紅花S－腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆與表達(dá)分析

譚政委 李 磊 余永亮 許蘭杰 楊紅旗 董 薇馬新明 梁慧珍

(1河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心，河南 鄭州 450002；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與管理科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

S－腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthetase，SAMS，EC:2.5.1.6)是植物代謝過程中的一個關(guān)鍵酶，它能催化ATP 和甲硫氨酸反應(yīng)生成S－腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine，SAM)[1]。SAM是主要的甲基供體以及乙烯、多胺、生物素生物合成的前體[2－4]。另外，SAM 還具有轉(zhuǎn)氨丙基[5]、轉(zhuǎn)硫[6]的作用。乙烯、多胺在植物體內(nèi)參與了多種生物和非生物脅迫響應(yīng)過程[7－8]。研究表明，高鹽[9]、干旱[10－11]、高溫[12]、低溫[13]等多種非生物脅迫都能誘導(dǎo)SAMS基因表達(dá)上調(diào)，并通過過量表達(dá)SAMS提高轉(zhuǎn)基因植物對低溫和干旱的耐受性[14]。

紅花(Carthamus tinctoriusL.)，別名紅藍(lán)花、刺紅花、草紅花，是菊科紅花屬一年生雙子葉草本植物，是集油用、藥用和工業(yè)用于一體的特種經(jīng)濟(jì)作物，在世界各地廣泛栽培，在我國已有2 000 多年的栽培歷史[15]。紅花有很強(qiáng)的耐寒、抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠等不良環(huán)境條件的特性[16]。紅花適應(yīng)性強(qiáng)，種植范圍廣，全世界每年種植紅花約110 萬公頃。我國是紅花種植大國，年種植面積3～4 萬公頃，主要分布在新疆、云南、四川、河南等地[17]。目前已從玉米(Zea maysL.)[18]、擬南芥(Arabidopsis thaliana)[19]、紫花苜蓿(Medicago truncatulasubsp. falcata)[14]、蝴蝶蘭(Phalaenopsis amabilis)[20]等植物中克隆得到了SAMS基因并對其相關(guān)功能進(jìn)行了初步研究，但紅花SAMS基因的克隆、表達(dá)及其在植物逆境脅迫中的作用尚鮮見報道。本研究通過分析NCBI 數(shù)據(jù)庫比對紅花高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術(shù)和實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 技術(shù)在紅花中克隆SAMS基因的cDNA 全長，命名為CtSAMS1，對其序列進(jìn)行生物學(xué)信息分析，通過qRT-PCR 技術(shù)分析其在不同組織、不同發(fā)育時期的表達(dá)差異，并研究其在鹽、干旱、低溫脅迫和外源茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)、水楊酸(salicylic acid，SA)、脫落酸(abscisic acid，ABA)和赤霉素(Gibberellin 3，GA3)處理下的表達(dá)情況，探究CtSAMS1 在逆境脅迫和激素處理下的響應(yīng)機(jī)制，以期為深入研究CtSAMS1 的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

豫紅花1 號品種(由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究所選育)種植于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地大田中，自然條件下長至開花期，選取5～10 株在開花第1 天的頂果球紅花花冠連同分枝一起剪下，放入1/2 濃度的Hoagland 標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)液中，移至光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為26±1℃、16 h/8 h(光照/黑暗)，培養(yǎng)24 h 后，分別經(jīng)NaCl(200 mmol·L－1)、 低溫(4℃)、聚乙二醇6000(polythylene glycol 6000，PEG 6000)(20%)3 種非生物脅迫及MeJA(100 μmol·L－1)、SA(150 μmol·L－1)、ABA(150 μmol·L－1)和GA3(150 μmol·L－1)4 種外源激素處理，每個處理3 次重復(fù)，處理0、3、6、12、24 h 后采集紅花花瓣，并立即置入液氮中保存，轉(zhuǎn)移至－80℃超低溫冰箱中保存，用于總RNA 提取。

