氮菌(G2、G3、G4、G5)，后續(xù)將溶磷菌與固氮菌進(jìn)行兩兩組合(表1)，根據(jù)溶磷圈直徑選出相對(duì)高于CK 中單菌溶磷效果的菌劑組合(R7G5、R8G4、R8G5、R9G4)。通過(guò)鉬銻抗比色法定量測(cè)定組合菌液中的溶磷量，其中R8G5、R9G4 組合的溶磷量顯著高于R7G5、R8G4(圖1)。

表1 不同復(fù)合菌劑的溶磷效果(溶磷圈直徑mm)Table 1 The phosphate-dissolving effects (diameters，mm) of mixing microbial inoculums

2.2 復(fù)合菌劑處理對(duì)地徑、苗長(zhǎng)增量的影響

由圖2 可知，5 個(gè)處理下山核桃幼苗的地徑、苗長(zhǎng)增量均隨著生育期遞進(jìn)呈穩(wěn)步上升趨勢(shì)；每個(gè)時(shí)期各處理間總體無(wú)顯著差異。S4 時(shí)期各處理增量達(dá)到最大值，苗長(zhǎng)增量表現(xiàn)為R7G5(9.67 cm)>R8G4(8.72 cm)>R9G4(8.48 cm)>R8G5(8.06 cm)>CK(6.01 cm)；地徑增量表現(xiàn)為R9G4、R8G5、R8G4、R7G5 較CK 分別增加了36.36%、21.21%、21.21%、6.06%。

2.3 復(fù)合菌劑處理對(duì)根系指標(biāo)的影響

由表2 和圖3 可知，復(fù)合菌劑處理山核桃幼苗的各項(xiàng)根系指標(biāo)較CK 有明顯促進(jìn)效果，其中均以R8G5的促進(jìn)效果最佳，根長(zhǎng)、根表面積、根體積、總根投影面積、根尖數(shù)以及分支數(shù)較CK 分別顯著增加了105.53%、 89.07%、 72.82%、 89.08%、 145.56% 與88.81%；另外，R8G5 的根長(zhǎng)與根表面積均顯著高于R8G4 與R9G4。

表2 復(fù)合菌劑處理對(duì)山核桃根系指標(biāo)的影響Table 2 Effects of mixing microbial inoculums treatments on C. cathayensis root index

2.4 復(fù)合菌劑處理對(duì)植株生物量的影響

由表3 可知，復(fù)合菌劑處理對(duì)地上部、地下部及總生物量均有促進(jìn)效果。其中R8G5、R7G5 的地下部和總生物量均較CK 顯著增加，R8G5 分別增加了87.04%和52.94%，R7G5 分別增加了73.33% 和47.36%。

表3 復(fù)合菌劑處理對(duì)植株地上、地下部分以及總生物量的影響Table 3 Effects of mixing microbial inoculums treatments on aboveground and underground parts and biomass

2.5 復(fù)合菌劑處理對(duì)全磷含量的影響

由圖4 可知，復(fù)合菌劑處理植株的全磷含量均顯著高于CK，R9G4、R8G5、R8G4、R7G5 分別較CK 顯著增加了58.16%、55.23%、46.28%、43.09%。

2.6 復(fù)合菌劑處理對(duì)光合參數(shù)指標(biāo)的影響

由表4 可知，R9G4、R8G5 的凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)較CK 分別顯著增加79.47%和47.15%，且R9G4 的Pn 也顯著高于R7G5 與R8G4。各復(fù)合菌劑處理的蒸騰速率(transpiration rate，Tr)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance，Gs)略高于CK、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration，Ci)略低于CK，均未達(dá)到顯著差異。

表4 復(fù)合菌劑處理對(duì)山核桃光合指標(biāo)的影響Table 4 Effects of mixing microbial inoculums treatments on the photosynthetic index of C. cathayensis

2.7 復(fù)合菌劑處理對(duì)可溶性糖、可溶性蛋白及丙二醛含量的影響

由圖5 可知，4 種復(fù)合菌劑處理的可溶性糖含量均顯著高于CK，其中R8G5、R7G5 較CK 顯著增加91.99%與86.30%，且作用效果顯著高于R8G4 與R9G4。4 種復(fù)合菌劑處理的可溶性蛋白含量均高于CK，其中R8G4 較CK 顯著增加311.11%，同時(shí)也顯著高于R8G5 與R9G4。4 種復(fù)合菌劑處理的MDA 含量均顯著低于CK，且R7G5、R8G4 也顯著低于R8G5 與R9G4。

3 討論

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，參與大多數(shù)植物代謝過(guò)程，是限制產(chǎn)量的因素之一[19]。早期報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在楊樹(shù)和美國(guó)山核桃根際引入溶磷菌有利于提高土壤中微生物的活性、菌群多樣性和土壤肥力，進(jìn)而影響植株生長(zhǎng)[20－21]。本試驗(yàn)中，4 組復(fù)合菌劑均促進(jìn)了山核桃根系的生長(zhǎng)發(fā)育，其中R8G5 的山核桃根長(zhǎng)、根表面積、根體積均較CK 顯著增加。這與Hameeda 等[8]和Gulden 等[22]通過(guò)施加溶磷菌促進(jìn)植物根長(zhǎng)等指標(biāo)顯著增加的研究結(jié)果相似。這可能是由于溶磷菌與根際菌群及根系分泌物相互作用，進(jìn)而改變了根際的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了根系的生長(zhǎng)[23]。另外，本研究中復(fù)合菌劑處理組的地徑、株高與CK 無(wú)明顯差異，這可能與試驗(yàn)周期短于木本植物生長(zhǎng)周期有關(guān)。