選取大田中自然生長狀態(tài)一致的豫紅花1 號頂果球，在花冠從總苞片中露出的第1(S1 期)、第3(S2 期)、第5(S3 期)、第7 天(S4 期)取樣，為減小試驗(yàn)誤差，將采集不同植株的不帶子房的花冠均勻混合，每個時間點(diǎn)取3 個重復(fù)，將采集的紅花花冠立即置入液氮中保存，轉(zhuǎn)移至－80℃超低溫冰箱中保存，用于總RNA 提取。

1.2 紅花CtSAMS1 基因全長的克隆

按照北京華越洋生物公司的Quick RNA Isolation Kit 試劑盒說明書提取盛花期紅花花冠的總RNA，采用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(大連寶生物工程有限公司)反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，用DNAMAN 軟件設(shè)計引物(表1)，進(jìn)行CtSAMS1 基因核心片段克隆，PCR 擴(kuò)增體系為20 μL，含10×buffer 2 μL，上下游引物(10 μmol·L－1)各1 μL，dNTP(2 mmol·L－1)2 μL，cDNA 模板1 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，ddH2O 12.8 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)? 95℃變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72℃終延伸10 min?；厥漳康钠?，連接到pMD19-T 載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計3′端、 5′ 端引物(表1)，按美國 Clontech 公 司SMARTTM RACE Amplification Kit 說明書，擴(kuò)增得到3′端、5′端目的片段，將目的片段回收并連入pMD19-T載體 上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，進(jìn)行測序。通過DNAMAN 軟件拼接出CtSAMS1 基因全長序列，根據(jù)全長序列設(shè)計引物(表1)，進(jìn)行CtSAMS1 基因全長克隆，通過測序鑒定全長序列是否與拼接結(jié)果一致。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.3 紅花CtSAMS1 生物信息學(xué)分析

CtSAMS1 蛋白的氨基酸組成、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)及穩(wěn)定性等參數(shù)分析通過在線軟件ProtParam tool 完成；通過ExPASy 中的SOPMA 工具對CtSAMS1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；采用SWISS-MODEL 在線軟件預(yù)測CtSAMS1 蛋白的三級結(jié)構(gòu)；通過TMHMM Server v2.0 對CtSAMS1 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；CtSAMS1蛋白保守區(qū)預(yù)測采用NCBI 的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(conserved domain database，CDD)完成；以CtSAMS1 蛋白序列為模板，通過NCBI 數(shù)據(jù)庫Blast P 查找CtSAMS1的同源氨基酸列，找出其他物種中CtSAMS1 蛋白的同源序列，利用DNAMAN 對CtSAMS1 蛋白與其他物種的SAMS1 同源蛋白的同源性進(jìn)行分析；通過MEGA 7.0 軟件中的鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建CtSAMS1 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹，并通過Bootstrap 方法對進(jìn)化樹進(jìn)行檢測，Bootstrap 值設(shè)置為1 000。

1.4 紅花CtSAMS1 基因在不同組織和不同脅迫時間的表達(dá)分析

按照北京華越洋生物公司的Quick RNA Isolation Kit 試劑盒說明書提取不同非生物脅迫和不同激素處理的樣品的總RNA，按照天根生物科技北京有限公司的Fast Quant RT Super Mix 說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，根據(jù)CtSAMS1 基因全長序列設(shè)計qRT-PCR 引物，以Ct60s作為內(nèi)參基因，引物序列如表1 所示，用天根生物科技北京有限公司的Super Real Pre Mix(SYBR Green)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增體系20 μL:2×SuperReal Pre Mix 10 μL、上游引物(10 μmol·L－1)0.5 μL、下游引物(10 μmol·L－1)0.5 μL、cDNA 模板5 μL、ddH2O 3 μL。qRT-PCR 反應(yīng)程序:95℃變性20 s、55℃退火20 s、72℃延伸20 s，擴(kuò)增45 個循環(huán)，于熒光定量PCR 儀(德國Eppendorf Mastercycler ep Realplex 2.2 Detection System)上進(jìn)行。相對定量分析采用2－ΔΔCt方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花CtSAMS1 基因全長cDNA 的克隆

以擬南芥SAMS2(GenBank 登錄號:NP_001078345)氨基酸序列為參考序列，通過BLAST 與NCBI 中的紅花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對，擴(kuò)增獲得紅花CtSAMS的核心片段(圖1-A)，根據(jù)核心片段序列設(shè)計特異引物，進(jìn)行3′-RACE 和5′-RACE 擴(kuò)增(圖1-B)，測序結(jié)果表明，3′-RACE 和5′-RACE 擴(kuò)增片段均勻核心片段序列有重疊區(qū)域，將擴(kuò)增片段通過DNAMAN 軟件進(jìn)行組裝，通過NCBI 中的ORF Finder 模塊對CtSAMS的開放閱讀框進(jìn)行預(yù)測，然后根據(jù)開放閱讀框序列設(shè)計全長引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1-D 所示，擴(kuò)增序列的全長為1 173 bp，編碼390 個氨基酸，測序結(jié)果與拼接結(jié)果一致，將該基因命名為CtSAMS1。

2.2 CtSAMS1 的生物學(xué)信息分析

2.2.1 CtSAMS1 理化性質(zhì)分析、亞細(xì)胞定位、跨膜區(qū)域預(yù)測 通過ExPASy 中的ProtParam tool 對CtSAMS1基因編碼蛋白的理化性狀進(jìn)行預(yù)測。CtSAMS1 編碼的蛋白相對分子質(zhì)量為42 677.42，理論等電點(diǎn)為5.64，分子式為C1884H2975N517O581S16，其中該蛋白中甘氨酸含量最高，為9.0%，色氨酸含量最低，為0.8%，不穩(wěn)定系數(shù)為21.99，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)81.72，總平均親水 性(grand average of hydropathiaty，GRAVY) 為－0.300，為親水性蛋白； 利用SignalP5.0 預(yù) 測CtSAMS1 無信號肽，利用TMHMM 2.0 預(yù)測紅花CtSAMS1 的跨膜區(qū)域，預(yù)測結(jié)果表明CtSAMS1 沒有跨膜區(qū)域。

2.2.2 CtSAMS1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過ExPASY 中的SOPMA 工具預(yù)測CtSAMS1 基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示CtSAMS1 蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲(random coil)組成，共有172個，占比為44.1%，其次為α－螺旋(α-helices)，共有130個，占比為33.33%，有延伸鏈(extended strand)58 個，占比為14.87%，有β－折疊(β-turn)30 個，占比為7.69%。推測無規(guī)則卷曲是其最大量的二級結(jié)構(gòu)元件，而α－螺旋、延伸鏈和β－折疊散布于整個蛋白中(圖2-A)。

將紅花 CtSAMS1 的氨基酸序列通過SWISSMODEL Workspace 在線分析軟件建立了CtSAMS1 的三維結(jié)構(gòu)模型(圖2-B)，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，CtSAMS1 與擬南芥的S－腺苷甲硫氨酸合成酶1(PDB code: 6vcx)序列一致性為89.92%。

2.2.3 CtSAMS1 氨基酸序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 利用NCBI 的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫(conserved domain database，CDD) 對 CtSAMS1進(jìn)行保守區(qū)預(yù)測，CtSAMS1 具有甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的保守結(jié)構(gòu)域，屬于S－腺苷甲硫氨酸合成酶家族，利用Prosite 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測，該蛋白含有3 個SAMS 蛋白的特征序列 GHPDK、 GAGDQGHMFGY 和GGGAFSGKD(圖3)。

多重序列分析表明，紅花CtSAMS1 氨基酸序列與擬 南 芥(Arabidopsis thaliana)、 苜蓿(Medicagotruncatula)、蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum)和玉米(Zea maysL.)中SAMS 氨基酸序列相似性分別為88.04%、94.62%、98.72%和87.59%，說明CtSAMS1的氨基酸序列與其他植物中氨基酸序列之間具有較高的同源性(圖3)。為進(jìn)一步分析CtSAMS1 基因與其他植物SAMS基因的進(jìn)化關(guān)系，通過NCBI 搜索到其他植物的21 條SAMS 蛋白序列，利用MEGA7.0 構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CtSAMS1 與來自菊科的洋薊(Cynara cardunculusvar. scolymus)、 黃花蒿(Artemisia annua)、 萵苣(Lactuca sativa)、 除蟲菊(Tanacetum cinerariifolium)的SAMS 親緣關(guān)系最近，與其他科中的SAMS 親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