Samina 等[24]發(fā)現(xiàn)根際溶磷菌可顯著增加植株含磷量和產(chǎn)量；余旋等[20]發(fā)現(xiàn)接種溶磷菌處理的薄殼山核桃均表現(xiàn)出較高的Pn；薛應(yīng)鈺等[25]研究發(fā)現(xiàn)接種溶磷木霉菌可顯著增加番茄的生物量。本研究結(jié)果與之相似，4 組復(fù)合菌劑處理對(duì)山核桃磷素的吸收與儲(chǔ)存能力、Pn 以及總生物量均有提升作用，其中R8G5的3 項(xiàng)指標(biāo)較CK 分別顯著增加了55.23%、47.15%與52.94%。這可能是由于菌劑處理可促進(jìn)根系的生長(zhǎng)，提高山核桃對(duì)于磷素的吸收與儲(chǔ)存，進(jìn)而加快促進(jìn)光合作用，增加山核桃的生物量。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，接種后山核桃幼苗可溶性糖含量顯著增加，可溶性蛋白含量明顯增加，MDA 含量顯著減少。這3 個(gè)指標(biāo)的變化表明復(fù)合菌劑有利于山核桃幼苗生長(zhǎng)，其內(nèi)在原因可能是接種菌劑后改善了植物所處的脅迫環(huán)境，從而減少植物所需能耗，進(jìn)而引起體內(nèi)可溶性糖和蛋白等含量上升，使得MDA 含量隨之下降，進(jìn)而提高植物的適生性[26－27]，但復(fù)合菌劑－磷素－土壤－山核桃植株四者間的轉(zhuǎn)化機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

有研究報(bào)道，溶磷菌能夠通過(guò)NH4＋同化作用釋放質(zhì)子或通過(guò)呼吸作用釋放CO2，進(jìn)而降低土壤pH 值，促進(jìn)了難溶性磷酸鹽溶解[28]，或者通過(guò)增加植物根系吸收磷的面積、增加磷酸酶的活性，促進(jìn)植株對(duì)磷的吸收[29]。而溶磷菌與固氮菌互作更能提升溶磷菌釋放磷的效果。從本研究前期菌種培養(yǎng)的溶磷效果分析可知，復(fù)合菌劑總體優(yōu)于單菌，這可能與不同功能菌之間的互惠生態(tài)關(guān)系有關(guān)。這與李玫等[11]研究發(fā)現(xiàn)與單一菌接種相比，在紅海欖上接種復(fù)合菌劑，更能有效地促進(jìn)植株的生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)狀況相似。而馮瑞章等[30]研究也表明固氮菌與溶磷菌互作會(huì)影響土壤中有機(jī)酸含量和pH 值的變化，進(jìn)而促進(jìn)植株各項(xiàng)指標(biāo)。這與本研究發(fā)現(xiàn)溶磷菌通過(guò)與固氮菌的相互作用，能夠促進(jìn)溶磷功效，進(jìn)而提升山核桃的生理活性相似。

本研究中，不同復(fù)合菌劑對(duì)山核桃的促生作用也有所差異，其中R8G5 對(duì)山核桃幼苗的根系發(fā)育、總生物量和可溶性糖含量的提升效果最佳，而R9G4 對(duì)Pn和植株全磷含量的提升效果更好。促生效果各有不同，可能是由于功能菌對(duì)植物的作用各有特點(diǎn)，也可能與不同菌株組合在植物根系定殖能力的差異以及特定根系菌群互作有關(guān)。可見(jiàn)，不同菌種之間的互作及其定殖能力是菌肥施用不可忽視的重要條件。

4 結(jié)論

本研究從山核桃林區(qū)根際土壤中分離、純化并鑒定出3 株溶磷細(xì)菌(果膠桿菌R7、伯克霍爾德氏菌R8和腸桿菌R9)和4 株固氮菌(解聚糖類(lèi)芽孢桿菌G2，葡萄球菌G3，假單胞菌G4 和芽孢桿菌G5)，分別組成4 種復(fù)合菌劑，不同復(fù)合菌劑均促進(jìn)了山核桃根系的生長(zhǎng)發(fā)育，提高了山核桃對(duì)磷素的吸收與儲(chǔ)存，并促進(jìn)了其葉片的光合作用，從而增加了山核桃的生物量。其中復(fù)合菌劑R8G5(伯克霍爾德氏菌與芽孢桿菌組合)對(duì)山核桃幼苗總體的促生效果最佳，能顯著增加根長(zhǎng)、Pn、可溶性蛋白含量、總生物量等多項(xiàng)指標(biāo)，并且能增強(qiáng)山核桃植株的抗逆性。但復(fù)合菌劑如何誘導(dǎo)植物根系發(fā)育和促進(jìn)磷素吸收的內(nèi)在機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。