2.3 CtSAMS1 基因組織表達(dá)特性分析

為了對CtSAMS1 基因的表達(dá)特性性進(jìn)行研究，通過qRT-PCR 對紅花不同組織中的基因表達(dá)進(jìn)行定量分析，提取了紅花根、莖、葉、花(盛花期)、苞片的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過qRT-PCR 檢測其表達(dá)情況，結(jié)果表明，CtSAMS1 基因在花中表達(dá)量最高，其次是莖，在根、葉、苞片中表達(dá)量極低，說明CtSAMS1 基因表達(dá)具有組織特異性(圖5)。通過qRT-PCR 對不同發(fā)育時期紅花花冠中CtSAMS1 基因表達(dá)量進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，CtSAMS1 基因表達(dá)量隨著紅花花瓣的衰老而增加(圖5)，說明CtSAMS1 基因可能參與紅花花瓣的衰老過程。

2.4 CtSAMS1 基因在不同非生物脅迫和激素誘導(dǎo)下的表達(dá)分析

2.4.1CtSAMS1 基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)分析 通過qRT-PCR 對不同非生物脅迫處理的紅花花冠基因表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明鹽、干旱和低溫(4℃)處理都能誘導(dǎo)CtSAMS1 基因的表達(dá)。經(jīng)鹽脅迫處理后，CtSAMS1 基因表達(dá)在12 h 達(dá)到高峰，而20%PEG6000 誘導(dǎo)產(chǎn)生的干旱脅迫條件下，CtSAMS1 基因的表達(dá)在6 h 即達(dá)到高峰，4℃低溫處理后，CtSAMS1基因在3 h 表達(dá)量最大，隨后降低，在24 h 又出現(xiàn)上升趨勢(圖6)。

2.4.2CtSAMS1 基因在不同激素誘導(dǎo)下的表達(dá)分析 為了研究CtSAMS1 基因表達(dá)是否受到激素的調(diào)控，對離體培養(yǎng)紅花花冠進(jìn)行MeJA、SA、ABA、GA3 處理，通過qRT-PCR 對其表達(dá)變化進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，MeJA、SA 和ABA 對CtSAMS1 基因的表達(dá)都具有誘導(dǎo)作用。MeJA 處理后，隨著時間推移基因表達(dá)量逐漸升高；SA 處理后6 h，基因表達(dá)量達(dá)到最高峰，隨后表達(dá)量迅速下降；ABA 處理后3 hCtSAMS1 基因表達(dá)量達(dá)到高峰，隨著時間的推移，其表達(dá)水平一直維持在較高水平，而GA3 處理對CtSAMS1 基因的表達(dá)有一定的抑制作用，但抑制效果不明顯(圖7)。

3 討論

SAMS 是S－腺苷甲硫氨酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，催化反應(yīng)的產(chǎn)物S－腺苷甲硫氨酸是生物合成乙烯和多胺的前體，而乙烯和多胺參與植物生長發(fā)育、生物和非生物脅迫等多個生理過程。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)SAMS 也參與多種生物和非生物脅迫[7－8]。

植物中的SAMS 由一個多基因家族編碼，同一植物基因組中往往有多個拷貝，它們的表達(dá)方式有所不同，從而在植物生長發(fā)育的不同階段或不同生理狀態(tài)下發(fā)揮作用。所以對紅花中CtSAMS在不同非生物脅迫和激素處理下的表達(dá)分析，有利于研究CtSAMS基因在紅花抗逆境脅迫中的作用。本研究利用RACE、qRT-PCR 技術(shù)在紅花中克隆得到1 條CtSAMS基因全長，對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，三維結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明紅花中CtSAMS與擬南芥SAMS 的三維結(jié)構(gòu)相似[21]，多重序列分析發(fā)現(xiàn)，CtSAMS與其他物種具有較高的同源性，并且具有3 個SAMS 的特征序列，進(jìn)化序列分析結(jié)果表明CtSAMS與菊科SAMS 蛋白的相似性較高。

研究發(fā)現(xiàn)不同植物的SAMS具有不同的表達(dá)模式，如擬南芥基因組中有4 個SAMS基因，其中AtSAMS1 和AtSAMS2 在根和莖中表達(dá)量最高[22]，豌豆中PsSAMS1 和PsSAMS2 在不同發(fā)育時期表達(dá)量不同[23－24]；玉米基因組中共有4 個SAMS 基因，它們在不同組織部位和不同脅迫條件下的表達(dá)模式有很大差異性[25]；本研究表明，紅花中的CtSAMS1 基因表達(dá)具有組織特異性，在花中表達(dá)量最高，其次是莖，在根、葉、苞片中表達(dá)量極低。大量研究表明乙烯信號途徑在植物器官衰老和成熟中發(fā)揮重要作用，其中，SAMS作為乙烯合成途徑的關(guān)鍵酶，通過調(diào)節(jié)乙烯合成量參與植物的生長發(fā)育過程。本研究對表達(dá)量較高的紅花花瓣不同發(fā)育時期CtSAMS1 基因表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明隨著紅花花瓣的衰老CtSAMS1 基因的表達(dá)量增加，推測CtSAMS1 基因參與紅花花瓣衰老生理過程。

植物在生長過程中會受到干旱、鹽、低溫等多種非生物脅迫，這些非生物脅迫會引起植物代謝途徑及信號途徑相關(guān)基因的表達(dá)變化[26－28]。目前，大量研究發(fā)現(xiàn)，SAMS基因受多種逆境脅迫因子的誘導(dǎo)，如蝴蝶蘭MtSAMS基因受到低溫脅迫處理后表達(dá)量明顯上升[20]，Guo 等[14]研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿葉片的MfSAMS1能被低溫、ABA、H2O2和一氧化氮(NO)誘導(dǎo)，并且過量表達(dá)MfSAMS1 基因能夠顯著提高紫花苜蓿的抗冷能力；長春花中的3 個SAMS基因表達(dá)也都受到鹽脅迫處理的誘導(dǎo)[25]。本研究結(jié)果表明鹽、干旱和低溫等非生物脅迫均能促進(jìn)CtSAMS1 基因的表達(dá)，說明CtSAMS1 基因參與紅花的非生物脅迫防御反應(yīng)。

大量研究發(fā)現(xiàn)，SAMS基因的表達(dá)還受多種激素的調(diào)控[29－31]，如ABA 處理番茄后，番茄SlSAMS1 和SAMS3 基因表達(dá)量明顯升高[19]；ABA 對鹽地堿蓬的SgSAMS2 基因表達(dá)也具有顯著的誘導(dǎo)作用[32]；MeJA、SA、ABA、GA3 處理白木香(Aquilaria sinensis)愈傷組織后，白木香AsSAMS1 的基因表達(dá)明顯升高[7]，本研究表明CtSAMS1 基因也受MeJA、SA 和ABA 誘導(dǎo)，GA3 對CtSAMS1 基因表達(dá)有一定的抑制作用，說明不同激素CtSAMS1 基因受多種激素交叉調(diào)控。對CtSAMS基因非生物脅迫和激素處理下的表達(dá)分析，為進(jìn)一步研究紅花S－腺苷甲硫氨酸生物合成及調(diào)控分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時有利于豐富植物的防御反應(yīng)研究。

4 結(jié)論

本研究克隆了紅花CtSAMS1 基因的全長cDNA 序列，其ORF 序列長1 173 bp，編碼390 個氨基酸，具有甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶的保守結(jié)構(gòu)域(PLN02243)，屬于S－腺苷甲硫氨酸合成酶家族，對該基因的表達(dá)特性進(jìn)行分析表明，CtSAMS1 基因表達(dá)具有組織特異性，主要在花和莖中表達(dá)，在其他組織部位中表達(dá)量較低，并且隨著花衰老其表達(dá)量呈上升趨勢；鹽、干旱和低溫非生物脅迫處理能誘導(dǎo)CtSAMS1 基因表達(dá)，MeJA、SA 和ABA 處理也能夠誘導(dǎo)CtSAMS1 基因表達(dá)，GA3 對CtSAMS1 基因具有一定抑制作用。本研究為后續(xù)深入研究CtSAMS1 基因功能奠定了基礎(chǔ)。